KR20170131697A - 미생물 제제의 제조 방법 및 미생물 제제 - Google Patents

미생물 제제의 제조 방법 및 미생물 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 미생물 제제의 제조 방법은, 대상 화합물을 포함하는 배지 중에서, 대상 화합물 분해성 미생물을 포함하는 바이오매스와, 무기 미립자 담체를 첨가하고, 바이오매스에 포함되는 미생물을 무기 미립자에 담지시켜, 무기 미립자 담체에 담지된 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 감시하면서, 배양하는 공정과, 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이 소정의 값에 도달한 후, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 회수하여, 미생물 제제를 얻는 공정을 구비하고, 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이, 무기 미립자 담체에 담지된 미생물의 16S rRNA 유전자의 소정의 영역을 증폭하여 증폭 산물을 얻는 공정과, 증폭 산물의 염기 서열 데이터를 해석하고, 얻어진 염기 서열 데이터를 각 염기 서열 데이터간의 상동성에 기초하여 복수의 그룹으로 나누어, 각각의 그룹의 염기 서열 데이터를 갖는 미생물을 단일의 종류로 하고, 각각의 그룹의 대표 염기 서열 데이터에 기초하여, 대상 화합물 분해성 미생물의 종류를 결정하고, 얻어진 염기 서열 데이터의 수에 기초하여, 모든 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 산출하는 공정을 포함하는 방법에 의해 얻어진다.

Description

미생물 제제의 제조 방법 및 미생물 제제
본 발명은, 미생물 제제의 제조 방법 및 미생물 제제에 관한 것이다.
배수 처리에 있어서, 대상 화합물을 배수로부터 제거하는 방법으로서는, 연소 처리 방법 또는 대상 화합물 분해성 미생물을 이용한 생물학적 처리 방법 등이 이용된다. 대상 화합물 분해성 미생물을 얻는 방법으로서는, 대상 화합물을 분해하는 미생물을 집적 배양하고, 그 분해 미생물을 특정, 단리하여 순수 배양하는 방법(단리 배양 방법)이 알려져 있다. 또한, 활성 오니와 같은 혼합 미생물계의 경우, 대상 화합물을 저농도로 영양원으로서 주고, 서서히 농도를 높여 가는 것에 의해 활성 오니를 대상 화합물에 길들게 하여, 분해능을 높이는 순양(馴養)이라 불리는 방법(순양 방법)이 알려져 있다.
그렇지만, 단리 배양 방법에서는, 분해 미생물의 단리에 장시간을 요하고, 적합한 미생물도 인공적으로 배양할 수 있는 것에 한정되며, 더욱이 순수 배양하기 위한 제조 비용이 높다고 하는 과제가 있다. 한편, 순양 방법은, 염가이고 대량으로 분해 미생물을 배양할 수 있지만, 순양에 장시간을 요한다고 하는 과제가 있다.
그 외에 대상 화합물 분해 미생물을 고밀도화하는 방법으로서는, 예를 들어, 특허문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이, 질화 세균을 고밀도화하여, 우수한 물성을 갖는, 미립자 개체와 미생물을 응집 조립화(造粒化)하는 것에 의한 미생물 제제의 제조 방법이 개시되어 있다. 이 미생물 제제는, 연속 배양함으로써 효율적으로 제조할 수 있고, 보존도 할 수 있기 때문에, 배수의 효율적인 처리에 유용하다.
