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Immobilisierte Penicillinacylase und Verfahren
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zu ihrer Herstellung Die Erfindung betrifft immobilisierte Penicillinacylase
in Form eines in Wasser unlöslichen Präparats mit Penicillinacylaseaktivität, das
als Katalysator zur Umwandlung von Penicillinen, vorzugsweise Benzylpenicillin,
in 6-Aminopenicillansäure (im folgenden kurz als 6-APS bezeichnet) geeignet ist,
sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Das Präparat besteht aus einem Enzym (Penicillinacylase)
das durch polyfunktionelle Aldehyde mit Zellen von Prokaryonten- oder Eukaryonten-Mikroorganismen
und/oder deren Aggregaten oder Fragmenten verknüpft ist. 6-APS dient als Rohstoff
zur Herstellung von halbsynthetischen Penicillinen und wird durch Hydrolyse von
natürlichen Penicillinen, vor allem Benzylpenicillin erzeugt, die entweder enzymatisch
mit Penicillinacylase oder rein chemisch katalysiert werden kann. Es ist möglich,
die enzymatische Katalyse mit löslicher oder immobilisierter Penicillinacylase und
nativen, chemisch stabilisierten oder immobilisierten enzymatisch aktiven Zellen
vorzunehmen. Immpbilisierte Enzyme oder Zellen
ermöglichen eine
vielseitige Anwendung der entsprechenden Katalysatoren und die Erzielung höherer
Ausbeute und einer höheren Qualität der erhaltenen 6-hPS.
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In den letzten zehn Jahren wurden etwa 30 Verfahren zur Immobilisierung
von Penicillinacylase angegeben, die im wesentlichen auf einer physikalischen (Einschließung
in einem makromolekularen Netzwerk, Mikroeinkapselung, Adsorption) oder chemischen
Bindung (kovalente oder Ionenbindung zwischen Enzym und Träger, Vernetzung des Enzyms
ohne Verwendung eines Trägers) beruhen.
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Zur ersten Gruppe gehört ein Verfahren zur Immobilisierung von Penicillinacylase
z.B. durch physikalische Einschließung des Enzyms in Triacetatfasern von Cellulose
oder Nitrocellulose, das in der FR-PS 2 222 383 und der I-PS 836 462 beschrieben
ist. Ein chemisches Verfahren zur Immobilisierung dieses Enzyms an verschiedenen
unlöslichen Kunststoffen ist z. B. in der CS-PS 145 849, den DE-OSen 1 917 057,
2 157 970, 2 157 972 und 2 355 078, den GB-PSen 1 193 918, 1 357 317 und 1 400 468
und an in Wasser unlöslichen Polymeren z. B. in den DE-OSen 2 312 824 und 2 535
951 beschrieben. Die Einschließung von Penicillinacylase im Netzwerk eines anorganischen
Polymeren und die nachfolgende kovalente Vernetzung des Enzyms ist ferner z. B.
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in der SU-PS 530 885 angegeben.
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Die meisten bisherigen Verfahren betreffen die Immobilisierung der
Penicillinacylase auf verschiedenen natürlichen oder synthetischen organischen Polymeren
oder organischen Trägern und machen dabei in den meisten Fällen von chemisch sehr
ähnlichen oder gleichen Immobilisierungsmethoden Gebrauch. Hierbei sowie auch der
Weiterverarbeitung liegt das Ziel zugrunde, die Herstellung von 6-APS und dadurch
auch von halbsynthetischen Penicillinen und Gephalosporinen
wirtschaftlicher
zu machen, wobei die Ausnutzung des immobilisierten Präparats von Penicillinacylase
vor allem durch den Preis und die Zugänglichkeit des Trägers, die Einfachheit der
Immobilisierungstechnik, die mechanische Stabilität des Präparats, die gebundene
spezifische Aktivität (Wirksamkeit) und nicht zuletzt auch durch die Stabilität
der gebundenen Enzymaktivität bei langer, wiederholter Anwendung limitiert ist,
da nur eine etwa zweihundertfach wied-erholte Anwendung des immobilisierten Enzyms
im Vergleich z. B. mit einer einmaligen Verwendung nativer Zellen mit Penicillinacylaseaktivität
zur Herstellung von 6-APS eine höhere Effektivität erbringt und die Kosten der Isolierung
des Enzyms und des Trägers sowie der Immobilisierung deckt.
