CN107532160A - 微生物制剂的制造方法及微生物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的微生物制剂的制造方法具备：在含有对象化合物的培养基中添加含有对象化合物分解性微生物的生物质和无机微粒载体，使生物质所含的微生物载持在无机微粒上，一边监视载持于无机微粒载体的微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例、一边进行培养的工序；和在对象化合物分解性微生物的存在比例达到预定值之后，对载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体进行回收，获得微生物制剂的工序；其中，对象化合物分解性微生物的存在比例通过包含以下工序的方法获得：对载持于无机微粒载体的微生物的16S rRNA基因的预定区域进行扩增，获得扩增产物的工序；和对扩增产物的碱基序列数据进行分析，根据各碱基序列数据间的同源性将所得碱基序列数据分为多个组，将具有各个组的碱基序列数据的微生物作为单一的种类，根据各个组的代表碱基序列数据确定对象化合物分解性微生物的种类，并根据所得碱基序列数据的数量计算全部微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例的工序。

Description

微生物制剂的制造方法及微生物制剂
技术领域
本发明涉及微生物制剂的制造方法及微生物制剂。
背景技术
在废水处理中，作为将对象化合物从废水中去除的方法，使用燃烧处理方法或利用了对象化合物分解性微生物的生物学处理方法等。作为获得对象化合物分解性微生物的方法，已知对分解对象化合物的微生物进行富集培养、然后对该分解微生物进行鉴定、分离、进行纯培养的方法(分离培养方法)。另外，为如活性污泥这样的混合微生物体系时，已知将对象化合物以低浓度作为营养源供给、通过慢慢地提高浓度使活性污泥习惯对象化合物、从而提高分解能力的被称作驯化的方法(驯化方法)。
但是，分离培养方法中，分解微生物的分离需要很长时间，适合的微生物也只限于能够人工培养者，具有用于进行进一步纯培养的制造成本高的课题。另一方面，驯化方法虽然能够廉价且大量地培养分解微生物，但具有驯化需要很长时间的课题。
另外，作为将对象化合物分解微生物高密度化的方法，例如如专利文献1所记载的，公开了对硝化细菌进行高密度化、对具有优异物性的微粒个体和微生物进行凝聚造粒化的微生物制剂的制造方法。该微生物制剂由于通过连续培养也可高效地进行制造、保存，因此对于废水的高效处理是有用的。
现有技术文献
专利文献1：日本特开2003-274937号公报
发明内容
发明要解决的技术问题
但是，专利文献1所记载的方法虽然能够以氮处理能力为指标对硝化细菌进行高密度化，但造粒化中及造粒化后的硝化细菌群的种类、存在量是无法掌握的。在除氮以外的对象化合物的处理中，认为也是同样的。这样的方法中，仅以对象化合物的分解性为指标时，由于对象化合物分解性微生物的存在量及存在比例无法掌握，因而难以预测在造粒化工序中添加的对象化合物的浓度过高所导致的对象化合物分解微生物群的增殖抑制、或者因对象化合物的分解中间物的蓄积所导致的对象化合物分解微生物的增殖抑制等。另一方面，随着近年的基因分析技术的进步，能够在不对微生物进行分离的情况下，从活性污泥等复合微生物体系中掌握所存在的微生物的种类及存在量。但是，该技术的充分利用在现有情况下由于未脱离单纯的测定领域而受到局限，因而期待确立用于使基因分析技术应用于微生物制剂的制造方法的技术。
本发明鉴于上述事实，其目的在于提供通过监视对象化合物分解性微生物的存在比例，稳定且高效地制造以所期望的密度载持对象化合物分解性微生物的微生物制剂的方法。另外，本发明的目的还在于提供利用上述制造方法制造的微生物制剂、使用了该微生物制剂的化合物分解方法及该微生物制剂的评价方法。
用于解决技术问题的手段
本发明者们通过根据对制造中的微生物制剂所载持的微生物包罗性地进行分析的基因分析信息、对微生物制剂所载持的对象化合物分解性微生物进行监视，从而新确立了有效地制造微生物制剂的方法，进而完成了本发明。
即，本发明例如涉及以下的[1]～[6]。
[1]一种载持对象化合物分解性微生物的微生物制剂的制造方法，其具备：
在含有对象化合物的培养基中添加含有对象化合物分解性微生物的生物质和无机微粒载体，使生物质所含的微生物载持在无机微粒上，一边监视载持于无机微粒载体的微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例(丰度比例，abundance ratio)、一边进行培养的工序；和
在对象化合物分解性微生物的存在比例达到预定值之后，对载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体进行回收，获得微生物制剂的工序；
其中，对象化合物分解性微生物的存在比例通过包含以下工序的方法获得：
对载持于无机微粒载体的微生物的16S rRNA基因的预定区域进行扩增，获得扩增产物的工序；和
对扩增产物的碱基序列数据进行分析，根据各碱基序列数据间的同源性将所得碱基序列数据分为多个组，将具有各个组的碱基序列数据的微生物作为单一的种类，根据各个组的代表碱基序列数据确定对象化合物分解性微生物的种类，并根据所得碱基序列数据的数量计算全部微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例的工序。
[2]上述[1]所述的制造方法，其中，对象化合物为(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸。
[3]上述[1]所述的制造方法，其中，对象化合物为氨。
[4]一种微生物制剂，其是通过上述[1]～[3]中任一项所述的制造方法制造的。
[5]一种化合物分解方法，其使用了上述[4]所述的微生物制剂。