일본 특허공개 2003-274937호 공보
그렇지만, 특허문헌 1에 기재된 방법은, 질소 처리 능력을 지표로 하여 질화 세균을 고밀도화하는 것이 가능하지만, 조립화 중 및 조립화 후의 질화 세균군의 종류, 존재량을 파악할 수 없다. 질소 이외의 대상 화합물의 처리에 있어서도 마찬가지의 것이 생각된다. 이와 같은 방법에서는, 대상 화합물의 분해성만을 지표로 했을 경우, 대상 화합물 분해성 미생물의 존재량 및 존재 비율은 파악되어 있지 않기 때문에, 조립화 공정에서 첨가하는 대상 화합물의 농도가 지나치게 높은 것에 의한 대상 화합물 분해 미생물군의 증식 저해, 또한 대상 화합물의 분해 중간물의 축적에 의한 대상 화합물 분해 미생물의 증식 저해 등을 예측하는 것이 곤란하다. 한편, 근년의 유전자 해석 기술의 진보에 의해, 활성 오니 등의 복합 미생물계로부터, 미생물을 단리하지 않고 존재하는 미생물의 종류 및 존재량을 파악하는 것이 가능하게 되어 왔다. 그러나, 그 기술의 활용은, 현재 상태로서는 단순한 측정의 범위를 벗어나 있지 않고 한정적이기 때문에, 유전자 해석 기술을 미생물 제제의 제조 방법에 적응시키기 위한 기술 확립이 요망되고 있었다.
본 발명은, 상기 사정에 비추어, 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 감시함으로써, 대상 화합물 분해성 미생물을 소망하는 밀도로 담지하는 미생물 제제를 안정적이고 또한 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 상기 제조 방법에 의해 제조된 미생물 제제, 해당 미생물 제제를 이용한 화합물 분해 방법, 및 해당 미생물 제제의 평가 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 제조 중의 미생물 제제에 담지되는 미생물을 망라적으로 해석한 유전자 해석 정보에 기초하여, 미생물 제제에 담지되는 대상 화합물 분해성 미생물을 감시함으로써, 미생물 제제를 효과적으로 제조하는 방법을 새롭게 확립하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 예를 들어 이하의 [1]∼[6]에 관한 것이다.
[1] 대상 화합물 분해성 미생물을 담지하는 미생물 제제의 제조 방법으로서, 대상 화합물을 포함하는 배지 중에서, 대상 화합물 분해성 미생물을 포함하는 바이오매스와, 무기 미립자 담체를 첨가하고, 바이오매스에 포함되는 미생물을 무기 미립자에 담지시켜, 무기 미립자 담체에 담지된 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 감시하면서, 배양하는 공정과, 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이 소정의 값에 도달한 후, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 회수하여, 미생물 제제를 얻는 공정을 구비하고, 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이, 무기 미립자 담체에 담지된 미생물의 16S rRNA 유전자의 소정의 영역을 증폭하여 증폭 산물을 얻는 공정과, 증폭 산물의 염기 서열 데이터를 해석하고, 얻어진 염기 서열 데이터를 각 염기 서열 데이터간의 상동성에 기초하여 복수의 그룹으로 나누어, 각각의 그룹의 염기 서열 데이터를 갖는 미생물을 단일의 종류로 하고, 각각의 그룹의 대표 염기 서열 데이터에 기초하여, 대상 화합물 분해성 미생물의 종류를 결정하고, 얻어진 염기 서열 데이터의 수에 기초하여, 모든 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 산출하는 공정을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 제조 방법.
[2] 대상 화합물이 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산인, [1]에 기재된 제조 방법.
[3] 대상 화합물이 암모니아인, [1]에 기재된 제조 방법.
[4] [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 제조된, 미생물 제제.
[5] [4]에 기재된 미생물 제제를 이용한, 화합물 분해 방법.
[6] [4]에 기재된 미생물 제제의 평가 방법으로서, 미생물 제제에 포함되는 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 지표로 하여 미생물 제제를 평가하는 공정을 구비하고, 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이, 미생물 제제에 포함되는 미생물의 16S rRNA 유전자의 소정의 영역을 증폭하여 증폭 산물을 얻는 공정과, 증폭 산물의 염기 서열 데이터를 해석하고, 얻어진 염기 서열 데이터를 각 염기 서열 데이터간의 상동성에 기초하여 복수의 그룹으로 나누어, 각각의 그룹의 염기 서열 데이터를 갖는 미생물을 단일의 종류로 하고, 각각의 그룹의 대표 염기 서열 데이터에 기초하여, 대상 화합물 분해성 미생물의 종류를 결정하고, 얻어진 염기 서열 데이터의 수에 기초하여, 모든 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 산출하는 공정을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 평가 방법.
