CS208931B1 - Immobilized penicillinacylase for transformation of penicillin in 6-aminopenicillane acid and method of its preparation - Google Patents
Immobilized penicillinacylase for transformation of penicillin in 6-aminopenicillane acid and method of its preparation Download PDFInfo
- Publication number
- CS208931B1 CS208931B1 CS37678A CS37678A CS208931B1 CS 208931 B1 CS208931 B1 CS 208931B1 CS 37678 A CS37678 A CS 37678A CS 37678 A CS37678 A CS 37678A CS 208931 B1 CS208931 B1 CS 208931B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- enzyme
- penicillin acylase
- cells
- fragments
- penicillin
- Prior art date
Links
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 title claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 35
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 title abstract description 15
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 title description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 title 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 claims abstract description 7
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 38
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 abstract description 6
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 abstract description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 38
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 3
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- ZBFFNPODXBJBPW-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-1-phenylpropan-2-one Chemical compound CC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 ZBFFNPODXBJBPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 239000007980 Sørensen’s phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical class [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 1
- XUGUHTGSMPZQIW-UHFFFAOYSA-N [[4-(4-diazonioiminocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)cyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]hydrazinylidene]azanide Chemical compound C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 XUGUHTGSMPZQIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011437 continuous method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000592 inorganic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- -1 polypropylenes Polymers 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920003124 powdered cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000019814 powdered cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 229920005613 synthetic organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N toluene 2,4-diisocyanate Chemical compound CC1=CC=C(N=C=O)C=C1N=C=O DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000015041 whisky Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/16—Enzymes or microbial cells immobilised on or in a biological cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
- C12P37/06—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by desacylation of the substituent in the 6 position
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
(54) Imobilfeovaná penicilmacyláza k přeměně penicilinů na kyselinu 6-aminopenicilánovou a způsob její přípravy
Vynález se týká imobilizované penicilinacylázy ve formě ve vodě nerozpustného preparátu s penialinacylázovou aktivitou, který slouží jako katalyzátor při přeměně penicilinů, zejména benzylpeniciliiiu na kyselinu 6-aminopenicilánovou (dále jen 6-ÁpK) a způsobu jeho pnpravy. preparát je tvořen enzymem penicilinacylázou svázaným prostřednictvím polyfunkčních aldehydů s buňkami prokaryontních nebo eukaryontních organismů anebo jejich agregáty nebo fragmenty. 6-APK je surovina pro výrobu polosyntetických penicilinů a připravuje se hydrolýzou přirozených penicilinů, zejména benzylpenicilinu, kterou lze katalyzovat buď enzymem penicilinacylázou nebo čistě chemicky. Enzymovou katalýzu lze provádět rozpustnou · nebo imobilizovanou penicilinacylázou a nativními, chemicky stabilizovanými, nebo mobilizovanými enzymově aktivními buňkami. Práce s mobilizovanými enzymy nebo buňkami umožňuje mnohonásobné použití katalyzátorů a dosažení vyšších výtěžků a vyšší kvality 6-APK.
V posledních 10-ti letech bylo přihlášeno k patentové ochraně zhruba 30 postupů mobilizace penicilinacylázy, které lze v podstatě rozdělit na fyzikální (uzavření v síti polymeru, mikroenkapsu- lace, adsorpce) a chemické (kovalentní nebo iontová vazba , mezi enzymem a nosičem, zesítění enzymu bez použití nosiče).
Do první skupiny patří postup mobilizace penicilinacylázy, např. fyzikálním uzavřením enzymu do vláken triacetátu celulózy nebo nitrocelulózy, který je popsán ve francouzském patentovém spisu č. 2.222.383 a italském patentovém spisu č. 836.462. Chemický způsob mobilizace tohoto enzymu na nejrůznější nerozpustné umělé materiály je popsán např. v čs. patentovém spisu č. 145.849, NSR spisech DOS 1.917.057, DOS 2.157.970, DOS 2.157.972, DOS 2.355.078, britských patentových spisech GB 1.193.918, GB 1.357.317, GB 1.400.468, na ve vodě rozpustné polymery např. v NSR patentových spisech DOS 2.312.824 a DOS 2.535.951. Zachycení penicilinacylázy v síti anorganického polymeru a následné kovalentní zesítění enzymu je popsáno např. v SSSR patentovém spisu č. 530.885.