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Demgegenüber wurde ferner auch ein vom bisherigen Stand der Technik
abweichender neuer Weg zur Herstellung von 6-APS bzw. zur Durchführung einiger zugrundeliegender
Maßnahmen unter Verwendung chemisch immobilisierter Mutantenzellen mit hohem Gehalt
an Penicillinacylase beschritten; es handelt sich hierbei um ein halbkontinuierliches
Verfahren zur Herstellung von 6-APS (vgl. den CS-Erfinderschein .(PV 3679-77», um
ein Verfahren zur Immobilisierung derartiger Zellen auf der Oberfläche einiger synthetischer
Polymerer (vgl. den OS-Erfinderschein ... (PV 2318-77)) sowie um ein Verfahren zur
Herstellung von 6-APS mit Hilfe miteinander verbundener Produktionszellen oder von
Produktionszellen in Verbindung mit anderen Zellen verschiedener Organismen, die
den Charakter eines unlöslichen Trägers besitzen, d. h. um die Bildung mikrobieller
Aggregate, die chemisch vernetztes gut sedimentierende integrale Einheiten mit hohem
Gehalt an gebundener Enzymaktivität darstellen (vgl. den CS-Erfinderschein ... (PV
5321-77)).
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Neben den oben angeführten CS-Erfinderscheinen existieren
im
Zusammenhang mit der Erfindung auch einige die Immobilisierung von Enzymen auf Zelloberflächen
betreffende Publikationen, insbesondere die Arbeit von Hough & Lyons, Nature
235 (1972) 389, in der die Bindung des Enzyms Amyloglucosidase auf der Oberfläche
von Brauereihefen mit TiCl3 oder TiCl4 beschrieben ist. Die Autoren führen ferner
an, daß als Bindungsagentien Eisen- und Zinnsalze verwendet werden können. Neben
Amyloglucosidase ist in der oben genannten Publikation ferner die Immobilisierung
von bakterieller a-Amylase sowie von Trypsin auf der Oberfläche von Zellen von Bacillus
subtilis und Escherichia coli beschrieben.
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Die Immobilisierung von Amyloglucosidase auf der Oberfläche von Hefen
ermöglicht eine direkte Ausnutzung von Dextrinen für Gärprozesse, was bei der Herstellung
von Bier, Whisky, Äthanol, Essig usw. von Bedeutung ist.
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Von Takasaki (Agr. Biol. Chem. 38 (1974) 1061) ist die kovalente
Bindung von p-Amylase, Invertase, Trypsin und Katalase auf der Oberfläche von mikrobiellen
Zellen, insbesondere von Streptomyces Sp., Aspergillus niger und Aspergillus oryzae,
mit Toluoldiisocyanat beschrieben.
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Von Pace et al. (Isolubilized Enzymes, Edit. M. Salmona, C. Saronia
und S. Garattini, Rayen Press, New York, Seiten 157 - 164,1974) ist ferner die kovalente
Bindung von Glucoseoxidase auf der Oberfläche von intakten menschlichen Erythrozyten
mit mehrfunktionellen ReagentieEi"eCyanurchlorid, Bisdiazobenzidin, Glutardialdehyd
und Teil4 im Hinblick auf die Anwendung dieses immobilisierten Enzyms in der Humanmedizin
bei einigen Stoffwechselerkrankungen und pathologischen Zuständen beschrieben.
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Von Brown (Methods in Enzymology 44 (1976) 263) sind ferner einige
Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen durch chemische Aggregation mit bi- oder
höherfunktionellen Agentien angegeben worden. Schlechte mechanische Eigenschaften
stellen
jedoch einen gemeinsamen Nachteil derartiger Materialien dar.
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Ein ähnliches Verfahren zur Immobilisierung einer Reihe von Enzymen
einschließlich Penicillinacylase ist ferner in der FR-PS 2 195 953 angegeben, nach
der zur Verfestigung der Präparate inerte Stoffe wie beispielsweise Infusorienerde,
expandierter Perlit, faser- und pulverförmige Cellulosen, Holzspäne, Haare, Sand
sowie synthetische Materialien auf der Basis von Polyamiden, Polyestern, Polyurethanen,
Polypropylen, Celluloseacetat und/oder Siliconen herangezogen werden. Nach der FR-PS
2 195 954 kann die mechanische wie auch enzymatische Stabilität auf diese Weise
immobilisierter Enzyme durch Zugabe von nichtproteinhaltige Bindemitte wie Polyaminen
und Alginaten verbessert werden.
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Der Erfindung liegt die überraschende Feststellung zugrunde, daß
zur Immobilisierung von Penicillinacylase ganze intakte, nicht beschädigte native
und/oder physikalisch, chemisch oder biochemisch behandelte Zellen von Mikroorganismen,
deren natürlich oder künstlich erzeugte Aggregate und unlösliche Fragmente bzw.
auch deren Mischungen verwendet werden können.
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Das Material der Zelloberflächen enthält zahlreiche Gruppen, die
mit polyfunktionellen Reagentien wie zB Glutardialdehyd reagieren können und über
die sowohl Enzyme auf den Zellen gebunden als auch die Zellen miteinander verbunden
werden können.