본 발명에 의하면, 미생물 제제에 담지되는 미생물의 종류를 검출하고, 그 존재 비율을 산출한 결과에 기초하여, 대상 화합물 분해성 미생물을 감시함으로써, 대상 화합물 분해성 미생물을 소망하는 밀도로 담지하는 미생물 제제를 안정적이고 또한 효율적으로 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은, 상기 제조 방법에 의해 제조된 미생물 제제, 이 미생물 제제를 이용한 화합물 분해 방법, 및 이 미생물 제제의 평가 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 실시형태의 미생물 제제를 제조하는 반응조의 개략 종단면도이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태(이하, 「본 실시형태」라고 한다.)에 대해 상세하게 설명한다. 한편, 본 발명은, 이하의 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
＜미생물 제제의 제조 방법＞
본 실시형태의 대상 화합물 분해성 미생물을 담지하는 미생물 제제의 제조 방법은, 대상 화합물을 포함하는 배지 중에서, 대상 화합물 분해성 미생물을 포함하는 바이오매스와, 무기 미립자 담체를 첨가하고, 바이오매스에 포함되는 미생물을 무기 미립자에 담지시켜, 무기 미립자 담체에 담지된 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 감시하면서, 배양하는 공정과, 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이 소정의 값에 도달한 후, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 회수하여, 미생물 제제를 얻는 공정을 구비한다.
본 실시형태에 따른 대상 화합물로서는, 미생물에 의해 분해되는 화합물이면 특별히 제한되는 것은 아니지만, 배수 중에 포함되는 것이 바람직하다. 이와 같은 화합물로서는, 예를 들어, 암모니아, 아질산, 벤젠, 톨루엔, 스타이렌, 자일렌, 카테콜, 프로토카테큐산, 프로토카테큐알데하이드, 2-페닐뷰티르산, 2-아이소프로필페닐뷰티르산, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산, 벤조산, 벤즈알데하이드 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 배수로부터의 제거가 요망되고 있는 암모니아 또는(S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산이 바람직하다.
대상 화합물을 포함하는 배지로서는, 대상 화합물을 포함하고, 또한 대상 화합물 분해성 미생물을 배양할 수 있는 것이면, 특별히 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 배지로서는, 각 염류, pH 등을 인공적으로 조제한 배지여도 되고, 하수 또는 폐수여도 된다. 배지에 포함되는 대상 화합물의 농도는, 대상 화합물 분해성 미생물을 순양하는 관점에서, 초기 농도는 낮게 설정하고, 배양 과정에서 점차 높게 해 나가는 것이 바람직하다. 초기 농도는, 대상 화합물마다, 적절히 설정할 수 있다.
대상 화합물 분해성 미생물이란, 대상 화합물을 영양원으로서 분해하여, 이용할 수 있는 미생물이다. 본 실시형태에 따른 대상 화합물 분해성 미생물은, 대상 화합물의 선택에 따라, 적절히 선택된다. 대상 화합물로 암모니아를 선택했을 경우는, 예를 들어, 질화 세균(Nitrosomonas속 등의 암모니아 산화 세균, Nitorobacter속, Nitrospira속 등의 아질산 산화 세균 등)을 들 수 있다. 대상 화합물로 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산을 선택했을 경우는, 예를 들어, Sphingomonadaceae과 세균 등을 들 수 있다.
대상 화합물 분해성 미생물을 포함하는 바이오매스로서는, 예를 들어, 활성 오니, 토양, 바이오필름 등의 마이크로플로라 등을 들 수 있고, 오수의 정화를 위해 산업상 넓게 이용되고 있다고 하는 관점에서, 활성 오니가 바람직하다. 활성 오니로서는, 하수 오니, 산업 배수 처리장 활성 오니, 분뇨 처리장 오니 등을 들 수 있다.
무기 미립자 담체로서는, 재질이 금속 및 그의 무기염류 또는 산화물이어도 되고, 탄소를 함유하는 것이어도 화학적으로 무기물로 분류되는 것이어도 되며, 또는 유기태 탄소의 함유량이 1% 정도 미만인 순물질 또는 혼합물이어도 된다. 무기 미립자 담체로서는, 예를 들어, 알루미나(산화알루미늄), 하이드록시아파타이트(칼슘 인산 하이드록사이드) 등의 공업 제품(규격외품, 부산물, 폐품 등을 포함한다), 활성 오니 등의 유기성 폐기물의 소각회 및 화력 발전 또는 코크스로의 타고 남은 찌꺼기인 석탄 소각회 등을 들 수 있다.
