JPH0548117B2

JPH0548117B2 -

Info

Publication number: JPH0548117B2
Application number: JP60231740A
Authority: JP
Inventors: Eiji Nakazawa; Hiroshi Sonoda
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1985-10-17
Filing date: 1985-10-17
Publication date: 1993-07-20
Also published as: JPS6291190A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は調味料、飼料添加剤、医薬等に広く利
用されているＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ
−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−フエニルア
ラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ
−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−バリン、Ｌ−
セリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−
チロシン、Ｌ−トリプトフアンおよびＬ−ロイシ
ンなどのＬ−アミノ酸の製造法に関するものであ
る。〔従来の技術〕従来よりブレビバクテリウム属、コリネバクテ
リウム属、バチルス属又はエセリヒア属等に属す
る微生物により、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジ
ン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−フエ
ニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシ
ン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−セリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリ
ン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトフアンおよびＬ
−ロイシンなどのＬ−アミノ酸は発酵法により工
業的に生産されている。これらの微生物は生育に
酸素を必要とするため、このような微生物の培養
には酸素の供給が必須である。一般的には各々の
微生物菌体を得るために、従来から酸素の供給の
ために液体培地中に空気を供給し、通気、攪拌に
よつて気泡を細かくするなど培地中の溶存酸素濃
度を高める方法が試みられている。しかしながら
種母培養において、空気を通気しただけでは、培
地中にリンゴ酸、コハク酸および乳酸などの有機
酸が生成すること、及びこれらの有機酸の中で特
に乳酸の生成が著しいことがわかつた。これらの
有機酸の生成は種母培養において目的とする各々
のＬ−アミノ酸生産菌体の濃度および主炭素源か
らの菌体収率を低下させる。このように、従来行われてきた菌体濃度および
菌体収率の低い種母培養液を用いた主発酵培地中
でのＬ−アミノ酸発酵は、目的とするＬ−アミノ
酸の収率、生産速度および蓄積量ともに低下させ
るという欠点を有していた。〔本発明が解決しようとする問題点〕本発明が解決しようとする問題点は上述の欠点
を解決し、工業的に従来以上に安価なＬ−アミノ
酸を生産する方法を開発することにある。〔問題点を解決するための手段〕本発明者らはＬ−アミノ酸の発酵収率、生産速
度および蓄積量をさらに向上させ、工業的に有利
な発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を開発する
ために、種母培養法について、鋭意研究した結
果、種母培地中に空気中の酸素濃度以上の酸素を
培地中に供給することにより、培地中のリンゴ
酸、コハク酸、乳酸などの有機酸が低下し、種母
培養液中の菌体濃度および菌体収率が向上し、本
種母培養液を主発酵培地に移植し、培養を行うと
目的とするＬ−アミノ酸の収率、生産速度および
蓄積量は高められることを知つた。本発明はこの
知見に基づき更に研究を行つた結果なされたもの
である。即ち、本発明は、ブレビバクテリウム属、コリ
ネバクテリウム属、エセリヒア属、シユウドモナ
ス属またはバチルス属のＬ−アミノ酸生産菌を種
母培地に接種し、該培地中の乳酸が少なくとも10
mg／dlに達した時期から、該培地中の乳酸の量が
10−200mg／dlになるように、酸素富化空気を種
母培地に供給しつつ培養を行つた後に、この種母
培養液を主発酵培地に移植し、主発酵を行うこと
を特徴とする発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法
に関するものである。本発明でいうＬ−アミノ酸とはＬ−グルタミン
酸、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニ
ン、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ
−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリ
ン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−オルニチン、
Ｌ−シトルリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトフ
アンおよびＬ−ロイシンなどのＬ−アミノ酸であ
り、ここに例示したＬ−アミノ酸以外でも好気的
条件下で発酵法により生産されるＬ−アミノ酸で
あれば本発明の方法は使用可能である。本発明で用いるＬ−アミノ酸生産菌は上記のＬ
−アミノ酸を生産する微生物であればどのような
微生物を用いてもよい。具体的には１Ｌ−グルタミン酸生産菌ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P5012（AJ11360）コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
ATCC13870 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032 ２Ｌ−リジン生産菌ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P1708（AJ3419）コリネバクテリウム・グルタミクム
FERM−P1709（AJ3420）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P1712（AJ3425）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P1711（AJ3424）３Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P5502（AJ11576）コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
ATCC13870 ４Ｌ−アルギニン生産菌ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P7642（AJ12144）コリネバクテリウム・グルタミクム
FERM−P7274（AJ12093）５Ｌ−フエニルアラニン生産菌ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P1844（AJ3432）ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P1916（AJ3439）コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC21670 ６Ｌ−スレオニン生産菌エセリヒア・コリ
FERM−P4900 FERM Ｐ−1483（AJ11334）コリネバクテリウム・グルタミクム
FERM−P5835（AJ11654）ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P4164（AJ11172）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P4180（11178）７Ｌ−イソロイシン生産菌ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P805（AJ3271）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P4192（AJ11190）８Ｌ−ヒスチジン生産菌ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P2316（AJ3620）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P1565（AJ3386）コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC14297 ９Ｌ−プロリン生産菌ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P5332（AJ11512）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P4370 FERM BP−1219（AJ11225）コリネバクテリウム・グルタミクム
FERM−P4372（AJ11227） 10 Ｌ−バリン生産菌ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P1945（AJ3446）ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P512（AJ3276）コリネバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P1968（AJ3455） 11 Ｌ−セリン生産菌コリネバクテリウム・グリシノフイラム
FERM−P1688（AJ3414）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P1371（AJ3360）シユウドモナス・メガルブエツセンス
FERM−P4532（AJ11262） 12 Ｌ−オルニチン生産菌ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P5936（AJ11678）コリネバクテリウム・グルタミクム