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Das Polysaccharidgerüst selbst, das den Zellwänden Festigkeit und
Elastizität verleiht und entweder bereits als solches oder nach einer entsprechenden
Behandlung, beispielsweise nach Deacetylierung, mit Glutardialdehyd reagierende
Aminogruppen
enthält, kann darüber hinaus leicht fUr die Bindung
von Eiweißstoffen beispielsweise durch Einwirkung von Oxidationsmitteln wie Natriumperjodat
aktiviert werden, wodurch sich die Zahl der reaktiven Stellen erhöhen läßt.
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Mit polyfunktionellen Agentien kann deshalb Penicillinacylase auf
Oberflächen ganzer intakter, nativer und/oder physikalisch; chemisch oder biochemisch
behandelter Zellen von Prokaryonten und Eukaryonten oder deren unlöslichen Fragmenten
immobilisiert werden. Diese Substanzen können auch zur Verfestigung der Struktur
von durch polyfunktionelle Agentien kovalent vernetzter Penicillinacylase, beispielsweise
durch Glutardialdehyd, herangezogen werden.
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Die Strukturverfestigung des vernetzten Enzyms wird sowohl bei Verwendung
mikrobieller Pellets oder auch künstlich hergestellter Aggregate erzielt, wenn die
Zellen in Form relativ fester poröser Strukturen vorliegen, als auch dann, wenn
sich diese Strukturen gleichzeitig mit der Aggregation der Eiweißstoffe bilden.
Im letzteren Falle ist es besonders bevorzugt, die Zellen in faserbildender Form
zu verwenden.
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In allen derartigen Fällen besteht dann das Material aus zwei porösen
Strukturen, die untereinander kovalent gebunden sind. Einzelne Zellen oder deren
unlösliche Fragmente können jedoch zur Verfestigung der Struktur kovalent vernetzter
Penicillinacylase auch dann verwendet werden, wenn sie keine unabhängige Phase bilden.
Das resultierende Material ist fest und in Wasser unlöslich, besitzt gute Sedimentationseigenschaften,
hohe gebundene Enzymaktivität sowie gute Stabilität der Enzymaktivität.
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Die Größe der immobilisierten Teilchen, ihre Sedimentationseigenschaften
sowie der Grad der gebundenen Enzymaktivität
können durch das
Massenverhältnis zwischen Träger und Penicillinacylase sowie durch entsprechende
Auswahl seiner Qualität, des betreffenden Mikroorganismenstamms sowie der Behandlungsweise,
ferner durch die Reaktionstemperatur, den pH-Wert des Reaktionsgemischs sowie das
angewandte Vernetzungsverfahren mit dem polyfunktionellen Aldehyd einschließlich
Stehenlassen, Rühren mit verschiedener Intensität, durch Tiekühlverfahren und nachfolgendes
langsames Auftauen, Trocknen oder auch durch Kombination dieser Verfahrensweisen
beeinflußt und eingestellt werden. Bezüglich der mechanischen Festigkeit und Elastizität
sind isolierte Zellwände oder deren Fragmente von einigen Bakterien, insbesondere
Zellwände von grampositiven, große Mengen Murein enthaltenden Bakterien, von Bedeutung;
Fragmente derartiger Zellwände dienen als Bindemittel und treten in die Reaktion
mit ein.
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Die Erfindung betrifft immobilisierte Penicillinacylase, die sich
zur Umwandlung von Penicillinen, insbesondere Benzylpenicillin, in 6-Aminopenicillansäure
eignet; die erfindungsgemäß immobilisierte Penicillinacylase ist dadurch gekennzeichnet,
daß sie aus Penicillinacylase sowie aus Zellen oder Zellfragmenten von Prokaryonten
oder Eukaryonten besteht, die untereinander mit polyfunktionellen Aldehyden, vorzugsweise
Glutardialdehyd, chemisch aneinander gebunden sind.
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Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer
derart immobilisierten Penicillinacylase, bei dem das lösliche Enzym Penicillinacylase,
das gegebenenfalls noch andere, im Verlauf der Isolierung begleitende Eiweißstoffe
enthält, eingesetzt wird. Es ist ferner möglich, bei der Herstellung der erfindungsgemäßen
immobilisierten Penicillinacylase so vorzugehen, daß zur Reaktion mit dem Enzym
und dem polyfunktionellen Aldehyd unlösliche
Fragmente oder ganze
Zellwände von Mikroorganismen, vorzugsweise grampositiven Bakterien, herangezogen
werden.