무기 미립자 담체로서는, 그 중에서도, 염가이고, 간편한 조작으로 얻을 수 있으며, 또한 미생물의 활성 발현이 단기간에 생긴다고 하는 관점에서, 석탄 소각회가 바람직하다. 석탄 소각회 중에서도, 클링커 애쉬 또는 플라이 애쉬가 바람직하고, 사분(篩分) 등을 행하지 않아도 중심 입자경이 100μm 이하이기 때문에, 플라이 애쉬가 보다 바람직하다. 무기 미립자 담체로서는, 클링커 애쉬도 분쇄하여 중심 입자경을 조정함으로써, 플라이 애쉬와 마찬가지로 이용할 수 있다. 클링커 애쉬 또는 플라이 애쉬의 조성은, 특별히 제한되는 것은 아니다.
무기 미립자 담체의 중심 입자경은, 1μm∼100μm가 바람직하고, 4μm∼75μm가 보다 바람직하고, 13μm∼25μm가 더욱 바람직하다. 중심 입자경이 이와 같은 범위인 경우, 대상 화합물 분해성 미생물을 포함하는 바이오매스 및 무기 미립자 담체를 혼합했을 때에, 양자가 응집하기 쉬워져, 적합한 양의 대상 화합물 분해성 미생물을 포함하는 바이오매스가 무기 미립자 담체에 담지되기 쉬워지는 경향이 있다.
무기 미립자 담체의 비중은, 특별히 제한되지 않지만, 1.2∼3.5가 바람직하다.
무기 미립자 담체는, 배양 초기의 제품 비율을 향상시키는 것을 목적으로 하여, 필요에 따라서, 각종 응집제를 이용하여 응집시켜도 된다. 응집제로서는, 예를 들어, 비이온성, 양이온성, 음이온성의 고분자 응집제 등을 들 수 있다.
본 실시형태에 따른 배양 방법으로서는, 회분, 반회분, 유가(流加), 연속의 어느 방식을 이용해도 된다. 배양 방법으로서는, 예를 들어, 증식이 늦고 균체 수율이 낮은 미생물을 효율적으로 조제한다고 하는 관점에서, 일본 특허공개 평9-187272호 공보에 기재되는 바와 같이, 미생물을 배양하는 용기(이하, 반응조라고 한다)에 공급하는 대상 화합물의 농도를 배양 시간의 경과에 수반하여, 대수(對數) 증가시키는 연속 배양 방식을 이용해도 된다.
본 실시형태에 있어서, 반응조의 사양에 대해서는 특별히 제한되는 것은 아니고, 종래 이용되어 온 배양 탱크 및 활성 오니 처리조 등을 이용할 수 있다. 대상 화합물 분해성 미생물이 호기성 미생물인 경우, 운전 경비를 억제하고, 간편한 운전 관리로, 대상 화합물 분해성 미생물을 고농도로 집적하여 효율 좋게 배양할 수 있다고 하는 관점에서, 예를 들어, 도 1에 나타나는 것과 같은 반응조를 이용해도 된다.
도 1에 나타내는 반응조(100)는 스플릿형의 기포탑 반응기로 구성된다. 이 반응기는, 배양조(1) 내에 격벽(3) 및 정류판(4)을 짜넣은 구조로 되어 있고, 격벽(3)에 의해 폭기(曝氣) 부분(2)과 침강 부분(5)으로 칸막이되어 있다. 침강 부분(5)의 저부는 테이퍼상의 슬로프(6)로 되어 있어, 여기를 타고 하강해 온 고형물이 저부의 산기 장치(7)로부터 유입된 공기 또는 고산소 분압 가스(8)에 의한 상승류에 의해 폭기 부분(2) 내의 정류판(4)으로 구획된 편측 부분을 상승하고, 폭기 부분(2)의 상방에서 유입수(9)와 접촉, 혼합되며, 정류판(4)으로 구획된 또 한쪽의 외측을 하강하여 저부의 슬로프(6)에 도달한다고 하는 순환류를 형성한다.