[6]一种评价方法，其为上述[4]所述的微生物制剂的评价方法，其具备以微生物制剂所含微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例为指标、对微生物制剂进行评价的工序；
其中，对象化合物分解性微生物的存在比例通过包含以下工序的方法获得：
对微生物制剂所含微生物的16S rRNA基因的预定区域进行扩增，获得扩增产物的工序；和
对扩增产物的碱基序列数据进行分析，根据各碱基序列数据间的同源性将所得碱基序列数据分为多个组，将具有各个组的碱基序列数据的微生物作为单一的种类，根据各个组的代表碱基序列数据决定对象化合物分解性微生物的种类，并根据所得碱基序列数据的数量计算全部微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例的工序。
发明效果
根据本发明可以提供一种方法，其通过检测载持于微生物制剂的微生物的种类、根据计算其存在比例的结果、对对象化合物分解性微生物进行监视，来稳定且高效地制造以所期望的密度载持对象化合物分解性微生物的微生物制剂。另外，本发明还可以提供利用上述制造方法制造的微生物制剂、使用了该微生物制剂的化合物分解方法及该微生物制剂的评价方法。
附图说明
图1为制造本实施方式的微生物制剂的反应槽的概略纵截面图。
具体实施方式
以下对用于实施本发明的方式(以下称作“本实施方式”)详细地进行说明。其中，本发明并不限定于以下的实施方式。
＜微生物制剂的制造方法＞
本实施方式的载持对象化合物分解性微生物的微生物制剂的制造方法具备以下的工序：在含有对象化合物的培养基中添加含有对象化合物分解性微生物的生物质和无机微粒载体，使生物质所含的微生物载持在无机微粒上，一边监视载持于无机微粒载体的微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例、一边进行培养的工序；和在对象化合物分解性微生物的存在比例达到预定值之后，对载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体进行回收，获得微生物制剂的工序。
作为本实施方式的对象化合物，只要是可被微生物分解的化合物则无特别限定，但优选含有在废水中的化合物。作为这样的化合物，例如可举出氨、亚硝酸、苯、甲苯、苯乙烯、二甲苯、儿茶酚、原儿茶酸、原儿茶醛、2-苯基丁酸、2-异丙基苯基丁酸、(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸、苯甲酸、苯甲醛等。其中，优选期待从废水中除去的氨或(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸。
作为含有对象化合物的培养基，只要含有对象化合物且能够对对象化合物分解性微生物进行培养，则无特别限定。作为这样的培养基，可以是人工调节了各盐类、pH等的培养基，也可以是下水(脏水)或废水。培养基所含对象化合物的浓度从对对象化合物分解性微生物进行驯化的观点出发，优选初始浓度设定得较低，在培养过程中逐渐提高。初始浓度可以每个对象化合物地进行适当设定。
对象化合物分解性微生物是指能够以对象化合物作为营养源进行分解、利用的微生物。本实施方式的对象化合物分解性微生物根据对象化合物的选择来适当选择。对象化合物选择氨时，例如可举出硝化细菌(亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)属等氨氧化细菌，硝化菌(Nitrobacter)属、硝化螺菌(Nitrospira)属等亚硝酸氧化细菌等)。对象化合物选择(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸时，例如可举出鞘脂单胞菌(Sphingomonadaceae)科细菌等。
作为含对象化合物分解性微生物的生物质，例如可举出活性污泥、土壌、生物膜等微生物群落等，从用于污水的净化而在产业上被广泛利用的观点出发，优选活性污泥。作为活性污泥，可举出下水污泥、产业废水处理厂活性污泥、粪便处理厂污泥等。
作为无机微粒载体，材质可以是金属及其无机盐类或氧化物，也可以是尽管含有碳、但在化学上被分类为无机物的物质，或者也可以是有机态碳的含量不足1％左右的纯物质或混合物。作为无机微粒载体，例如可举出氧化铝、羟磷灰石(碱式磷酸钙)等工业制品(包含处理品、副产物、废品等)、活性污泥等有机性废弃物的焚烧灰以及作为火力发电或炼焦炉的煤渣的煤炭焚烧灰等。
作为无机微粒载体，其中，从廉价、可通过简单的操作获得并且在短时间内产生微生物的活性表达的观点出发，优选煤炭焚烧灰。在煤炭焚烧灰中，优选熔渣灰或粉煤灰，由于即便不进行筛分等、中心粒径也为100μm以下，因此更优选粉煤灰。作为无机微粒载体，熔渣灰通过进行粉碎、调整中心粒径，也可以与粉煤灰同样地使用。熔渣灰或粉煤灰的组成并无特别限定。
无机微粒载体的中心粒径优选为1μm～100μm、更优选为4μm～75μm、进一步优选为13μm～25μm。中心粒径为这样的范围时，当将含对象化合物分解性微生物的生物质及无机微粒载体混合时，具有两者变得易于凝聚、易于将含有适当量的对象化合物分解性微生物的生物质载持在无机微粒载体上的倾向。
无机微粒载体的比重并无特别限定，优选为1.2～3.5。
无机微粒载体为了提高培养初期的合格率，还可以根据需要使用各种凝聚剂来使其凝聚。作为凝聚剂，例如可举出非离子性、阳离子性、阴离子性的高分子凝聚剂等。
作为本实施方式的培养方法，可以使用批式、半批式、流加、连续任一种方式。作为培养方法，例如从高效地制备增殖慢、菌体收率低的微生物的观点出发，如日本特开平9-187272号公报所记载的那样，可以使用随着培养时间的经过、使供给至培养微生物的容器(以下称作反应槽)的对象化合物的浓度对数增加的连续培养方式。
本实施方式中，对于反应槽的式样并无特别限定，可以利用以往一直使用的培养罐及活性污泥处理槽等。当对象化合物分解性微生物为需氧性微生物时，从控制运转经费、通过简单的运转管理即可高浓度地聚集对象化合物分解性微生物、效率良好地进行培养的观点出发，例如可以使用图1所示的反应槽。