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Erfindungsgemäß kann bei der Herstellung der immobilisierten Penicillinacylase
auch so vorgegangen werden, daß zur Reaktion mit dem Enzym und dem polyfunktionellen
Aldehyd Fragmente oder teilweise künstlich lysierte oder autolysierte Zellen von
Penicillinacylase produzierenden Mikroorganismen verwendet werden.
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Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der immobilisierten
Penicillinacylase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Reaktion mit dem Enzym
und dem polyfunktionellen Aldehyd Abfallzellen, Abfallzellmasse oder daraus hergestellte
oder selbstentstandene Fragmente herangezogen werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der immobilisierten
Penicillinacylase, die sich zur Penicillinspaltung eignet, ist ferner dadurch gekennzeichnet,
daß der polyfunktionelle Aldehyd in einer Menge von 0,1 bis 10 % (G/V) verwendet
wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren hat neben bedeutenden wirtschaftlichen
Vorteilen die Vorzüge, daß der Preis des Trägers und Bindemittels praktisch unerheblich
ist, das Immobilisierungsverfahren, ohne vorhergehende chemische Aktivierung, sehr
einfach ist, nur eine minimale Anzahl von Verfahrensstufen zur Darstellung des immobilisierten
Präparats erforderlich ist sowie, daß es erfindungsgemäß möglich ist, immobilisierte
Penicillinacylase-Präparate mit hoher spezifischer Aktivität herzustellen.
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Ein weiterer Vorteil beruht auf der Möglichkeit, die
Penicillinacylase
auf enzymatisch aktiven Trägenzu immobilisieren, dh auf entsprechende Enzyme produzierenden
Mutantenzellen zu binden; einen weiteren Vorteil stellt die Möglichkeit dar, technisch
hergestellte Präparate von Penicillinacylase zu verwenden, ohne daß es hierzu nötig
ist, das Enzym durch kostspielige, aufwendige und verlustreiche Verfahren zu reinigen.
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Vorteilhaft ist ferner die Möblichkeit einer wiederholten Verwendbarkeit
über lange Zeiten bei verhältnismäßig breit wählbarer Verfahrensweise für die enzymatische
Hydrolyse bzw. den heranzuziehenden Reaktortyp.
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Die erfindungsgemäß erhaltenen immobilisierten Präparate besitzen
gute Sedimentations- und mechanische Eigenschaften, Elastizität und Festigkeit sowie
gute Stabilität der Enzymaktivität. Weitere Vorteile beruhen auf der Möglichkeit,
relativ hohe Penicillinkonzentrationen enzymatisch bis zu sehr hohen Umsätzen von
über 90 % hydrolysieren zu können. ferner auf der Mözlichkeit. Isolationsverfahren
zur Gewinnung von 6-APS aus hohe Erträge ermöglichenden Gemischen oder Reaktionsgemischen
anwenden zu können, auf der guten Löslichkeit von 6-APS und deren hoher Qualität
und auf dem geringen Gehalt an eiweißhaltigen Begleitstoffen sowie infolgedessen
auf der Möglichkeit, hypoallergene halbsynthetische Penicilline darzustellen.
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Im Vergleich mit der herkömmlichen Verfahrensweise, die auf der Immobilisierung
ganzer Zellen auf einem Träger beruht, der selbst cellulärer Herkunft ist, (vgl.
den CS-Erfinderschein ..(PV5321-77» ist das erfindungsgemäße Verfahren erheblich
einfacher und erfordert keine Anwendung von Flokkulierungsmitteln oder organischen
Lösungsmitteln und bedarf auch keiner weiteren Endbehandlung hinsichtlich der zu
erzielenden Präparateigenschaften.
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Erfindungsgemäß werden die vorteilhaften chemischen Eigenschaften
des technischen Enzyms selbst ausgenützt, das prinzipiell sowohl polyfunktionelles
Agens als auch Wirkstoff ist. Das erfindungsgemäße Verfahren führt ferner zu höherer
gebundener Aktivität und liefert entsprechend Präparate von absolut höherer spezifischer
Enzymaktivität.
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Für die Herstellung der technischen Penicillinacylase sowie als Träger
zur Herstellung von immobilisierten verfestigten Präparaten von Penicillinacylase
wurde erfindungsgemäß eine hyperproduzierende Mutante von Escherichia coli 2843
herangezogen; der Stamm wurde durch genetische Manipulation nach dem Verfahren gemäß
dem CS-Erfinderschein 162 274 gewonnen (vgl. auch den CS-Erfinderschein. .(PV 851-77)).Die
technische Penicillinacylase aus dem obigen Stamm wurde in herkömm licher Weise
hergestellt, dh durch mechanische Desintegration der eingedickten Zellsuspension,
Ansäuern, Abtrennung des Zelldetrits, fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat,
Dialyse und Gefriertrocknung. Auf diese Weise wurden zwei technische Präparate von
Penicillinacylase in festem (lyophilisiertem) Zustand gewonnen. Das Präparat (1)
besaß eine spezifische Aktivität von 300 E/mg Eiweiß, das Präparat (2) eine Aktivität
von 544 E/mg Eiweiß.