침강 부분(5)에서는 고형물과 청징수(淸澄水)가 중력에 의해 분리되어, 고형물은 슬로프(6)를 타고 폭기 부분(2)으로 돌아가고, 청징수는 배출구(10)로부터 처리수(11)로서 배출된다. 폭기 부분(2)의 수면 상방으로부터 유입되는 유입수(9)로서, 대상 화합물을 포함하는 합성 배지 또는 배수 등을 공급하여, 배양을 행한다. 유입수(9)의 공급은 연속적 또는 단속적의 어느 것이어도 된다.
도 1에 나타내는 반응조에서는, 반응조 내에 무기 미립자 담체를 유동시키고, 이것에 바이오매스에 포함되는 미생물을 집적, 담지시켜 배양한다. 배양에 있어서는, 반응조에 배지를 공급하고, 산기 장치(7)로부터 공기 또는 고산소 분압 가스(8)를 공급하고, 폭기 부분(2) 내에서 무기 미립자 담체를 포함하는 배지를 순환시키면서, 무기 미립자 담체를 유동시켜, 무기 미립자 담체 상에 미생물을 집적시킨다. 이와 같은 방법에 의하면, 운전 경비를 억제하고, 간편한 운전 관리로, 대상 화합물 분해성 미생물을 고농도로 집적한 미생물 제제를 효율 좋게 배양할 수 있는 경향이 있고, 또한 조 내에 공급된 산소의 이용 효율이 높기 때문에, 고부하 운전을 할 수도 있다.
본 실시형태에 있어서, 후술하는 방법에 의해, 무기 미립자 담체에 담지된 대상 화합물 분해성 미생물의 종류 및 무기 미립자 담체에 담지된 미생물에 대한 존재 비율을 확인할 수 있다. 그 때문에, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지하는 무기 미립자 담체를 배양하는 과정에서, 정기적으로 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 조사함으로써, 그 변화를 조사할 수 있다.
대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이 소정의 값에 이르렀을 때에는, 대상 화합물을 분해하는 미생물 제제로서 소정의 기능을 갖는다고 판정할 수 있기 때문에, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 회수하여, 본 실시형태의 미생물 제제를 얻을 수 있다. 미생물 제제로서 소정의 기능을 갖는다고 판정하기 위한 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율은, 대상 화합물에 따라 적절히 설정할 수 있다. 대상 화합물로 암모니아를 선택했을 경우는, 예를 들어, 질화 세균의 존재 비율은, 5% 이상인 것이 바람직하고, 10% 이상인 것이 보다 바람직하고, 15% 이상인 것이 더욱 바람직하다. 대상 화합물로 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산을 선택했을 경우는, 예를 들어, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 분해성 미생물의 존재 비율은, 5% 이상인 것이 바람직하고, 6% 이상인 것이 보다 바람직하고, 7% 이상인 것이 더욱 바람직하다.
대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이 소정의 값에 도달할 때까지 배양한 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 회수하여, 이것을 본 실시형태의 미생물 제제로 한다. 본 실시형태에 있어서, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체만을 회수하여 이것을 미생물 제제로 해도 되고, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 포함하는 배지를 미생물 제제로 해도 되고, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 포함하는 배지로부터 농축 또는 건조에 의해 수분을 제거한 것을 미생물 제제로 해도 된다. 본 실시형태의 미생물 제제의 보존 및 저장 시에는, 담지되는 미생물이 호기성 미생물인 경우, 사전에 고산소 분압 가스로 처리해도 된다.
본 실시형태의 제조 방법은, 배양 과정에서, 대상 화합물 분해성 미생물의 감시에 의해, 제조 중의 미생물 제제(대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체)에 포함되는 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율의 변화를 조사하는 것에 의해, 증식 저해 등의 문제를 신속히 검출하여, 대응할 수 있기 때문에, 미생물 제제를 안정되게 또한 효율적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 대상 화합물 분해성 미생물의 증식 저해가 예측되었을 경우에는, 첨가하는 대상 화합물의 양을 조정하는 등의 대응을 취하는 것에 의해, 대상 화합물 분해성 미생물의 증식을 적절히 제어할 수 있다.