图1所示的反应槽100由裂口形的气泡塔反应器构成。该反应器成为在培养槽1内组装有隔壁3及整流板4的构成，被隔壁3分成曝气部分2和沉降部分5。沉降部分5的底部变成锥形状的斜面6，形成下述的循环流：沿着斜面6移动、下降的固形物通过自底部的散气装置7流入的空气或因高氧分压气体8形成的上升流、在曝气部分2内的被整流板4划分的一侧部分处上升，在曝气部分2的上方与流入水9相接触、混合，在被整流板4划分的另一个的外处下降，到达底部的斜面6。
沉降部分5中，通过重力分离为固形物和澄清水，固形物沿着斜面6移动、返回至曝气部分2，澄清水作为处理水11自排出口10被排出。作为自曝气部分2的水面上方流入的流入水9，供给含对象化合物的合成培养基或废水等，进行培养。流入水9的供给可以是连续或断续的任一种。
在图1所示的反应槽中，使无机微粒载体在反应槽内流动，在其中聚集、载持生物质所含的微生物，进行培养。在培养时，向反应槽内供给培养基，将空气或高氧分压气体8自散气装置7供给，在曝气部分2内使含无机微粒载体的培养基循环，同时使无机微粒载体流动，使微生物聚集在无机微粒载体上。通过这种方法，具有控制运转经费、通过简单的运转管理即可效率良好地对高浓度聚集有对象化合物分解性微生物的微生物制剂进行培养的倾向，另外，由于提高了供给至槽内的氧的利用效率，因此还可以进行高负荷运转。
本实施方式中，利用后述方法可以确认载持于无机微粒载体的对象化合物分解性微生物的种类及相对于载持于无机微粒载体的微生物的存在比例。因此，在培养载持对象化合物分解性微生物的无机微粒载体的过程中，通过定期地研究对象化合物分解性微生物的存在比例，可以研究其变化。
载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体中的对象化合物分解性微生物的存在比例达到预定值时，可以判定为具有作为分解对象化合物的微生物制剂的预定功能，因而通过对载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体进行回收，能够获得本实施方式的微生物制剂。用于判定为具有作为微生物制剂的预定功能的对象化合物分解性微生物的存在比例可以根据对象化合物适当地设定。对象化合物选择氨时，例如硝化细菌的存在比例优选为5％以上、更优选为10％以上、进一步优选为15％以上。对象化合物选择(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸时，例如(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解性微生物的存在比例优选为5％以上、更优选为6％以上、进一步优选为7％以上。
对载持有培养至对象化合物分解性微生物的存在比例达到预定值的对象化合物分解性微生物的无机微粒载体进行回收，将其作为本实施方式的微生物制剂。本实施方式中，也可以仅对载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体进行回收，将其作为微生物制剂，还可以将含有载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体的培养基作为微生物制剂，也可以将自含有载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体的培养基、通过浓缩或干燥而将水分除去的产物作为微生物制剂。本实施方式的微生物制剂在保存及储存时，当所载持的微生物为需氧性微生物时，可以事先用高氧分压气体进行处理。
本实施方式的制造方法在培养过程中通过对象化合物分解性微生物的监视，对制造中的微生物制剂(载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体)所含对象化合物分解性微生物的存在比例变化进行研究，从而可以迅速地检测到增殖抑制等问题并进行应对，因而可以稳定且高效地制作微生物制剂。例如，当预测有对象化合物分解性微生物的增殖抑制时，通过采取对所添加的对象化合物的量进行调整等应对措施，可以适当地控制对象化合物分解性微生物的增殖。
＜对象化合物分解性微生物的存在比例的计算＞
对象化合物分解性微生物的存在比例通过包含以下工序的方法获得：对载持于无机微粒载体的微生物的16S rRNA基因的预定区域进行扩增，获得扩增产物的工序；和对扩增产物的碱基序列数据进行分析，根据各碱基序列数据间的同源性将所得碱基序列数据分为多个组，将具有各个组的碱基序列数据的微生物作为单一的种类，根据各个组的代表碱基序列数据决定对象化合物分解性微生物的种类，并根据所得碱基序列数据的数量计算全部微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例的工序。
对象化合物分解性微生物的16S rRNA基因例如可以使用自载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体直接制备的DNA。DNA的制备方法可以使用本领域技术人员公知的方法，例如可以使用市售的DNA提取试剂盒等。
对所制备的DNA所含16S rRNA基因的预定区域进行扩增，将所得扩增产物持续用于分析。16S rRNA基因中存在基因中含有在种间共通的序列的保守区域及根据种、属等不同而含有不同序列的可变区域(V1-V9)。被扩增的区域由于可通过一次扩增工序获得多种微生物来源的16S rRNA基因、及能够辨别多种微生物，因此优选是保守区域中所夹的可变区域。作为进行扩增的区域，例如可举出含V3-V4区域的范围。作为进行扩增的区域的碱基序列数，优选为100～1500个碱基、更优选300～800个碱基、进一步优选400～600个碱基。进行扩增的区域为这样的长度时，进行分析时，具有对多种微生物进行分类可获得充分可靠性的倾向。