Většina patentovaných postupů kryje způsob mobilizace penicilinacylázy na nejrůznějších přirozených nebo syntetických organických polymerech nebo anorganických nosičích a využívá přitom z hlediska chemického, často velmi podobných
08 931 nebo^tejnýchunetod imobilizace. Snahou, resp. cílem uvedených a dalších postupů je neustále i ekonomizovat výrobu 6-APK a tím i potósyfitetických penicilinů a cefalosporinů, přičemž využití imobilizovaného preparátu penicilinacylázy je limitováno především cenou a dostupností nosiče, jednoduchostí techniky imobilizace, mechanickou stabilitou preparátu, zachycenou specifickou aktivitou (účinností) a v neposlední řadě i stabilitou zachycené enzymové aktivity, při dlouhodobém í opakovaném použití, neboť jen přibližně 200-násobně opakované použití imobilizovaného enzymu ; ve srovnání např. s jednorázovým použitím nativních buněk s penicilinacylázovou aktivitou pro výrobu 6-APK, přináší vyšší efektivnost a kryje náklady na izolaci enzymu, cenu nosiče a technolo- i ί gii imobilizace.
Čs. farmaceutická firma SPOFA ve spolupráci i s ČSAV volila specifickou cestu a vyvinula některé i původní postupy ve vztahu к výrobě 6-APK I .a předmětnému vynálezu, avšak použitím chemicI ky imobilizovaných mutantních buněk s vysokým obsahem penicilinacylázy. Jedná se o semikontinuální způsob výroby 6-APK podle čs. autorského osvědčení č. 201621, dále o způsob imobilizace těchto buněk na povrch některých syntetických polymerů podle čs. autorského osvědčení č. 200802 a konečně o způsob výroby 6-APK pomocí kovalentně vázaných produkčních buněk navzájem nebo těchto buněk vázaných na jiné buňky růžnýťh organismů majících charakter nerozpustného nosiče, tj. tvorbu mikrobiálních agregátů tvořících chemicky zesítěné, dobře sedimentující, integrální jednotky s vysokým obsahem zachycené enzymové aktivity, podle čs. autorského osvědčení č. 197101
Ve vztahu к předmětnému vynálezu, kromě citovaných čs. vynálezů, existuje rovněž několik literárních údajů týkajících sé imobilizace enzymů na buněčné povrchy. Je to především práce Hougha a Lyonse [Nátuře 235, 389 (1972)] popisující vazbu enzymu amyloglukosidázy na povrch pivovarských kvasinek prostřednictvím TiCl3 nebo TiCl4. Autoři rovněž uvádějí, že jako , vazných činidel lze použít solí železa a cínu. Kromě amyloglukosidázy byla těmito autory popsána imobilizace bakteriální alfa-amylázy a trypsinu na povrchy buněk BaCillus subtilis a Escherichia coli. Imobilizace amyloglukosidázy na povrch kvasinek umožňuje přímé využití dextrinů pro kvasné procesy, což má význam při výrobě piva, whisky, ethanolu, octa apod. Takasaki [Agr. Biol. Chem. 38, 1061 (1974)] popsal kovatentňí vazbu betaamylázy, invertázy, trypsinu a katalázy na povrch mikróbiáňftCh buněk, zejména Streptomyces sp., Aspergillus niger a oryzae, pomočí toluendiisokyanátu. Konečně Pacé a sp. (v Insolubilized Enzymes, > edit. M. Salmona, C. Saronia a S. Garattini, Raven ’ Press, New York, pp. 157—164, 1974) popisují kovalentní vazbu glukosooxidázy na povrch intakt- i nich lidských erythrocytů pomocí vícefunkčních činidel (kyanurchlórid, bis-diazobenzidin, glutar dialdehyd, TiCb4) ve vztahu к využití tohoto imobilizovaného enzymu v humánní medicíně, při některých metabolických defektech a pathologických stavech. Broun [v Methods in Enzymology 44,263 (1976)] popisuje několik technik imobilizace enzymů jejich chemickou agregací bi- nebo polyfunkčními činidly. Společným nedostatkem těchto materiálů jsou však jejich špatné mechanické vlastnosti.
Podobný postup pro imobilizaci řady enzymů včetně penicilitTáeylázy je použit ve francouzském patentovém spisu č. 2.195.953, podle nějž lze к vyztužení preparátů použít inertní materiály vybrané ze skupiny látek zahrnující infusoriové hlinky, expandovaný perlit, vláknité a práškovité celulosy, dřevěné piliny, plsť, chlupy, písek a syntetické materiály na bázi polyamidů, polyesterů, polyurethanu, polypropylenů, acetátů celulosy anebo silikonů: Podle francouzského patentového spisu č. 2.195.954 lze mechanickou i enzymovou stabilitu takto imobilizovaných enzymů zlepšit přidáním nebílkovinných pojidel a to polyaminů aalginátu.
Zjistili jsme nyní, že pro imobilizaci penicilinacylázy lze použít celých neporušených nativních anebo fyzikálně, chemicky nebo biochemicky ošetřených buněk mikroorganismů, jejich přirozených nebo uměle vytvořených agregátů, nerozpustných fragmentů, popřípadě jejich směsí.