＜대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율의 산출＞
대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율은, 무기 미립자 담체에 담지된 미생물의 16S rRNA 유전자의 소정의 영역을 증폭하여 증폭 산물을 얻는 공정과, 증폭 산물의 염기 서열 데이터를 해석하고, 얻어진 염기 서열 데이터를 각 염기 서열 데이터간의 상동성에 기초하여 복수의 그룹으로 나누어, 각각의 그룹의 염기 서열 데이터를 갖는 미생물을 단일의 종류로 하고, 각각의 그룹의 대표 염기 서열 데이터에 기초하여, 대상 화합물 분해성 미생물의 종류를 결정하고, 얻어진 염기 서열 데이터의 수에 기초하여, 모든 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 산출하는 공정을 포함하는 방법에 의해 얻어진다.
대상 화합물 분해성 미생물의 16S rRNA 유전자는, 예를 들어, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체로부터 직접 조제한 DNA를 이용할 수 있다. DNA의 조제 방법은, 당업자에게 주지의 방법을 이용할 수 있고, 예를 들어, 시판되고 있는 DNA 추출 키트 등을 이용할 수 있다.
조제한 DNA에 포함되는 16S rRNA 유전자의 소정의 영역을 증폭하고, 얻어지는 증폭 산물을 계속되는 해석에 이용한다. 16S rRNA 유전자에는, 유전자 상에 종간에 공통된 서열을 포함하는 보존 영역, 및 종·속 등에 따라서 상이한 서열을 포함하는 가변 영역(V1-V9)이 존재한다. 증폭시키는 영역은, 복수의 종류의 미생물 유래의 16S rRNA 유전자를 한 번의 증폭 공정으로 얻을 수 있는 것, 및, 복수의 종류의 미생물을 판별할 수 있는 것으로부터, 보존 영역에 끼워진 가변 영역인 것이 바람직하다. 증폭시키는 영역으로서는, 예를 들어, V3-V4 영역을 포함하는 범위를 들 수 있다. 증폭시키는 영역의 염기 서열수로서는, 100∼1500염기가 바람직하고, 300∼800염기가 보다 바람직하고, 400∼600염기가 더욱 바람직하다. 증폭시키는 영역이 이와 같은 길이이면, 해석 시에, 복수의 종류의 미생물을 분류하는 데 충분한 신뢰성을 얻을 수 있는 경향이 있다.
16S rRNA 유전자의 소정의 영역을 증폭시키는 방법으로서는, 특별히 제한되는 것은 아니고, 당업자에게 주지의 방법을 이용할 수 있다. 이와 같은 방법으로서는, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응법(PCR법)을 들 수 있다.
PCR법을 이용하여 증폭하는 경우, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체에 포함되는 복수의 미생물을 검출한다고 하는 관점에서, 이용하는 프라이머는, 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 모두, 16S rRNA 유전자의 가변 영역을 끼우는 보존 영역에 대해서 스트린전트(stringent)한 조건에서 하이브리다이즈하도록 설계된 유니버설 프라이머인 것이 바람직하다.
포워드 프라이머 및 리버스 프라이머는, 16S rRNA 유전자의 보존 영역에 대해서 스트린전트한 조건에서 하이브리다이즈하는 염기 서열인 유니버설 프라이머 서열을 갖는다. 유니버설 프라이머 서열의 길이로서는, 15∼40염기가 바람직하고, 15∼30염기가 보다 바람직하고, 15∼25염기가 더욱 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 「스트린전트한 조건」이란, 표적 서열에 대해서 상동성을 갖는 뉴클레오티드쇄의 상보 쇄가 표적 서열에 우선적으로 하이브리다이즈하고, 그리고 상동성을 갖지 않는 뉴클레오티드쇄의 상보 쇄가 실질적으로 하이브리다이즈하지 않는 조건을 의미한다. 스트린전트한 조건은 서열 의존적이고, 여러 가지 상황에서 상이하다. 보다 긴 서열은, 보다 높은 온도에서 특이적으로 하이브리다이즈한다. 일반적으로, 스트린전트한 조건은, 규정된 이온 강도 및 pH에서의 특정의 서열에 대한 열융해 온도(Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. Tm은, 규정된 이온 강도, pH, 및 DNA 농도하에서, 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드의 50%가 평형 상태로 표적 서열에 하이브리다이즈하는 온도이다.