作为对16S rRNA基因的预定区域进行扩增的方法，并无特别限定，可以使用本领域技术人员公知的方法。作为这样的方法，例如可举出聚合酶链反应法(PCR法)。
使用PCR法进行扩增时，从对载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体所含的多种微生物进行检测的观点出发，所使用的引物优选是按照在严格的条件下，与正向引物及反向引物一起、与16S rRNA基因的夹持可变区域的保守区域发生杂交的方式设计的通用引物。
正向引物及反向引物具有作为在严格的条件与16S rRNA基因的保守区域发生杂交的碱基序列的通用引物序列。作为通用引物序列的长度，优选为15～40个碱基、更优选为15～30个碱基、进一步优选为15～25个碱基。
本说明书中“严格的条件”是指与目标序列具有同源性的核苷酸链的互补链优先地与目标序列发生杂交，而没有同源性的核苷酸链的互补链实质上不发生杂交的条件。严格的条件是序列依赖性的，随各种情况而不同。更长的序列在更高的温度下特异性地发生杂交。一般来说，严格的条件选择比规定的离子强度及pH下的特定序列的热熔融温度(Tm)低约5℃的条件。Tm是指在规定的离子强度、pH及DNA浓度下，与目标序列互补的核苷酸的50％以平衡状态与目标序列发生杂交的温度。
作为对扩增产物的碱基序列进行分析的方法，例如可举出利用测序仪进行的序列分析。作为测序仪，从不对扩增16S rRNA基因的预定区域而得到的扩增产物(扩增子)进行分离、即可同时且包罗性地对各种微生物进行分析的观点出发，优选第二代测序仪。例如可举出GS FLX+System(Roche公司制)、MiSeq(Illumina公司制)等。
测序仪使用GS FLX+System(Roche公司制)时，通用引物除了通用引物序列之外，还可以具有特定的序列。例如，正向引物按照从5’末端开始为序列分析中的序列确定所需的接头序列、各检体所固有的条形码序列、通用引物序列的方式进行设计，反向引物按照从5’末端开始为序列分析中的序列确定所需的接头序列、通用引物序列的方式进行设计。条形码序列是指用于检体间的识别、同时对应于供至测序仪的检体数而随意设计的碱基序列。通过使用这种具有条形码序列的引物，可以通过1次序列分析对多个检体进行分析。接头序列及条形码序列可以使用厂商指定产品。条形码序列的长度可以根据碱基序列分析中所用检体数进行设计，例如可以是8～15个碱基。
以下，对利用GS FLX+System获得的碱基序列数据的分析方法进行说明，但本发明并不限定于此。
通过序列分析获得的碱基序列数据根据碱基序列数据所含的检体固有的条形码序列，将各序列分到各个固有检体中。进而，通过碱基序列数据的序列长、与通用引物序列错配的碱基数、利用测序仪所带的特性程序算出的进行了序列确定的碱基序列数据的平均特性值等对所分的碱基序列数据进行分选，获得高精度的碱基序列数据。
利用OTU(操作分类单位，Operational Taxonomic Unit)分析，根据碱基序列数据间的同源性将所得的高精度碱基序列数据分为多个组。用于分至相同组的碱基序列数据间的同源性可以根据所要求的可靠性进行设定，可以是95％以上、也可以是97％以上、还可以是99％以上。作为用于进行OTU分析的软件，例如可举出Uclust(http://drive5.com/usearch/manual/uclust_algo.html)、UPARSE(http://drive5.com/usearch/manual/uparse_pipeline.html)、USEARCH(http://www.drive5.com/usearch)等。
OTU分析的结果中，具有同组碱基序列数据的微生物是单一种类的微生物。这里所说的“种类”包含分类学上的科、属、种。利用DDBJ、GenBank、RDP、Greengenes等数据库对各个组的代表碱基序列数据进行同源性检索，将具有同源性最高的碱基序列数据的微生物鉴定为具有代表碱基序列数据的微生物。由此，可以对含有所确定的代表碱基序列数据的组的微生物种类进行鉴定。还可以在对各个组的微生物的种类进行鉴定后，根据数据库等的信息，确定哪个组的微生物是对象化合物分解性微生物。本说明书中，代表碱基序列数据表示与属于各组的任意碱基序列数据均显示阈值以上的同源性的碱基序列数据。
在OTU分析的结果中，组的数量可以认为在能够检测的范围内、与构成该微生物群的微生物种类的数量相同。由分为各组的碱基序列数据的数量，可以计算所得碱基序列数据数整体中的比例，即占微生物群整体的该组微生物种的存在比例。通过利用上述方法，由代表碱基序列数据确定对象化合物分解性微生物的组，可以算出其存在比例。
＜化合物分解方法＞
本实施方式的微生物制剂可以用于对象化合物的分解。作为对象化合物的分解方法，例如可举出在含对象化合物的废液等中添加本实施方式的微生物制剂，进行搅拌的方法。此时，所添加的微生物制剂的量可以根据对象化合物的种类、反应槽的容量、载持于微生物制剂的对象化合物分解性微生物的存在比例等来适当设定。
＜微生物制剂的评价方法＞
本实施方式的微生物制剂的评价方法具有以对象化合物分解性微生物的存在比例为指标、评价微生物制剂的工序。对象化合物分解性微生物的存在比例可以使用上述的方法。
作为本实施方式的评价方法中使用的微生物制剂，例如可举出制造后保存的微生物制剂。
微生物制剂的评价通过计算微生物制剂所含微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例来进行。作为评价方法，例如在对刚制造后的微生物制剂及保存中的微生物制剂所含的对象化合物分解性微生物的存在比例进行比较，当保存中的微生物制剂所含的对象化合物分解性微生物的存在比例减少时，可以判定保存中的微生物制剂的分解活性降低。
实施例
[实施例1]
(材料)