FERM−P5644（AJ11589） 13 Ｌ−シトルリン生産菌コリネバクテリウム・グルタミクム
FERM−P5643（AJ11588）ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P1645（AJ3408） 14 Ｌ−チロシン生産菌コリネバクテリウム・グルタミクム
FERM−P5836（AJ11655）ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P7914（AJ12180）バチルス・ズブチリス
FERM−P6758（AJ11968） 15 Ｌ−トリプトフアン生産菌バチルス・ズブチリス
FERM−5286（AJ11483）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P7127（AJ12044）ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P7034 FERM−BP475（AJ12022）コリネバクテリウム・グルタミクム
FERM−P7128（AJ12052） 16 Ｌ−ロイシン生産菌ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
FERM−P1769（AJ3427）ブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P420（AJ3226）コリネバクテリウム・グルタミクム
FERM−P1966（AJ3453）などが使用される。本発明で使用するＬ−アミノ酸生産菌の種母培
地としては、従来より知られているＬ−アミノ酸
生産菌の生育に適した種母培地が使用可能であ
る。更に本発明においては従来の空気中の酸素濃
度以上の酸素量を供給し、高濃度の菌体を得るた
めに、培地中の栄養物は従来の培地組成以上の濃
度のものでも使用可能で、他の栄養物のバランス
を失わない限り高濃度にしても良い。本発明においては種母培地中の乳酸量を測定
し、乳酸量があらかじめ決めた濃度以上になつた
時点より空気中の酸素濃度以上の酸素を種母培地
に供給する。乳酸の測定は、迅速性があれば公知
のいかなる方法でも良い。空気中の酸素を供給す
る時点での生成乳酸量は使用するアミノ酸の種
類、生産菌の種類により、任意に選定すれば良
い。具体的には10mg／dl〜200mg／dl、望ましく
は10mg／dl以上になつた時点で空気中の酸素濃度
以上の酸素を培地中に供給すれば良い。本発明に
おいて使用される酸素は液体酸素、P.S.A（プレ
ツシヤー、スイング、アブソープシヨン）法又は
酸素富化膜法によつて製造される酸素などがあ
る。酸素の供給は培地中の乳酸のレベルにより供給
量を適宜調整すれば良い。この場合過剰の酸素ガ
スを供給しても菌体収率、菌体濃度にほとんど影
響を及ぼさないが、経済的には酸素供給量は培地
中の乳酸量が200mg／dl以下になるような量で良
く、一般的には、酸素濃度25〜50％の酸素と空気
の混合ガスの場合は１／10〜１／2VVM程度で
ある。空気以上の酸素を供給する方法は、空気と酸素
を培養タンク内に両者を別々のパイプで供給して
も良く、空気と酸素を混合した後に供給しても良
く、又アンモニアガスと混合して供給してもよ
い。更に酸素を培地の表面から供給することも可
能である。本発明において、空気中の酸素濃度以上の酸素
の供給を停止する時点は、該ガスの供給を停止し
ても培地中の乳酸の生成が認められなくなる時点
で停止すればよい。以上のように、種母培養を行うことにより、高
菌体収率および高菌体濃度の種母培養液が得られ
る。本種母培養液を従来より知られているＬ−ア
ミノ酸生産菌に適した主発酵用Ｌ−アミノ酸生産
培地に移植し、培養することによりＬ−アミノ酸
の発酵収率、発酵生産速度および蓄積量が向上す
る。なお、各アミノ酸発酵液からの各々のアミノ酸
の単離方法は常法に従つて行えば良く、特別の方
法を必要としない。実施例１グルコース５ｇ／dl、KH₂PO₄0.1ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.05ｇ／dl、FeSO₄・7H₂O1mg／
dl、MnSO₄・4H₂O1mg／dl、尿素0.5ｇ／dl、ビ
オチン300μｇ／、サイアミン塩酸塩3000μｇ／
、大豆蛋白酸加水分解液を全窒素として100
mg／dlを含む種母培地をPH7.5に調節した培地の
300mlを１容フアーメンターに入れ殺菌した。
これにブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタ
ムFERM−P5012（AJ11360）を接種し、培養は
31.5℃、回転数1000rpmでアンモニアガスにてPH
7.0〜7.5に保持しつつ行つた。通気は空気（１／
2VVM）だけの場合、および空気（0.4VVM）
と酸素（0.1VVM）の混合ガスで行つた。酸素と
の混合ガスの場合は乳酸の生成が200mg／dlを超
えないように通気する酸素の量をコントロールし
てそれぞれ培養し、グルコースの消費が完了する
まで続けた。このようにして得られた種母培養液
を主発酵培地（第１表）に5vol％移植し、35℃に
て培養した。グルコース濃度が３ｇ／dl以下にな
つてからは、グルコース濃度が１〜３ｇ／dlの範
囲にコントロールされるように70ｇ／dlのグルコ
ース溶液を連続的にフイードしながら48時間まで
培養を続けた。種母培養での菌体濃度および主培養で生成した
Ｌ−グルタミン酸の量を第２表に示した。