증폭 산물의 염기 서열을 해석하는 방법으로서는, 예를 들어, 시퀀서에 의한 시퀀스 해석을 들 수 있다. 시퀀서로서는, 16S rRNA 유전자의 소정의 영역을 증폭시킨 증폭 산물(앰플리콘)을 분리하지 않고, 복수종의 미생물을 동시에, 또한 망라적으로 해석할 수 있다고 하는 관점에서, 차세대형 시퀀서가 바람직하고, 예를 들어, GS FLX+ System(로슈사제), MiSeq(일루미나사제) 등을 들 수 있다.
시퀀서로 GS FLX+ System(로슈사제)을 이용하는 경우, 유니버설 프라이머는, 유니버설 프라이머 서열 외에, 특정의 서열을 갖고 있어도 된다. 예를 들어, 포워드 프라이머는, 5' 말단으로부터, 시퀀스 해석에서의 서열 결정에 필요한 어댑터 서열, 각 검체에 고유의 바코드 서열, 유니버설 프라이머 서열이 되도록 설계되고, 리버스 프라이머는, 5' 말단으로부터, 시퀀스 해석에서의 서열 결정에 필요한 어댑터 서열, 유니버설 프라이머 서열이 되도록 설계된다. 바코드 서열이란, 검체간의 식별에 이용하는 것으로, 동시에 시퀀서에 제공하는 검체수에 대응한 임의로 설계한 염기 서열이다. 이와 같은 바코드 서열을 갖는 프라이머를 이용함으로써, 1회의 시퀀스 해석으로 다수의 검체를 해석할 수 있다. 어댑터 서열 및 바코드 서열은, 메이커 지정의 것을 이용할 수 있다. 바코드 서열의 길이는, 염기 서열 해석에 이용하는 검체수에 응하여 설계할 수 있고, 예를 들어, 8∼15염기로 할 수 있다.
이하, GS FLX+ System에 의해 얻어진 염기 서열 데이터의 해석 방법을 설명하지만, 본 발명은, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
시퀀스 해석에 의해 얻어진 염기 서열 데이터는, 염기 서열 데이터에 포함되는 검체 고유의 바코드 서열에 기초하여, 각 서열을 각각의 고유의 검체로 나눌 수 있다. 나눠진 염기 서열 데이터를, 추가로, 염기 서열 데이터의 서열 길이, 유니버설 프라이머 서열과 미스매치되는 염기수, 시퀀서에 부속되는 퀄리티 프로그램에 의해 산출되는 서열 결정한 염기 서열 데이터의 평균 퀄리티값 등에 의해 선별하여, 고정밀도의 염기 서열 데이터로 한다.
얻어진 고정밀도의 염기 서열 데이터를, OTU(Operational Taxonomic Unit) 해석에 의해, 염기 서열 데이터간의 상동성에 기초하여 복수의 그룹으로 나눈다. 동일한 그룹으로 나누기 위한 염기 서열 데이터간의 상동성은, 요구되는 신뢰성에 따라 설정할 수 있고, 95% 이상이어도 되고, 97% 이상이어도 되며, 99% 이상이어도 된다. OTU 해석을 행하기 위한 소프트웨어로서는, 예를 들어, Uclust(http://drive5.com/usearch/manual/uclust_algo.html), UPARSE(http://drive5.com/usearch/manual/uparse_pipeline.html), USEARCH(http://www.drive5.com/usearch) 등을 들 수 있다.