利用以下所示的方法制备培养基的制造中所用成分的浓缩液。将(NH4)2SO4 35.4g和Na2HPO4 7.7g溶解在纯水500mL中，制成氨态氮为15000mg/L的氮磷溶液。将KCl 110g和CaCl2·2H2O 50g和CoCl2 1mg溶解在纯水1000mL中，制成无机盐溶液1。将NaMoO4·2H2O 5mg溶解在纯水1000mL中，制成无机盐溶液2。将MgSO4·7H2O 85g、FeSO4·7H2O8.5g、MnSO4·5H2O 2g、ZnSO4 100mg和CuSO4·5H2O 100mg溶解在纯水1000mL中，制成无机盐溶液3。供给培养中的培养基如下制造：将(NH4)2SO4 0.2g和Na2HPO4 1.54g溶解在纯水1000mL中，添加1ml无机盐溶液1、1ml无机盐溶液2、1ml无机盐溶液3，从而制造。培养基由于在培养期间连续地供给，因此适当地制造必要量。活性污泥混悬液如下制备：从化学工厂的曝气槽采集活性污泥，按照活性污泥浓度达到5000mg-MLSS/L的方式，使用纯水进行制备。MLSS是指浮游固形物(Mixed liquor Volatile Suspended Solid)。MLSS根据《下水试验方法》上卷(2012年度版，公益社团法人日本下水道协会著)(下水試験方法上巻―2012年度版―公益社団法人日本下水道協会著)中记载的方法进行测定。无机微粒载体分散液通过将在纯水800ml中添加粉煤灰500g混合而成的混悬液与在纯水600ml中溶解有Sumifloc FA-40H(MTAquapolymer公司制)60g的溶液混合来制造。
(微生物制剂的制造)
使用具备曝气部和用于进行固液分离的沉降部的气升式连续反应槽，进行微生物制剂的制造。在反应槽中加入活性污泥混悬液10L、氮磷溶液10mL、10ml无机盐溶液1、10ml无机盐溶液2、10ml无机盐溶液3、无机微粒载体分散液1.4L，利用气动提升机进行搅拌、培养。混合有这些物质的培养基使用10质量％H3PO4溶液及10质量％Na2CO3溶液，控制pH在7.5附近。水温控制在25℃。以下将反应槽中的培养基称作培养液。
培养开始后，在测定培养液中的氨态氮的浓度、氨态氮消失后，开始供给用培养基的供给。培养液中的氨态氮浓度及培养基的流速根据培养液中的氨浓度、亚硝酸浓度、硝酸浓度及硝化细菌的存在比例的测定结果，按照不引起硝化细菌的增殖抑制的方式进行调整，培养液中的氨态氮浓度慢慢地提高。
将培养后第36日的培养液从反应槽的曝气部回收，将其作为硝化细菌经高密度化的微生物制剂。
(氨态氮的测定)
从反应槽的沉降部回收活性污泥经沉降分离的培养液，利用孔径为0.45μm、直径为25mm的注射器式滤器(Advantech公司制)对其进行过滤，使用氨态氮检测试剂盒及分光光度计Spectroquant NOVA60(Merck Millipore公司制)进行测定。
(氨态氮除去率的计算)
由从反应槽的沉降部回收活性污泥经沉降分离的培养液时的培养液所含的氨态氮浓度及供给用培养基所含的氨态氮浓度，计算氨态氮除去率。
【数学式1】
氨态氮除去率(％)＝[1－培养液中的氨态氮浓度(mg-N/L)/供给用培养基中的氨态氮浓度(mg-N/L)]×100
(氮处理能力的计算)
由从反应槽的沉降部回收活性污泥经沉降分离的培养液时的培养液所含的氨态氮浓度、供给用培养基所含的氨态氮浓度、供给用培养基的流量及反应槽曝气部的培养液容量，计算氮处理能力。
【数学式2】
氨处理能力(mg-N/L·hr)＝[供给用培养基中的氨态氮浓度(mg-N/L)－培养液中的氨态氮浓度(mg-N/L)]/(反应槽曝气部的培养液容量(mL)/供给用培养基的流量(mL/分钟)/60分钟)
(微生物种类的确定及各个微生物的存在比例的计算)
·DNA的制备
硝化细菌的检测及其存在比例的计算如下求得：对培养中的无机微粒载体上载持了活性污泥所固着的对象化合物分解性微生物的无机微粒载体进行回收，根据使用了其中所含微生物的16S rRNA基因的碱基序列数据，从而求得。载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体中的微生物的DNA利用以下的方法进行制备。
对含有载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体的培养基1.5mL进行回收，在室温下进行离心分离(13000rpm、5分钟)。除去上清之后，添加1mL的灭菌生理盐水，颠倒混合5秒钟，在室温下进行离心分离(13000rpm、5分钟)。将上清除去后，添加Lysisbuffer(AMR公司制)300μL，充分地混合。将该混悬液添加至装有珠粒的管(Easy Extractfor DNA(AMR公司制))中之后，利用涡流混合器搅拌粉碎2分钟。在粉碎液中添加300μL的TE溶液(10mM Tris、1mM EDTA、pH为8.0)(以下称作TE溶液)，在4℃下进行离心分离(13000rpm、5分钟)。之后，将上清液450μL放入新的管中，向其中加入600μL的苯酚混合溶液(Easy Extract for DNA附带(AMR公司制))，利用涡流混合器搅拌1分钟后，在4℃下进行离心分离(13000rpm、5分钟)。对上清300μL进行回收，移至新的管中(1.5mL)，向其中加入1200μL的乙醇(99.5％)，在4℃下进行离心分离(13000rpm、5分钟)。将上清除去后，在管中添加1000μL的冷乙醇(70％)，在4℃下进行离心分离(13000rpm、5分钟)，对所得DNA团块进行真空干燥。在干燥的DNA团块中添加150μL的TE溶液，将其作为载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体中的微生物的DNA溶液。
·16S rRNA基因的扩增