Materiál buněčných povrchů obsahuje řadu skupin schopných reakce s polyfunkčními činidly, např. glutardialdehydem, jejichž prostřednictvím lze dosáhnout jak vazby enzymu na buňky, tak i vazby buněk navzájem. Navíc samotnou polysacharidovou kostru, která uděluje buněčným stěnám pevnost a pružnost a která obsahuje aminoskupiny reagující buď přímo nebo po ošetření, např. deacetylaci, s glutardialdehydem, lze snadno aktivovat pro vazbu bílkovin např. působením oxidačních činidel jako je jodistan sodný a tím zvýšit počet reaktivních míst.
Prostřednictvím polyfunkčních činidel lze proto imobilizovat penicilinacylázu na povrchy celých neporušených nativních anebo fyzikálně, chemicky nebo biochemicky ošetřených buněk prokaryontí nich nebo eukaryóntních organismů či jejich ne| rozpustných fragmentů. Těchto materiálů lze rov·*! něž použít ke zpevnění struktury penicilinacylázy kovalentně zesítěné polyfunkčními činidly, např. glutardialdehydem. Zpevnění struktury zesítěného enzymu je dosaženo jak tehdy, jsou-li použity buňky ve formě relativně pevňých porézních struktur jako v případě mikrobiálních pelet, nebo uměle připravených agregátů, tak i tehdy, dochází-li к tvorbě těchto struktur současně s agregací bflkóviň. V posledním případě je zvláště výhodné použití buněk vláknitého tvaru. Ve všech přípa, dech je pak materiál tvořen dvěma porézními i strukturami, které jsou navzájem kovalentně spojeny. Jednotlivé buňky nebo jejich nerozpustné fragmenty však lze použít ke zpevnění struktury kovalentně zesítěné.peničiluiacylázy i tehdy, ne tvoří-li samostatnou kontinuální fázi. Výslednýmateriál je pevný, ve ' vodě nerozpustný, s dobrými sedimentačními vlastnostmi, vysokým stupněm zachycené enzymové aktivity a dobrou stabilitou této aktivity.
Velikost imobilizovaných částic, jejich sedimentační vlastnosti a stupeň zachycené enzymové aktivity jsou řízeny hmotnostním poměrem nosiče (též jeho kvalitou resp. mikrobiálním druhemkmenem a způsobem ošetření) a penicilinacylázy, reakční teplotou, hodnotou pH reakční směsi a použitou technikou zesítění polyfunkčním aldehydem zahrnujícím stání, míchání o různé intenzitě, mražení a následné pomalé rozmrazování, sušení nebo kombinací těchto technik. Z hlediska mechanické pevnosti a pružnosti je významná přítomnost izolovaných buněčných · stěn nebo jejich fragmentů z některých bakterií, zvláště buněčných stěn grampositivních bakterií obsahujících · vysoké množství muerinu; fragmenty těchto buněčných stěn fungují jako pojivo a vstupují do reakce.
Předmětem · vynálezu je imobilizovaná penicilinacyláza k přeměně penicilinů, zejména benzylpenicilinu na kyselinu 6-aminopenicilánovou, vyznačená tím, že sestává z enzymu penicilinacylázy a buněk nebo buněčných fragmentů prokaryontních nebo eukaryontních organismů vázaných navzájem chemicky prostřednictvím polyfunkčních aldehydů, s výhodou glutardialdehydu.
.....Při’ ’ výrobě imobilizované penicilinacylázy podle vynálezu se postupuje tak, že enzym penicilinacyláza se nechá reagovat s celými neporušenými nativními anebo fyzikálně, chemicky nebo biochemicky ošetřenými buňkami či nerozpustnými fragmenty buněk · různé morfologie a s polyfunkčním aldehydem, s výhodou glutardialdehydem.
Při výrobě imobilizované penicilinacylázy podle vynálezu se použije rozpustného enzymu penicilinacylázy, který popřípadě obsahuje jiné bílkoviny provázející jej v průběhu izolace. Dále je možné při výrobě imobilizované penicilinacylázy podle vynálezu postupovat tak, že k reakci s enzymem a polyfunkčním aldehydem se použije nerozpustných fragmentů nebo celých buněčných stěn organismů, s výhodou grampositivních bakterií.
Dále při výrobě imobilizované penicilinacylázy podle •vynálezu je · možné postupovat také tak, že k reakci s enzymem a polyfunkčním aldehydem se použije fragmentů nebo částečně uměle či samovolně lyžovaných buněk mikroorganismů produkujících pemcilinacylázu.
Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy imobilizované penicilinacylázy, vyznačený tím, že k reakci s enzymem a polyfunkčím · aldehydem se použije odpadních buněk, odpadní buněčné hmoty nebo fragmentů z nich připravených nebo samovolně vzniklých.
Dále je způsob přípravy imobilizované penicilinacylázy ke štěpení penicilinu podle vynálezu, vyznačený tím, že se použije polyfunkčního aldehydu v · množství 0,1 až 10 % hmotnostních (w/v).
208 931
Postup podle našeho vynálezu má značné ekonomické a další výhody, a to v tom, že cena nosiče a pojivá je prakticky nulová, technika imobilizace je jednoduchá, bez předchozí chemické aktivace, počet technologických · stupňů přípravy mobilizovaného preparátu je minimální, a v možnosti přípravy mobilizovaného preparátu penicilinacylázy s vysokou specifickou aktivitou.
Výhodou je dále to, že je možná imobilizace penicilinacylázy na enzymově aktivní nosiče, tj. vazba na vysokoprodukční mutantní buňky-fortifikované preparáty a že je možné použití technických preparátů penicilinacylázy, přičemž enzym není nutno složitě čistit nákladnými a ztrátovými postupy. Výhodná je také možnost dlouhodobého opakovaného použití v poměrně širokém rozmezí volby technologie enzymové hydrolýzy, resp. typu reaktoru. Připravené imobilizované preparáty mají dobré sedimentační a mechanické vlastnosti, pružnost a pevnost a dobrou stabilitu enzymové aktivity. Dalšími výhodami jsou enzymová hydrolýza do vysokého stupně konverze (více jak 90 %) s možností hydrolýzy poměrně vysokých · koncentrací penicilinu, možnost použití postupů izolace 6-APK z reakční směsi poskytující vysoké výtěžky, dobrá rozpustnost 6-APK a její vysoká kvalita, nízký obsah bílkovinných příměsí a tím možnost přípravy hypoalergenních polosyntetických penicilinů.
Oproti dříve známému postupu spočívajícímu ! v imobilizaci celých buněk na nosič, který je rovněž buněčného původu je tento způsob výrazně jednodušší, nevyžaduje použití flokulačních činidel ani použití organických rozpouštědel či dalších postupů ke konečné úpravě vlastností preparátu. Princip podle našeho vynálezu využívá výhodných chemických vlastností samotného technického enzymu, který je principiálně také polyfunkčním činidlem a současně i aktivní látkou. Navíc tato metoda poskytuje vyšší výtěžky zachycené aktivity a dává preparáty s absolutně vyšší specifickou aktivitou enzymu.
Jako zdroje pro přípravu technické penicilinacylázy i jako nosiče pro přípravu imobilizovaných fortifikovaných preparátů penicilinacylázy podle vynálezu bylo · použito hyperprodukční mutanty Escherichia coli CCM 2843; kmen byl získán genetickou manipulací postupem podle čs. autorského osvědčení č. · 162.274 a je chráněn podle čs. autorského osvědčení č. 188631. Technická penicilinacyláza z uvedeného kmene byla připravena klasickým způsobem, tj. mechanickou desintegrací zahuštěné buněčné suspenze, okyselením, odstředěním buněčného detritu, frakčním srážením síranem amonným, dialýzou a lyofilisací. Naznačeným způsobem byly získány dva technické preparáty penicilinacylázy v pevném (lyofilizovaném) stavu. Preparát (1) měl specifickou aktivitu 300 j/mg, preparát (2) 544 j/mg bílkovin.
Aktivita penicilinacylázy byla hodnocena spektrofotometricky barevnou reakcí p-dimethylaminobenzaldehydu s 6-APK podle čs. patentu č.
116959 v modifikaci podle Balasinghama a sp.
208 931 [Biochim. Biophys. Acta 276, 250 (1972)] ' při 42 °C a hodnotě pH 7,6 v oblasti reakční kinetiky nultého řádu. Jednotka enzymové aktivity je takové množství enzymu, které katalyzuje vznik jednoho umolu 6-APK z benzylpenicilinu, resp. jeho solí za hodinu. Specifická aktivita volného (nativního) enzymu je vyjádřena jako pmol 6-APK/h/mg bílkovin. Koncentrace bílkovin byla hodnocena spektrofotometricky podle Lowryho a sp. [J, Biol. Chem. 193,265 (1951)]. Specifická aktivita mobilizované penicilinacylázy je vyjádřena jako pniol
6-APK/h/mg vlhké (dobře odsáté) hmoty ve vodě nerozpustného preparátu.
V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.