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Die Aktivität der Penicillinacylase wurde spektrophotometrisch durch
Farbreaktion von p-Dimethylaminobenzaldehyd mit 6-APS nach der CS-PS 116 959 gemäß
der Modifizierung von Balasingham et al., Biochim. Biophys. Acta 276 (1972) 250,bei
42 OC und einem pH-Wert von 7,6 im Bereich der Reaktionskinetik nullter Ordnung
bestimmt. Unter der Einheit der enzymatischen Aktivität wird hierbei diejenige Enzymmenge
verstanden, die die Bildung von /umol6-APS aus Benzylpenicillin bzw. deren-Salzen
pro Stunde katalysiert.
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Die spezifische Aktivität des freien, nativen Enzyms wird als umol
6-APS/h.mg Eiweiß angegeben.
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Die Konzentration der Eiweißstoffe wurde spektrophotometrisch nach
Lowry et al., J. Biol. Chem. 193 (1951) 265,ermittelt.
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Die spezifische Aktivität der immobilisierten Penicillinacylase wird
in /umol 6-APS/h-mg feuchte, gut abgesaugte Masse des in Wasser unlöslichen Präparats
angegeben.
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Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert, deren Angaben nicht einschränkend sind.
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Beispiel 1 Eine penicillinacylasehaltige Zellpaste von E. coli wurde
zu einer Konzentration von 1400 mg der feuchten Masse/ml in Wasser suspendiert;
diese Suspension wurde in einem mechanischen Desintegrator (Manton-Gaulin) durch
vierfachen Umlauf bei einem Druck von 340 kp/cm² und Raumtemperatur zerkleinert;
das Homogenisat wurde zentrifugiert (5000 G, 1 h).
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10 g der feuchten Fragmentmasse von E. coli im Gemisch mit 20 g einer
feuchten Masse von unbeschädigten Zellen E. coli desselben Stamms, die Penicillinacylase
enthielten, wurden zu einem resultierenden Volumen von 200 ml in Wasser suspendiert.
Der pH-Wert der Suspension wurde mit 25 %iger NaOH-Lösung auf 7,5 eingestellt; anschließend
wurde die Suspension nach Vermischen mit 16 ml 25 %iger Glutardialdehydlösung in
einen 500-ml-Siedekolben eingebracht und
in eine Rotations-Schüttelmaschine
eingesetzt. Die Reaktion wurde unter Rühren (240 U/min) 3 h bei 26 OC durchgeführt.
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Im Anschluß daran wurde das Reaktionsgemisch mit 100 ml Wasser verdünnt
und zentrifugiert (500 G, 5 min), worauf das Sedimert mit 250 ml Wasser gewaschen
und nochmals zentrifuglert wurde (5000 G, 15 min).
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Zu 10 g auf diese Weise gewonnener feuchter Masse von mikrobiellen
Aggregaten mit einer spezifischen Aktivität von 3,6 E/mg der feuchten Präparatmasse
wurde 1 g technische lyophilisierte Penicillinacylase mit einer spezifischen Aktivität
von 544 E/mg Eiweißstoffe zugegeben. Das Gemisch wurde mit 0,05 M Phosphatpuffer
von pH 7,6 (nach Sörensen) auf 100 ml aufgefüllt und mit einem Labor-Stahlpropellerrührer
10 min lang homogenisiert. Nach einem mäßigen Abfall des pH-Werts auf 7,2 wurde
der pH der Suspension mit 25 %iger NaOH-Lösung wieder auf 7,6 eingestellt; anschließend
wurden 4 ml einer 25 %igen Glutardialdehydlösung zugegeben und kurz und schnell
verrührt, worauf das Reaktionsgemisch in einen 500-ml-Siedekolben übergeführt und
in eine Rotadons-Schüttelmaschine eingesetzt wurde.
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Die Reaktion wurde 3 h lang bei 26 OC unter Rühren (240 U/min) durchgeführt.
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Danach wurde das Reautionsgemisch durch ein Silongewebe von 75x75
/um Maschenweite filtriert; die gewonnenen Aggregate wurden auf dem Gewebe dreimal
mit je 100 ml destilliertem Wasser gewaschen und auf einem grobporösen Filterpapier
abgesaugt, wodurch eine griffige, feuchte Paste erhalten wurde.