对所制备的DNA溶液中的双链DNA浓度进行测定，以基于该测定值计算的50ng的DNA为模板，使用通用引物对(正向引物及反向引物)，对16S rRNA基因的V3-V4区域进行PCR扩增。PCR使用Takara-bio公司制的“Premix Ex Taq Hot Start Version”(注册商标)，制备含各引物50pmol的反应液50μL，在94℃下进行2分钟的预热后，分别在98℃×10秒钟、50℃×30秒钟、72℃×80秒钟的条件下进行改性、退火、延长，对其反复25个循环。通过使用了通用引物对的PCR，对载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体所含的各种微生物的DNA片段(约570bp)进行扩增。
正向引物使用从5’末端侧开始具有由序列号1所记载的碱基序列构成的接头A序列、由10个碱基构成的条形码序列、由序列号2所记载的碱基序列构成的通用引物序列者。反向引物使用从5’末端侧开始具有由序列号3所记载的碱基序列构成的接头B序列、由序列号4所记载的碱基序列构成的通用引物序列者。
·序列分析
利用DNA清除剂(和光纯药公司制)对经扩增的PCR产物进行处理，将DNA纯化。纯化DNA利用200μL的TE溶液进行洗脱、回收。将所回收的精制DNA溶液供至琼脂糖凝胶电泳，各个凝胶地将在约570bp的位置检测到的条带切出。从所切出的凝胶、使用MinElute GelExtraction Kit(QIAGEN公司制)提取DNA，将其作为供至测序仪的序列用样品。
将上述序列用样品供至GS FLX+System测序仪(Roche公司制)，进行序列分析。测序的条件、工序等根据厂家预定的方案进行。对于所得的各碱基序列的数据，根据各碱基序列数据所含的样品固有的条形码序列，将各碱基序列数据分类为各个固有的样品。之后，将碱基序列数据的序列长小于200个碱基且1000个碱基以上、与通用引物序列(正向引物)错配1个碱基以上、以及使用测序仪所附带的特性程序确定的经过序列确定的碱基序列数据的平均特性值为25以下的序列数据除去，提取高精度碱基序列数据。
·OTU分析
将上述高精度碱基序列数据供至OTU分析。OTU分析中，将具有95％以上同源性的各序列数据之间分类为同一组，形成多个组。OTU分析使用Uclust进行。由利用OTU分析获得的信息，进行载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体所含的微生物的种类的确定及各个微生物的存在比例的计算。
(结果)
将对载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体培养数天后的氨态氮除去率、氮处理能力及载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体所含的硝化细菌(亚硝化单胞菌属)、亚硝酸氧化细菌(硝化菌属、硝化螺菌属)的存在比例一并示于表1中。通过载持有培养中的对象化合物分解性微生物的无机微粒载体所含微生物的基因分析信息，可以经时地测定载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体中所含硝化细菌的存在比例的变化。另外也显示，随着各种硝化细菌的增加，载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体的氮处理能力增加。
表1
[实施例2]
(材料)
利用以下所示的方法制备培养基的制造中所用成分的浓缩液。将MgSO4·7H2O100g溶解在纯水1000mL中，制成无机盐溶液A。将Na2HPO4 4.152g、NaH2PO4 2.244g和(NH4)2SO4 1.2g溶解在纯水300mL中，制成无机盐溶液B。使用将(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸(纯度为约85质量％)1.18g溶解在纯水100mL中得到的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸溶液(10g/L)。无机微粒载体分散液通过在纯水250ml中添加活性污泥焚烧灰50g进行混合、混悬，从而制造。活性污泥混悬液直接使用从化学工厂的曝气槽采集活性污泥所得的物质。供至培养中的培养基如下制造：将(NH4)2SO4 1.0g、Na2HPO4 1.3g和NaH2PO4 0.9g溶解在纯水1000mL中，添加(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸溶液4.0mL及1ml无机盐溶液1、1ml无机盐溶液2、1ml无机盐溶液3，从而制造。培养基由于在培养期间中连续地供给，因此适当地制造必要量。另外，作为培养开始时的碳源，使用以7：3(v/v)左右的比例含有甲醇和水的工厂来源的副产品油。
(微生物制剂的制造)
使用具备曝气部(容量为1L)及沉降部(容量为0.4L)的气升式连续反应槽，进行微生物制剂的制造。在反应槽中加入活性污泥混悬液570mL、无机盐溶液A4.9mL、无机盐溶液B300mL、工厂来源的副产品油13.2μL、(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸溶液9.876mL、无机微粒载体分散液250mL和纯水70mL，制备培养基。利用气动提升机对该培养基进行搅拌、培养。培养基使用10质量％Na2CO3溶液，将pH控制在6.9附近。水温控制在25℃。以下将反应槽中的培养基称为培养液。
培养开始后，测定培养液中的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸浓度，在可见(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸的浓度显著减少后，连续地供给含有预定浓度的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸的培养基，进行连续培养。追加的培养基所含的盐类随着(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸添加量而增加。为了掌握载持有培养中的对象化合物分解性微生物的无机微粒载体所含微生物的变迁，对载持有培养中的对象化合物分解性微生物的无机微粒载体所含微生物的DNA随时进行提取。