Příklad 1
Buněčná pasta E. coli obsahující penicilinacylázu byla suspendována ve vodě na koncentraci 400 mg vlhké hmoty/ml a tato suspenze byla desintegrována čtyřnásobnou recyklací na mechanickém desintegrátoru Manton-Gaulin při tlaku 33,3 MPa při laboratorní teplotě. Homogenát byl odstředěn (5000 G/1 h). 10 g vlhké hmoty fragmentů E. coli bylo ve směsi s 20 g vlhké hmoty neporušených buněk E. coli téhož kmene obsahujících penicilinacylázu suspendováno ve vodě na výsledný objem 200 ml. Hodnota pH suspenze byla upravena 25% ním roztokem NaOH na 7,5 a' suspenze byla po smíšení s 16 ml 25%ního roztoku ' glutardialdehydu vpravena do 500 ml varné baňky a umístěna na rotační třepací stroj. Reakce probíhala za míchání (240 t/min) 3 hodiny při teplotě 26 °C. Potom byla reakční směs zředěna 100 ml vody a odstředěna (500 G, 5 min.), sediment promyt 250 ml a znovu odstředěn (5000 G, 15 min). K 10 g vlhké hmoty popsaným způsobem získaných mikrobiálních agregátů o jejich specifické aktivitě 3,6 j/mg vlhké hmoty preparátu byl přidán 1 g technické lyofilizované penicilinacylázy o specifické aktivitě 544 j/mg bílkovin. , Směs byla doplněna do 100 ml 0,05 M fosfátovým pufrem o pH 7,6 (podle Sórensena) a homogenizována ocelovým laboratorním vrtulovým míchadlem 10 min. Po mírném poklesu pH na hodnotu 7,2 bylo pH suspenze upraveno 25% ním roztokem NaOH opět na hodnotu 7,6, přidáno 4 ml 25%ního roztoku glutardialdehydu, krátce a rychle zamícháno a reakční směs byla přelita do 500 ml varné baňky a umístěna na rotační třepací ' stroj. Reakce probíhala 3 hodiny při teplotě 26 °C za míchání (240 ot/min). Po této době byla reakční směs zfiltiována přes silonovou tkaninu o velikosti ok 75 x 75 μηι a získané ' agregáty byly 3krát na tkanině promyty 100 ml destilované vody a odsáty na širokoporézním filtračním papíře do formy tuhé vlhké pasty.
Takto byl získán preparát enzymu penicilinacylázy imobilizované na enzymově aktivní mikrobiální buněčné agregáty v množství 20,8 g o specifické aktivitě 17,62 j/mg vlhké hmoty při výtěžku z celkové počáteční enzymové aktivity 63,0 %.
Příklad 2 Přibližně 1000 g odpadního buněčného materiálu Saccharomyces carlsbergensis po výrobě fenylacetylkarbinolu bylo suspendováno v 101 vody a po 15 minutách míchání byl materiál odstředěn; bylo' ' získáno 600 g vlhké hmoty promytých odpadních kvasinek.
Z 25,0 g této vlhké pasty ' a 70 g vlhké pasty buněk E. coli obsahujících penicilinacylázu bylo připraveno 500 ml homogenní suspenze v 0,05 M fosfátovém pufru pH 7,6 (podle Sórensena); pH homogenní suspenze bylo po nepatrném poklesu upraveno 25%ním roztokem NaOH na hodnotu 7,6. K míchané ' homogenní suspenzi bylo přidáno 20 ml 25%ního roztoku glutardialdehydu. Reakce probíhala za mírného míchání laboratorním míchadlem 5 hodin při teplotě 25 °C. Potom byla reakční směs zředěna 5 1 vody a odstředěna (500 G, 5 min), sediment promyt 2,51 vody a znovu odstředěn (5000 G, 15 min).
K 10 g vlhké hmoty popsaným způsobem získaných mikrobiálních agregátů o jejich specifické aktivitě 3,24 j/mg vlhké hmoty preparátu byl přidán 1 g technické lyofilizované penicilinacylázy o specifické aktivitě 544 j/mg bílkovin. Směs byla doplněna do 100 ml 0,05 M fosfátovým pufrem o pH 7,6 (dle Sórensena) a homogenizována. Dále bylo postupováno jak je uvedeno v příkladu 1; ΐ takto byl získán preparát enzymu penicilinacylázy i imobilizované na enzymově aktivní mikrobiální buněčné agregáty v množství 15,5 g o specifické aktivitě 13,12 j/mg vlhké hmoty při výtěžku z počáteční enzymové aktivity 34,9 %.
Příklad 3 i Přibližně 100 g odpadního buněčného materiálu ' Aspergillus oryzae po výrobě alfa-amylázy bylo důkladně promyto vodou na sítu, s velikostí ok 0,5 mm a sítem zadržené kuličkové mycelium (pelety) bylo rozmícháno v acetonu, odfiltrováno a usušeno volně na vzduchu.