【表】

【表】実施例２第３表の組成の種母培地300mlを1.0容のジヤ
ーフアーメンターに張り込み120℃で15分間滅菌
し、これにブレビバクテリウム・フラバム
FERM−P1708（AJ3419）を接種し、31.5℃、回
転数100rpm、でアンモニアガスにてPH6.5から7.0
に保持しつつ行つた。通気は空気（１／4VVM）だけの場合、およ
び空気（0.20VVM）と酸素（0.05VVM）の混合
ガスで行つた。酸素との混合ガスの場合は乳酸の
生成が50mg／dlを超えないように通気する酸素の
量をコントロールしてそれぞれ培養しグルコース
の消費が完了するまで続けた。このようにして得
られた種母培養液は主発酵培地（第３表）に5vol
％移植し、31.5℃にて培養した。グルコース濃度
が３ｇ／dl以下になつてからは、グルコース濃度
が１〜３ｇ／dlの範囲にコントロールされるよう
に60ｇ／dlのグルコース３ｇ／dlの硫酸アンモニ
ウムの混合溶液を連続的にフイードしながら96時
間まで培養を続けた。種母培養での菌体濃度およ
び主培養で生成したＬ−リジン量は第４表に示す
通りであつた。

【表】

【表】実施例３グルコール６ｇ／dl、（NH₄）₂SO₄0.2ｇ／dl、
尿素0.2ｇ／dl、KH₂PO₄0.15ｇ／dl、MgSO₄・
7H₂O0.04ｇ／dl、FeSO₄・7H₂O1mg／dl、サイ
アミン・HCl10μｇ／dl、ビオチン0.3μｇ／dl、
大豆蛋白酸加水分解液を全窒素として30mg／dlを
含む種母培地をPH7.0に調節した培地の300mlを１
容フアーメンターに入れ殺菌した。これにブレ
ビバクテリウム・フラバムFERM−P5502
（AJ11576）を接種し、31.5℃に保ちつつ、回転
数1000rpmでアンモニアガスにてPH7.0〜7.5に保
持しつつ行つた。通気は空気（１／2VVM）だ
けの場合および空気（0.4VVM）と酸素
（0.1VVM）の混合ガスで行つた。酸素との混合
ガスの場合は乳酸の生成が50mg／dlを超えないよ
うに通気する酸素の量をコントロールしてそれぞ
れ培養しグルコースの消費が完了するまで続け
た。このようにして得られた種母培養液は主発酵
培地（第５表）に5vol％移植し、31.5℃にて培養
した。グルコース濃度が３ｇ／dl以下になつてか
らはグルコース濃度が１〜３ｇ／dlの範囲にコン
トロールされるように70ｇ／dlのグルコース溶液
を連続的にフイードしながら72時間まで培養を続
けた。その結果種母培養での菌体濃度および主培
養で生成したＬ−グルタミンの量は第６表に示す
通りであつた。

【表】

【表】実施例４グルコース７ｇ／dl、KH₂PO₄0.1ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.04ｇ／dl、FeSO₄・7H₂O1mg／
dl、MnSO₄・4H₂O1mg／dl、尿素0.3ｇ／dl、大
豆蛋白酸加水分解液を全窒素として100mg／dl、
サイアミン・HCl30μｇ／dl、ビオチン20μｇ／dl
を含む種母培地をPH7.0に調節し、その300mlを１
容フアーメンターに入れ殺菌した。これにブレ
ビバクテリウム・フラバムFERM−P7642
（AJ12144）を接種し、31.5℃に保ちつつ行つた。
通気は空気（１／4VVM）だけの場合および空
気（0.2VVM）と酸素（0.05VVM）の混合ガス
で行つた。酸素との混合ガスの場合は乳酸の生成
が50mg／dlを超えないように通気する酸素の量を
コントロールしてそれぞれ培養しグルコースの消
費が完了するまで続けた。このようにして得られ
た種母培養液は主発酵培地（第７表）に5vol％移
植し、31.5℃、回転数1000rpmでアンモニアガス
にてPH6.5ないし7.0に保持しつつ行つた。グルコ
ース濃度が５ｇ／dl以下になつてからは、グルコ
ース濃度が３〜５ｇ／dlの範囲にコントロールさ
れるように70ｇ／dlのグルコース溶液を連続的に
フイードしながら72時間まで培養を続けた。その
結果種母培養での菌体濃度および主培養で生成し
たＬ−アルギニンの量は第８表に示す通りであつ
た。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム
属、エセリヒア属、シユウドモナス属またはバチ
ルス属のＬ−アミノ酸生産菌を種母培地に接種
し、該培地中の乳酸が少なくとも10mg／dlに達し
た時期から、該培地中の乳酸の量が10−200mg／
dlになるように、酸素富化空気を種母培地に供給
しつつ培養を行つた後に、この種母培養液を主発
酵培地に移植し、主発酵を行うことを特徴とする
発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法。