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Auf diese Weise wurde ein auf enzymatisch aktiven mikrobiellen Zellaggregaten
immobilisiertes Penicillinacylasepräparat in einer Menge von 20,8 g erhalten, das
eine spezifische Aktivität von 17,62 E/mg der feuchten
Masse besaß;
die Ausbeute betrug 63,0 , bezogen auf die anfängliche Gesamt-Enzymaktivität.
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B e i 5 p i e l 2 Etwa 1000 g Abfallzellmaterial von Saccharomyces
carlsbergensis aus der Herstellung von Phenylacetylcarbinol wurden in 10 1 Wasser
suspendiert und nach 15 min langem Rühren zentrifugiert, wonach 600 g einer feuchten
Masse von gewaschenen Abfallhefen gewonnen wurden.
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Aus 25,0 g dieser feuchten Masse und 70 g einer Penicillinacylase
enthaltenden Zellpaste von E. coli wurden 500 ml einer homogenen Suspension in 0,05
M Phosphatpuffer von pH 7,6 (nach Sörensen) hergestellt; der pH-Wert der homogenen
Suspension wurde nach mäßigem Absinken mit 25 %iger NaOH-Lösung auf 7,6 eingestellt.
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Zu der homogenen Suspension wurden unter Rühren 20 mg einer 25 %igen
Glutardialdehydlösung zugesetzt. Die Reaktion wurde unter mäßigem Rühren mit einem
Laborrührer 5 h lang bei 25 °C durchgeführt. Danach wurde die Reaktionsmischung
mit 5 1 Wasser verdünnt und zentrifugiert (5000 G, 5 min), worauf das Sediment mit
2,5 1 Wasser gewaschen und erneut abzentrifugiert wurde (5000 G, 15 min).
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Zu 10 g der feuchten Masse der auf diese Weise gewonnen mikrobiellen
Aggregate mit einer spezifischen Aktivität von 3,214 E/mg feuchte Präparatmasse
wurde 1 g technische, gefriergetrocknete Penicillinacylase mit einer spezifischen
Aktivität von 51414 E/mg Eiweißstoffe zugegeben.
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Das Gemisch wurde mit 0,05 M Phosphatpuffer von pH 7,6 (nach Sörensen)
aufgefüllt und homogenisiert, worauf wie in Beispiel 1 verfahren wurde, auf diese
Weise wurde
ein Präparat von auf enzymatisch aktiven mikrobiellen
Aggregaten immobilisierter Penicillinacylase in einer Menge von 15,5 g erhalten;
das Präparat besaß eine spezifische Aktivität von 13,12 E/mg der feuchten Masse;
die Ausbeute betrug 34,9 %, bezogen auf die anfängliche Enzymaktivität.
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Beispiel 3 Etwa 100 g Abfallzellmaterial von Aspergillus oryzae aus
der Herstellung von OC-Amylase wurden auf einem Sieb von 0,5 mm Maschenweite gründlich
mit Wasser gewaschen; das auf dem Sieb zurückgebliebene kugelförmige Mycel (Pellets)
wurde in Aceton verrührt, abfiltriert und an freier Luft getrocknet.
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Die trockenen Pellets in einer Menge von 1 g wurden in 50 ml einer
Lösung von technischer Penicillinacylase einer Konzentration von 2,5 mg/ml in 0,05
M Phosphatpuffer (pH 6,5) nach Sörensen (spezifische Aktivität 544 E/mg Eiweißstoffe)
quellen gelassen. Nach 30 min wurden 2 ml einer 25 eigen Glutardialdehydlösung unter
ständigem Rühren zugesetzt; die Reaktion wurde bei fortgesetztem Rühren mit einem
Laborrührer bei Raumtemperatur 3 h lang durchgeführt. Anschließend wurde der Gefäßinhalt
durch das oben genannte Sieb filtriert und dreimal mit je 100 ml destilliertem Wasser
gewaschen, worauf die Pellets in 100 ml 2 N NaCl-Lösung suspendiert wurden.
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Nach 18 h Stehenlassen bei +8 OC wurde das Material mit dem gleichen
Sieb getrennt, dreimal mit je 100 ml destilliertem Wasser gewaschen und durch Vakuumfiltration
von überschüssigem Wasser befreit.
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Das auf diese Weise gewonnene immobilisierte Enzym besaß eine spezifische
Aktivität von 8,25 E/mg der feuchten Masse und enthielt 60 % der Ausgangs-Enzymaktivität.
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Beispiel 4 Durch submerse Kultur des asporogenen Stamms Bacillus
megatherium CCM 2037 in einem 150-1-Fermenter bei 40 bis 48 OC in Anwesenheit hoher
Konzentrationen an Aminosäuren (in Form von Maisextrakten) gemäß dem Verfahren von
Chaloupka et al. (Biotechn. and Bioeng. Symp. Nr. 4 (1974) 985 - 993) sowie unter
Zugabe von Chloramphenicol in einer Menge von 50 1ug/ml am Ende der exponentiellen
Wachstumsphase wurden etwa 3000 g Zellmasse gewonnen. Auf diese Weise wurden sehr
lange Fasern des angeführten Stamms mit hohem Gehalt an Murein (Peptidoglycan) in
der Zellwand erzielt.