Suché pelety v množství 1 g byly ponechány bobtnat v 50 ml roztoku technické penicilinacylázy o koncentraci 2,5 mg/ml v 0,05 M fosfátovém pufru o pH 6,5 podle Sórensena (specifická aktivita 544 j/mg bílkovin). Po 30ti minutách byly za stálého míchání přidány 2 ml 25%ního roztoku glutardialdehydu; reakce probíhala za nepřetržitého míchání laboratorním míchadlem při laboratorní teplotě 3 hodiny. Potom byl obsah nádoby zfiltrován přes výše uvedené síto, promyt třikrát 100 ml destilované vody a pelety suspendovány ve 100 ml 2 N NaCl. Po 18 hodinách stání při +8 °C . byl materiál oddělen pomocí stejného síta, promyt třikrát 100 ml destilované vody a zbaven nadbytečné vody vakuovou filtrací.
Takto získaný , , imobilizovaný enzym vykazoval specifickou aktivitu 8,25 j/mg vlhké hmoty a obsahoval 60 % výchozí enzymové aktivity.
Příklad 4
Submerzní kultivací asporogenního kmene Bacillus megatherium CCM 2037 ve 150 1 fermentačním tanku při teplotě v rozmezí 40 až 48 °C v přítomnosti vysokých koncentrací aminokyselin (ve formě kukuřičného extraktu) postupem podle J. Chaloupky a sp., [Biotechnol. and Bioeng. Symp. No. 4, 985 až 993 (1974)] a s přídavkem chloramfenikolu v množství 50 pg/ml na konci exponenciální fáze růstu, bylo získáno přibližně 3000 g buněčné hmoty. Tímto způsobem bylo dosaženo tvorby velmi dlouhých vláken uvedeného kmene s vysokým obsahem mureinu (peptidoglykanu) v buněčné stěně.
Popsaným způsobem získaná nativní buněčná hmota B. megatherium byla rozdělena do dvou dílů á 1500 g vlhké hmoty. První díl nativní buněčné hmoty byl suspendován v 1500 ml vody a za míchání zahřát na 64 °C a přidáno 3000 ml 10%ní (w/v) kyseliny trichloroctové předehřáté na 62 °C. Směs byla za míchání ohřátá na 80 °C a při této teplotě zahřívána 20 minut. Potom byla směs ochlazena na 30 °C, odstředěna a buněčná hmota promyta 20 1 vody. Takto bylo získáno 800 g vlhké buněčné hmoty ošetřených vláken B. megatherium kyselinou trichloroctovou; velikost vláken se pohybovala v rozmezí 20 až 30 pm.
Část nativní a část trichloroctovou kyselinou ošetřené buněčné hmoty B. megatherium byla roztníchána ve vodě na koncentraci 30 g vlhké hmoty/100 ml a buňky byly desintegrovány šestinásobnou recyklací na mechanickém desintegrátoru Manton-Gaulin při tlaku 500 kp/cm2 při laboratorní teplotě. Fragmenty buněčných stěn byly odděleny odstředěním 30 minut při 20 000 G a pětkrát promyty destilovanou vodou.
Fragmenty buněk ošetřených trichloroctovou kyselinou · byly rozmíchány ve vodě, pH upraveno 20%ním roztokem NaOH na hodnotu 11,0 a suspenze míchána 20 hodin při 25 °C a potom byla znovu odstředěna a fragmenty buněčných stěn promyty několikrát vodou. Technická penicilinacyláza (specifická aktivita 544 j/mg bílkovin) byla rozpuštěna v 0,05 M fosfátovém pufru o pH 7,6 dle Sórensena na výslednou koncentraci 40 mg/ml a ve 25 ml tohoto roztoku bylo suspendováno vždy po 1 g vlhké hmoty, nativních nebo ošetřených celých buněk B. megatherium či nativních nebo ošetřených fragmentů buněčných stěn tohoto kmene takto:
(A) fragmenty nativních buněk, (B) fragmenty buněk ošetřených trichloroctovou kyselinou a NaOH, (C) celé nativní buňky, (D) celé buňky ošetřené trichloroctovou kyselinou. Za stálého míchání bylo ke každé ze suspenzí přidáno 1 ml 25%ního roztoku glutardialdehydu; reakce probíhala 30 minut při laboratorní teplotě za stálého míchám a 30 minut nebyla reakční směs míchána za jinak stejných podmínek. Po 60 · minutách reakce byly vzniklé agregáty odděleny na sítu s velikostí ok 75 pm, promyty třikrát 100 ml destilované vody a zbaveny nadbytečné vody vakuovou filtrací.
