KR860000698B1 - 세포 고정화에 의한 6-아미노페니실란산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

세포 고정화에 의한 6-아미노페니실란산의 제조방법

본 발명은 페니실린 지 아실라제 효소를 고정화한 것을 이용하는 공지 방법과는 달리 유전자 조작등에 의해 효소를 대량 생산하는 미생물 균주를 개발하고, 개발된 미생물 세포를 고정화하여 이것을 이용하여 페니실린 지에서 6-아미노 페니실란산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

종래의 고정화 페니실린지 아실라제를 이용하는 특허는 고정화 지지체에 특징이 있는 것들로서 네델랜드 특허 공개 제7265609호에서는 셀룰로오스트리아세테이트 섬유를, 미국특허 제3887432호에서는 수용성 무수마레인산/메틸비닐 공중합체를, 미국특허 제4167446호에서는 덱스트란을, 미국특허제3953291호에서는 폴리아크릴아미드를, 미국특허 제4001264호에서는 메타크릴산의 비수용성 중합체 내지는 공중합체를, 한국특허공보(공고번호 : 83-1446호)에서는 다공성 구조의 아크릴로니트릴 중합체를 지지체로 사용하는 방법이다.

이들 특허는 효소를 이용하고 있는 바, 효소를 준비하기 위해서는 배양된 미생물에 물리적인 힘을 가하여 세포를 파괴해야하고, 효소 정제 과정 중 전체효소 역가의 약 50%가 손실되며, 효소정제 공정에 많은 노력과 시간이 소요되는 등의 난점이 있어 효소의 가격이 고가로 되며, 효소를 지지체에 고정화 할려면, 지지체에 유리아미노기가 있어야 효소와 공유결합을 하여 고정화되기 때문에 복잡한 공정을 거쳐야 하는 등의 여러가지 결점이 있었다.

본 발명은 상기한 종래의 결점을 개선한 것으로, 페니실린지 아실라제를 대량 생산하는 미생물균주, 예를들어 KFCC-84-3등을 배양하여 효소를 따로이 정제하지 않고, 미생물세포 자체를 지지체인 카라기난등 불용성 다당류(polysaccharides)에 포집시켜, 40-400 마이크론 정도의 입자로 만들고, 이 고정화 세포 입자를 이용하여 연속방법으로 6-아미노페니실란산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

이와 같은 본 발명 방법을 좀더 상세히 설명하면, 박토펩톤, 박토이스트엑기스, 염화나트륨, pH7.5인 멸균된 통상의 액체 배지에서 25-45℃에서 진탕배양한 페니실린지 아실라제 생산균주 에세리키아콜리(KFCC-84-3)를 원심분리, 수확하고, 인산완충액에 현탁시킨다. 불용성 다당류를 동일 완충액에 녹이고 동량의 미생물세포 현탁액과 섞은 후, 공기중에서 건조시키고, 마쇄시켜 40-400 마이크론의 분말을 만든다.

이와 같이 제조한 고정화 세포는 물에 불용성이며, 분말 형태를 이루고 있기 때문에, 화분법과 같은 간단한 방법이나, 컬럼법과 같은 연속방법등의 어느 방법이건 이를 이용할 수 있다. 예를들면, 화분법인 경우, 페니실린용액의 pH를 일정하게 유지하고, 고정화 세포가 부유되도록 교반시켜 주면서 반응을 진행시키고, 반응이 종료되면 여과나 원심 분리에 의해 고정화 세포를 회수하고, 새로운 페니실린 용액에 회수한 고정화 세포를 첨가하여 반응을 다시 진행한다.

컬럼법인 경우, 고정화 세포를 컬럼에 충입한 뒤, 이 컬럼속으로 페니실린 용액을 통과시키는 데, 수산화 알칼리등 알칼리를 가하여 pH 를 6.5-9.5로 유지시켜 pH의 저하에 따른 고정화 세포의 불활성화와 페니실린의 분해를 방지하고, 탈아실화 반응이 촉진하도록 열교환기를 경유 한다. 재순환시 유속은 시간당 10-150ℓ가 되도록 하여, 알칼리의 소모 속도가 영에 가까울 때까지 반응을 진행시킨다. 상기의 반응을 수행하는 온도는 통상 15-60℃의 범위이다. 반응에 적절한 pH는 6-9이며, 반응에 소요되는 시간은 세포의 역가, 기질의 유량, 유속등에 따라 차이가 있지만 통상 1-10시간이다. 페니실린 용액의 농도는 1-20%W/V로 사용하지만, 반응의 속도를 높이고, 최종 생산물 회수등을 고려할 때 통상 3-12%W/V의 범위가 바람직하다. 반응액에서 6-아미노세니실란산의 분리, 정제는 공지의 방법으로 수행한다. 예를들면, 반응액 중에 잔존하는 페니실린과 카르복실산을 메틸이소부틸케톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 등의 유기 용매로 산성에서 추출, 제거한 뒤, pH를 3-6으로 조절하는 등전점침전의 방법을 이용한다.