((S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸浓度的测定)
培养基中的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸浓度通过在下述条件下将培养基供至HPLC来计算。
·装置：LC-10A(岛津制作所公司制)
·色谱柱：SUMIPAX ODS A-211 4.6mm×250mm、5μ(住化分析传感器公司制)
溶剂：A液0.01％TFA水溶液、B液乙腈、A液：B液＝4：6
流速：1.0mL/分钟
烘箱温度：40℃
检测器：UV 220nm
样品注入量：10μL
((S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去率的计算)
由从反应槽的沉降部回收活性污泥经沉降分离的培养液时的培养液中所含的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸浓度、供给用培养基所含的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸浓度，计算(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去率。
【数学式3】
(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去率(％)＝[1－(培养液中的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸浓度(mg/mL)/(供给用培养基中的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸浓度(mg/mL))]×100
((S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸处理能力的计算)
由从反应槽的沉降部回收活性污泥经沉降分离的培养液时的培养液中所含的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸浓度、供给用培养基所含的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸浓度、供给用培养基的流量、反应槽曝气部的培养液容量，计算(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸处理能力。
【数学式4】
((S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸处理能力＝(供给用培养基中的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸浓度(mg/mL)－培养基中的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸浓度(mg/mL))/(反应槽曝气部的培养液容量/供给用培养基的流量/60分钟)
(微生物种类的确定及各个微生物的存在比例的计算)
(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解菌的检测及其存在比例的计算通过对培养中的无机微粒载体上载持有活性污泥所固着的对象化合物分解性微生物的无机微粒载体进行回收，基于使用了其DNA的基因分析信息来求得。载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体中的微生物的基因分析信息通过与实施例1同样的方法获得。
(结果)
将对载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体培养了各天数之后的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去率、(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸处理能力及载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体所含发(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解性菌(鞘脂单胞菌科(phingomonadaceae)的存在比例一并示于表2中。通过载持有培养中的对象化合物分解性微生物的无机微粒载体所含微生物的基因分析信息，可以经时地测定(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解性菌的存在比例的变化。另外也显示，随着鞘脂单胞菌科细菌的增加，载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸处理能力增加。
表2
[实施例3]
培养基的制造中使用的无机盐溶液与实施例1相同，制成无机盐溶液1、无机盐溶液2、无机盐溶液3。(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸溶液使用与实施例2相同的溶液。流入水如下制造：将(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸溶液1mL、(NH4)2SO4 1g、Na2HPO4 1.298g、NaH2PO4 0.912g溶解在纯水1000mL中，添加1ml无机盐溶液1、1ml无机盐溶液2、1ml无机盐溶液3，从而制造。流入水由于在(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去反应期间中连续地供给，因此适当地制造必要量。活性污泥混悬液直接使用从化学工厂的曝气槽中采集活性污泥所得到者。