Specifická aktivita a výtěžek imobilizovaného enzymu jsou uvedeny v následující tabulce, při208 931 čemž jako kontrolní preparát sloužily agregáty připravené pouze z roztoku enzymu.
| Imobilizovaný | Specifická aktivita | Výtěžek |
| preparát | (j/mg vlhké hmoty) | (%) |
| Kontrolní | ||
| preparát | 19,5 | 45,4 |
| A | 17,1 | 44,7 |
| B | 18,0 | 45 |
| C | 15,6 | 43,8 |
| D | 20,1 | 48,6 |
g z každého materiálu byly přeneseny do 500 ml varné baňky, suspendovány ve 100 ml 0,05 M fosfátového pufru podle Sórensena . o pH
7,6 a umístěny na rotačnítřepřcístroj (240 ot/min, výstředník 6,5 cm, teplota 29 °C). Po 8 (192 hodin) a 22. (528 hodin) dnech byly imobilizované preparáty odděleny filtrací přes uvedené síto a stanovena jejich enzymová aktivita, potom opět promyty a znovu suspendovány do téhož objemu stejného pufru a umístěny opět na rotační třepací stroj.
Změny enzymové aktivity imobilizované penicilinacylázy uvedených preparátů při dlouhodobém testování stability jsou uvedeny v následující tabulce:
Imobilizovaný Enzymová aktivita (%)
| preparát | 0 hodin | 192 hodin | 528 hodin |
| Kontrolní | |||
| preparát | 100 | 73,1 | 39 |
| A | 100 | 79,2 | 58,3 |
| B | 100 | 83,5 | 70,3 |
| C | 100 | 93,5 | 74,8 |
| D | 100 | 91,6 | 96,4 |
Příklad 5
Ve 100 ml 0,05 M fosfátového pufru dle Sórensena o pH 7,6 bylo suspendováno 4 g vlhké hmoty celých buněk B. megatherium ošetřených trichloroctovou kyselinou způsobem podle příkladu 4. V této suspenzi byly rozpuštěny . 3 g technické penicilinacylázy o specifické aktivitě 300 j/mg bílkovin. Za stálého míchání laboratorním míchadlem byly přidány 4 ml 25%ního roztoku glutardialdehydu a agregáty vzniklé po 30 minutách míchání byly ponechány stát dalších 30 minut. Reakce probíhala při laboratorní teplotě. Po 60 minutách byly pelety odděleny filtrací na sítu s velikostí ok 75 pm, promyty třikrát 400 ml destilované vody, rozmíchány ve 100 ml acetonu ochlazeného na — 15 °C a po 5 ti minutovém míchání ostře odsáty na fritě G1 a sušeny prosáváním vzduchu.
Aktivita takto získaného ve vodě nerozpustného materiálu byla 18 j/mg vlhké hmoty a výtěžek aktivity činil 22 %. Kontrolní materiál byl připraven tímtéž způsobem z roztoku téhož enzymu (agregované bílkoviny bez peptidoglykanu). Enzy208 931 ...... ........................
mová aktivita _ kontrolního materiálu byla 30 j/mg vlhké hmoty při výtěžku 27 %. 2 g nerozpustného materiálu byly použity pro opakovanou enzymovou hydrolýzu 7%ního vodného roztoku sodné soli benzylpenicilinu v objemu 80 ml při teplotě 37 °C P a udržování pH (pH-stat) dávkováním čpavkové vody v rozmezí hodnot 7,6 až 7,8. Reakční doba byla 90 minut. ______2________________________________ ________
Opakované' konverze benzylpenicilinu na
6-APK pomocí imobilizované penicilinacylázy na peptidoglykanové pelety a srovnání s kontrolním j materiálem (zesítěné bílkoviny), _ za podmínek uvedených výše je uvedeno v následující tabulce:
| konverze | kontrolní materiál | pelety |
| · 1 | 95,0 % | 91,0 % |
| : 2 | 88,5 % | 94,4 % |
| .3 | 84,8 % | 91,1 % |
| 4 | 81,6 % | 94,8 % |
| 5 | — | 91,9 % |
| 6 | — | 91,5 % |
| . ; _ _7_ ' . | — | 92,3 % |
| i : · |
Claims (7)
- PREDMET VYNALEZU1. Imobilizovaná penicilinacyláza k přeměně penicilinů, ' na kyselinu 6-aminopenicilánovou, vyznačená tím, že sestává z enzymu penicilinacylázy a buněk nebo buněčných fragmentů prokaryontních nebo eukaryontních organismů svázaných navzájem chemicky prostřednictvím polyfunkčních aldehydů, s výhodou glutardialdehydu.
- 2. Způsob přípravy imobilizované_ penicilinacyi lázy podle bodu ' 1, vyznačený tím, že se enzym penicilinacyláza nechá reagovat s celými neporušenými nativními anebo fyzikálně, chemicky nebo ; biochemicky ošetřenými buňkami nebo nerozpustI nými fragmenty buněk různé morfologie a s poly| funkčním aldehydem, s výhodou glutardialde! hydem.