페니실린지 아실라제의 역가 측정방법은 통상의 파라-디메틸아미노벤잘데히드에 의한 발색 반응이 있으나, 초기의 반응속도가 선형인 부분을 찾기 어려워, 페닐아세트산을 중화하는 데 필요한 알칼리의 소모량으로 결정하였다. 이와 같은 본 발명 방법의 상세한 실시예는 다음과 같다.

[실시예 1]

(공여대장균 ATCC 11105로 부터 제한효소를 이용하여 페니실린 지 아실라제의 유전자를 분리하고, 동일 제한 효소로 처리된 플라스미드 피비알 322에 접합시켜 , 제조합 플라스미드를 만들고, 이것을 이용하여 대장균 에이디비 101에 형질전환시켜 유전자 조작된 새로운 균주(KFCC-84-3))을 만들었다).

박토트립톤 1%, 이스트엑기스 1%, 과당 1%, 비프엑기스 0.5%염화나트륨 0.25%, pH7.5인 배지 500ml를 통상의 방법으로 멸균한 뒤 페니실린 지 아실라제를 대량생산하는 미생물균주(KFCC-84-3)를 접종하여 30℃에서 12시간 배양한다. 원심분리하여 미생물 세포들을 수확한 뒤, 0.1 몰 인산완충액에 현탁시킨다. 카라기난(carrageenan) 4g을 100ml 인산완충액에 녹이고, 폴리에틸렌아민(분자량 700-60,000) 0.2%V/V와 미생물 세포혁탄액 100ml와 섞은 뒤 공기 중에서 건조시킨다. 절구동 분쇄기로 40-400 마이크론으로 분쇄하여 고정화 세포를 만든다.

2.5×9cm 되는 컬럼에 분말고정화 세포를 충입하고, 페니실린 10%W/V 용액 150ml를 pH8.0으로 조절한 뒤, 통과시키고 재순환시킨다. 이 조작을 2시간동안 계속하여 수산화암모늄의 소모 속도가 거의 없는 단계에서 재순환을 중지 하였는데, 이 때 반응액내의 6-아미노 페니실란산 전환율은 90%였다.

[실시예 2]

실시예 1에서 얻은 고정화 세포 20g을 500ml 반응조에 옮기고, 페니실린 지 10% 용액 150ml를 pH8.0으로 조절하면서, 2시간 반응시킨다. 이때 반응액내의 6-아미노페니실란산 전환율은 85%였다. 이러한 회분식의 방법으로 2시간씩 250회 반응시켰을 때, 고정화 세포의 역가는 초기보다 50% 정도 감소되었다.

[실시예 3]

실시예 1에서와 같이 동일 배지에서 배양한 미생물 세포들을 수확한 뒤, 200mg 초산셀룰로스를 2.1ml 염화메틸렌에 녹인 용액과 혼합하여 교반시켜 유화입자로 형성시키고, 질소가스로 밀어 내어 실형태로 고정화 시킨다. 이를 건조시킨 뒤, 마쇄하여 40-400 마이크론의 입자상 고정화 세포를 만들고, 2.5×90cm되는 컬럼에 충입하여 페니실린 2%W/V 용액 150ml를 pH8.0으로 조절하여 통과시키고 3시간 재순환시켰을 때, 반응액 내의 6-아미노페니실란산 전환율은 90% 였다.

[실시예 4]

실시예 1에서와 같이 동일 배지에서 배양한 미생물 세포들을 수확한 뒤, 2%아가(agar) 용액과 혼합하고, 건조시킨 뒤 마쇄하여 40-400 마이크론의 입자상 고정화 세포를 만들고, 2.5×90cm 되는 컬럼에 충입하여 페니실린 2%W/V 용액 50ml를 pH8.0으로 조절하여 통과시키고 2시간 재순환시켰을 때, 반응액 내의 6-아미노 페니실란산 전환율은 90%였다.

Claims (2)

1. 페니실린지 아실라제를 대량 생산하는 미생물균주(KFCC-84-3)를 공지의 방법으로 배양하여 얻은 미생물세포 현탁액과 지지체로 카라기난, 아가(agar), 아가로스(agarose), 글루칸(glucan), 데스트란(dextran), 로카스트 빈 검(locust bean gum), 셀룰로스 및 그 유도체 등의 다당류 용액을 혼합하여 건조시킨 뒤, 마쇄하여 40-400 마이크론의 고정화 세포 분말을 제조하고, 이 고정화 세포를 이용하여 회분법이나 컬럼법으로 6-아미노페니실란산을 제조하는 세포고정화에 의한 6-아미노페니실란산의 제조방법.
2. 제1항에서, 지지체를 카라기나을 사용하는 경우, 0.1-0.3%V/V의 폴리에틸렌이민(분자량 700-60,000)을 첨가하여 고정화 세포를 제조하는 방법.