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Die auf diese Weise erhaltene native Zellmasse von B. megatherium
wurde in zwei Teile zu je 1500 g feuchter Masse aufgeteilt. Der erste Teil der nativen
Zellmasse wurde in 500 ml Wasser suspendiert, unter Rühren auf 64 OC erwärmt und
mit 3000 ml 10 %iger (G/V), auf 62 OC vorgewärmter Trichloressigsäure versetzt.
Das Gemisch wurde danach unter Rühren auf 80 OC erwärmt und 20 min auf dieser Temperatur
gehalten.Danach wurde das Gemisch auf 30 OC abgekühlt und zentrifugiert, worauf
die Zellmasse mit 20 1 Wasser gewaschen wurde.
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Auf diese Weise wurden 800 g einer feuchten Zellmasse von mit Trichloressigsäure
behandelten Fasern von B. megatherium gewonnen; die Fasergröße lag im Bereich von
20 bis 30 /um.
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Der native und der mit Trichloressigsäure behandelte
Teil
der Zellmasse von B. megatherium wurden mit Wasser auf eine Konzentration von 30
g feuchter Masse/100 ml verdünnt, wonach die Zellen durch sechsfachen Umlauf in
einem mechanischen Desintegrator (Manton-Gaulin) bei einem Druck von 500 kp/cm²
und Raumtemperatur zerkleinert wurden. Die Fragmente der Zellwände wurden durch
30 min langes Zentrifugieren bei 20000 G abgetrennt und danach fünfmal mit destilliertem
Wasser gewaschen.
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Die Fragmente der mit Trichloressigsäure behandelten Zellen wurden
in Wasser verrührt, worauf der pH-Wert mit 20 %iger NaOH-Lösung auf 11,0 eingestellt
und die Suspension 20 h lang bei 25 OC gerührt wurde; anschließend wurde erneut
zentrifugiert, worauf die Fragmente der Zellwände mehrmals mit Wasser gewaschen
wurden.
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Technische Penicillinacylase (spezifische Aktivität 544 E/mg Eiweißstoffe)
wurde in 0,05 M Phosphatpuffer von pH 7,6 (nach Sörensen) zu einer resultierenden
Konzentration von 40 mg/ml gelöst; in 25 ml dieser Lösung wurden jeweils 1 g der
feuchten Masse der nativen bzw. ganzen behandelten Zellen von B. megatherium oder
nativen oder behandelten Fragmenten von Zellwänden dieses Stamms wie folgt suspendiert:
(A) Fragmente der nativen Zellen, (B) Fragmente der mit Trichloressigsäure und NaOH
behandelten Zellen, (C) ganze native Zellen und (D) ganze, mit Trichloressigsäure
behandelte Zellen.
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Unter ständigem Rühren wurde jede Suspension mit 1 ml 25 %iger Glutardialdehydlösung
versetzt; die Reaktion wurde 30 min bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren sowie
30 min unter denselben Bedingungen ohne Rühren durchgeführt. Nach 60 min Reaktionsdauer
wurden die entstandenen Aggregate mit
einem Sieb von 75 /um Maschenweite
abgetrennt, dreimal mit je 100 ml destilliertem Wasser gewaschen und durch Vakuumfiltration
von überschüssigem Wasser befreit.
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Die spezifische Aktivität sowie die Ausbeuten an immobilisiertem
Enzym sind in der nachstehenden Tabelle angegeben, wobei als Vergleichspräparate
nur aus Enzymlösung hergestellte Aggregate dienten.
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Immobilisiertes Spez. Aktivität Ausbeute Präparat (E/mg feuchte (%)
Masse) Kontrollpräparat 19,5 45,4 A 17,1 44,7 B 18,0 45 C 15,6 113,8 D 20,1 48,6
D 20,1 118,6 2 g von jedem Material wurden in 500-ml-Siedekolben eingebracht, in
100 ml 0,05 M Phosphatpuffer(nach Sörensen) von pH 7,6 suspendiert und in eine Rotations-Schüttelmaschine
(240 U/min, Exzenter 6,5 cm, Temperatur 29 0C) eingebracht. Nach 8 Tagen (192 h)
und 22 Tagen (528 h) wurden die immobilisierten Präparate mit dem oben angegebenen
Sieb sowie durch Filtration abgetrennt, wonach ihre Enzymaktivität ermittelt wurde;
im Anschluß daran wurde nochmals gewaschen und in dem gleichen Volumen des gleichen
Puffers resuspendiert und wieder in die Rotations-Schüttelmaschine eingesetzt.