- 3. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že se použije rozpustné penicilinacylázy, která obsahuje popřípadě jiné bílkoviny provázející ji v průběhu izolace.
- 4. Způsob podle bodů 2 a 3, vyznačený tím, že k reakci s enzymem a polyfunkčním aldehydem se použije fragmentů nebo celých buněčných stěn mikroorganismů, s ' výhodou grampositivních bakterií.
- 5. Způsob podle bodů 2 a 3, vyznačený tím, že k reakci s enzymem a polyfunkčním aldehydem se použije fragmentů nebo částečně uměle nebo samovolně lyžovaných buněk mikroorganismů produkujících penicilinacylázu.
- 6. Způsob podle bodů 2,3 a 4, vyznačený tím, že k reakci s enzymem a polyfunkčním aldehydem se použije odpadních buněk, odpadní buněčné hmoty nebo fragmentů z nich připravených nebo samovolně vzniklých.
- 7. Způsob podle bodů 2 až _ 6, vyznačený tím, že se použije polyfunkčního aldehydu v množství 0,1 až 10 % hmotnostních.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS37678A CS208931B1 (en) | 1978-01-19 | 1978-01-19 | Immobilized penicillinacylase for transformation of penicillin in 6-aminopenicillane acid and method of its preparation |
| DE19782849764 DE2849764A1 (de) | 1978-01-19 | 1978-11-16 | Immobilisierte penicillinacylase und verfahren zu ihrer herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS37678A CS208931B1 (en) | 1978-01-19 | 1978-01-19 | Immobilized penicillinacylase for transformation of penicillin in 6-aminopenicillane acid and method of its preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS208931B1 true CS208931B1 (en) | 1981-10-30 |
Family
ID=5335734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS37678A CS208931B1 (en) | 1978-01-19 | 1978-01-19 | Immobilized penicillinacylase for transformation of penicillin in 6-aminopenicillane acid and method of its preparation |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS208931B1 (cs) |
| DE (1) | DE2849764A1 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6066981A (ja) * | 1983-09-12 | 1985-04-17 | アメリカン・ホ−ム・プロダクツ・コ−ポレイシヨン | 不溶化ペニシリンアミダ−ゼおよびその製法 |
-
1978
- 1978-01-19 CS CS37678A patent/CS208931B1/cs unknown
- 1978-11-16 DE DE19782849764 patent/DE2849764A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2849764A1 (de) | 1979-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Homaei | Enzyme immobilization and its application in the food industry | |
| US4323650A (en) | Immobilization of biologically active substances in a porous support | |
| KR880700854A (ko) | 신규한 고정된 생체촉매와 그 제법 및 용도 | |
| EP0034609B1 (en) | Immobilized enzyme(s) and microorganism(s) and their production | |
| US3821086A (en) | Enzymatic process using immobilized microbial cells | |
| Vojtíšek et al. | Immobilized cells | |
| JPS59113889A (ja) | 固定化酵素もしくは固定化微生物菌体の製造方法 | |
| Bahulekar et al. | Immobilization of penicillin G acylase on functionalized macroporous polymer beads | |
| US3989596A (en) | Aggregate of dried flocculated cells | |
| CS208931B1 (en) | Immobilized penicillinacylase for transformation of penicillin in 6-aminopenicillane acid and method of its preparation | |
| US3989597A (en) | Aggregate of flocculated cells | |
| USRE29130E (en) | Enzymatic process using immobilized microbial cells | |
| US4250263A (en) | Method of purification of thermally stable enzymes | |
| Chibata et al. | Immobilized cells: Historical background | |
| CN1059759A (zh) | 复合固定化酶的制备方法 | |
| CS203607B1 (en) | Process for preparing bonded cells with activity of penicilinacylase | |
| Powell | Immobilized biocatalyst technology | |
| Itoh et al. | Immobilized bromoperoxidase of Corallina pilulifera as a multifunctional halogenating biocatalyst | |
| CS207715B2 (en) | Method of preparation of the 6-aminopenicillane acid | |
| US4184919A (en) | Method of gelling microbial mycelia | |
| USRE29136E (en) | Enzymatic process using immobilized microbial cells | |
| Bodhe et al. | Immobilization of Kluyvera citrophila penicillins acylase on controlled-pore ceramics | |
| JPH06169772A (ja) | 固定化生体触媒及びその製造法 | |
| Braun et al. | Whole Cells and Enzymes Immobilized on Chitosan | |
| KR800000241B1 (ko) | 고정화 포도당 이성화 효소의 제조방법 |