((S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去反应)
使用具备曝气部(容量为3L)及沉降部(容量为1L)的气升式连续反应槽，进行(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去反应。(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去反应在没有(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解性微生物制剂的条件(A系列)和具有(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解性微生物制剂的条件(B系列)这2种条件下进行。向反应槽中添加流入水，添加活性污泥混悬液，按照活性污泥浓度达到2408mg-MLSS/L的方式进行调整，制成培养液。MLSS是指浮游固形物(Mixed liquor Volatile Suspended Solid)。仅在B系列中添加通过离心分离去除了上清的实施例2所制造的、培养后第54天的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解性微生物制剂459mL，制成培养液。对A系列及B系列的培养液进行搅拌，开始反应。流入水以1mL/分钟的速度进行添加。流入水使用10质量％Na2CO3溶液、将pH控制在7附近。水温控制在25℃。微生物制剂中的微生物的基因分析信息通过与实施例1同样的方法获得。
(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去率及(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解性微生物的测定与实施例2所记载的方法同样地进行。
(结果)
将A系列及B系列中的流入水的(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去率及(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解性微生物的比例一并示于表3。B系列中，由于在反应开始时添加(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解性微生物制剂，因此从第4.6天时开始，(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解性微生物的比例高、(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去率也高。另一方面，A系列与B系列相比，(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸分解性微生物的比例上升慢、(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸除去率也低。
表3
符号说明
1 培养槽
2 曝气部分
3 隔壁
4 整流板
5 沉降部分
6 斜面
7 散气装置
8 空气或高氧分压气体
9 流入水
10 排出口
11 处理水
100 反应槽

Claims (6)

1.一种载持对象化合物分解性微生物的微生物制剂的制造方法，其具备：
在含有对象化合物的培养基中添加含有所述对象化合物分解性微生物的生物质和无机微粒载体，使所述生物质所含的微生物载持在所述无机微粒上，一边监视载持于所述无机微粒载体的微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例、一边进行培养的工序；和
在对象化合物分解性微生物的存在比例达到预定值之后，对载持有对象化合物分解性微生物的无机微粒载体进行回收，获得微生物制剂的工序；
其中，所述对象化合物分解性微生物的存在比例通过包含以下工序的方法获得：
对载持于所述无机微粒载体的微生物的16S rRNA基因的预定区域进行扩增，获得扩增产物的工序；和
对所述扩增产物的碱基序列数据进行分析，根据各碱基序列数据间的同源性将所得碱基序列数据分为多个组，将具有各个组的碱基序列数据的微生物作为单一的种类，根据各个组的代表碱基序列数据确定对象化合物分解性微生物的种类，并根据所得碱基序列数据的数量计算全部微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例的工序。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述对象化合物为(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述对象化合物为氨。
4.一种微生物制剂，其是通过权利要求1～3中任一项所述的制造方法制造的。
5.一种化合物分解方法，其使用了权利要求4所述的微生物制剂。
6.权利要求4所述的微生物制剂的评价方法，其具备以所述微生物制剂所含微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例为指标，对所述微生物制剂进行评价的工序；
其中，所述对象化合物分解性微生物的存在比例通过包含以下工序的方法获得：
对所述微生物制剂所含微生物的16S rRNA基因的预定区域进行扩增，获得扩增产物的工序；和
对所述扩增产物的碱基序列数据进行分析，根据各碱基序列数据间的同源性将所得碱基序列数据分为多个组，将具有各个组的碱基序列数据的微生物作为单一的种类，根据各个组的代表碱基序列数据确定对象化合物分解性微生物的种类，并根据所得碱基序列数据的数量计算全部微生物中的对象化合物分解性微生物的存在比例的工序。
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