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Die Veränderungen der enzymatischen Aktivität der oben immobilisierten
Penicillinacylase dersangegebenen Präparate
im Langzeittest zur
Ermittlung der Stabilität gehen aus der nachstehenden Tabelle hervor: Immobilisiertes
Zeit Enzymaktivität (%) nach Präparat (h) 192 h 528 h Präparat (h) 192 h 528 h Kontrollpräparat
100 73,1 39 A 100 79,2 58,3 B 100 83,5 70,3 C 100 93,5 74,8 D 100 91,6 96,4 D 100
91,6 96,11 Beispiel 5 In 100 ml 0,05 M Phosphatpuffer nach Sörensen von pH 7,6 wurden
4 g einer feuchten Masse von ganzen Zellen von B. megatherium suspendiert, die nach
Beispiel 4 mit Trichloressigsäure behandelt worden waren.
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In dieser Suspension wurden 3 g technische Penicillinacylase mit
einer spezifischen Aktivität von 300 E/mg Eiweißstoffe gelöst. Unter ständigem Rühren
mit einem Laborrührer wurden 4 ml einer 25 zeigen Glutardialdehydlösung z wqru!
nach 30 min langem Rühren entstandenen zugesetzt,/die weit Aggregate 30 min stehen
gelassen wurden. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach 60 min
wurden die Pellets durch Filtration mit einem Sieb von 75 Maschenweite abgetrennt,
dreimal mit je 400 ml destilliertem Wasser gewaschen, in 100 ml auf -15 OC abgekühltem
Aceton verrührt, nach 5 min langem Rühren auf einer G 1-Fritte scharf abgesaugt
und schließlich durch Hindurchsaugen von Luft getrocknet.
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Die Aktivität des auf diese Weise erhaltenen unlöslichen
Materials
entsprach 18 E/mg der feuchten Masse; die Ausbeute an Aktivität betrug 22 %.
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Das Kontrollmaterial wurde auf dieselbe Weise hergestellt, dh aus
der Lösung desselben Enzyms (gekoppelte Eiweißstoffe ohne Ptidoglycan). Die enzymatische
Aktivität des Kontrollmaterials betrug 30 E/mg der feuchten Masse bei einer Ausbeute
von 27 %.
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2 g des unlöslichen Materials wurden für eine wiederholte enzymatische
Hydrolyse einer 7 %igen (G/V) wäßrigen Lösung des Natriumsalzes von Benzylpenicillin
in einem Volumen von 80 ml bei 37 °C unter Aufrechterhaltung des pH-Werts (pH-Regler
bzw. pH-Stat) durch Dosieren von Ammoniakwasser im Bereich von pH 7,6 bis 7,8 verwendet.
Die Reaktionsdauer betrug 90 min.
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Die wiederholten Umwandlungen von Benzylpenicillin in 6-APS mit der
immobilisierten Penicillinacylase auf Peptidoglycanpellets sowie der Vergleich mit
dem Kontrollmaterial (vernetzte Eiweißstoffe) unter den oben angegebenen Bedingungen
gehen aus der nachstehenden Tabelle hervor: Umwandlung Kontrollmaterial (%) Pellets
(%) 1 95,0 91,0 1 95,0 91,0 2 88,5 94,4 3 84,8 91,1 4 81,6 94,8 5 - 91,9 6 - 91,5
7 - 92,3
Die Erfindung betrifft zusammengefaßt immobilisierte Penicillinacylase,
bei der das Enzym auf nativen und/oder physikalisch, chemisch oder biochemisch vorbehandelten
Zellen penicillinacylasefreier oder penicillinacylasehaltiger Mikroorganismen oder
auf deren unlöslichen Zellfragmenten chemisch gebunden ist; die Präparate lassen
sich durch Umsetzung von Penicillinacylaselösungen mit der entsprechenden Zellkomponente
und einem mindestens bifunktionellen Aldehyd, vorzugsweise Glutardialdehyd, in einfacher
und wirtschaftlicher Weise herstellen; aufgrund der hoch stabilen Enzymaktivität
sowie der guten mechanischen und Sedimentationseigenschaften sind die erfindungsgemäßen
Präparate zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch enzymatische Spaltung
von Penicillinen, vorzugsweise Benzylpenicillin, besonders günstig geeignet und
ermöglichen eine Anwendung des immobilisierten Spaltagens über eine sehr lange Benutzungsdauer;
die Verwendung der immobilisierten Penicillinacylase führt ferner zu nicht verunreinigten,
unmittelbar weiterverarbeitbaren Lösungen des gewünschten Produkts.