OTU 해석의 결과에 있어서, 동일한 그룹의 염기 서열 데이터를 갖는 미생물은 단일한 종류의 미생물이다. 여기에서 말하는 「종류」란, 분류학상의 과, 속, 종을 포함하는 것이다. 각각의 그룹의 대표 염기 서열 데이터를 DDBJ, GenBank, RDP, Greengenes 등의 데이터베이스로 상동성 검색하여, 가장 상동성이 높은 염기 서열 데이터를 갖는 미생물을, 대표 염기 서열 데이터를 갖는 미생물이라고 특정한다. 이것에 의해, 결정된 대표 염기 서열 데이터가 포함되는 그룹의 미생물의 종류를 특정할 수 있다. 각각의 그룹의 미생물의 종류를 특정하면, 데이터베이스 등의 정보에 기초하여, 어느 그룹의 미생물이 대상 화합물 분해성 미생물인지를 결정할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 대표 염기 서열 데이터란, 각 그룹에 속하는 어느 염기 서열 데이터와도 역치 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열 데이터를 나타낸다.
OTU 해석의 결과에 있어서, 그룹의 수는, 검출 가능한 범위에 있어서, 그 미생물총(微生物叢)을 구성하는 미생물의 종류의 수와 동일하다고 생각할 수 있다. 각 그룹으로 나눠진 염기 서열 데이터의 수로부터는, 얻어진 염기 서열 데이터수 전체에 있어서의 비율, 즉 미생물총 전체에서 차지하는 그 그룹의 미생물종의 존재 비율을 구할 수 있다. 상기의 방법에 의해, 대표 염기 서열 데이터로부터 대상 화합물 분해성 미생물의 그룹을 결정함으로써, 그 존재 비율을 산출할 수 있다.
＜화합물 분해 방법＞
본 실시형태의 미생물 제제는, 대상 화합물의 분해에 이용할 수 있다. 대상 화합물의 분해 방법으로서는, 예를 들어, 대상 화합물을 포함하는 폐액 등에 대해, 본 실시형태의 미생물 제제를 첨가하고, 교반하는 방법을 들 수 있다. 이 때, 첨가하는 미생물 제제의 양은, 대상 화합물의 종류, 반응조의 용량, 미생물 제제에 담지되어 있는 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율 등에 따라, 적절히 설정할 수 있다.
＜미생물 제제의 평가 방법＞
본 실시형태의 미생물 제제의 평가 방법은, 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 지표로 하여 미생물 제제를 평가하는 공정을 구비한다. 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율은, 전술한 방법을 이용할 수 있다.
본 실시형태의 평가 방법에서 이용되는 미생물 제제로서는, 예를 들어, 제조 후 보존되고 있는 미생물 제제를 들 수 있다.
미생물 제제의 평가는, 미생물 제제에 포함되는 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 산출함으로써 행해진다. 평가 방법으로서는, 예를 들어, 제조 직후의 미생물 제제 및 보존 중의 미생물 제제에 포함되는 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 비교하여, 보존 중의 미생물 제제에 포함되는 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이 감소하고 있는 경우, 보존 중의 미생물 제제의 분해 활성이 저하되고 있다고 판정할 수 있다.
실시예
[실시예 1]
(재료)
배지의 제조에 이용하는 성분의 농축액을 이하에 나타내는 방법으로 조제했다. (NH4)2SO4 35.4g과 Na2HPO4 7.7g을 순수 500mL에 용해하여, 암모니아태 질소 15000mg/L의 질소 인 용액으로 했다. KCl 110g과 CaCl2·2H2O 50g과 CoCl2 1mg을 순수 1000mL에 용해하여, 무기염 용액 1로 했다. NaMoO4·2H2O 5mg을 순수 1000mL에 용해하여 무기염 용액 2로 했다. MgSO4·7H2O 85g과 FeSO4·7H2O 8.5g과 MnSO4·5H2O 2g과 ZnSO4 100mg과 CuSO4·5H2O 100mg을 순수 1000mL에 용해하여 무기염 용액 3으로 했다. 배양 중에 공급하는 배지는, (NH4)2SO4 0.2g과 Na2HPO4 1.54g을 순수 1000mL에 용해하고, 무기염 용액 1 1ml, 무기염 용액 2 1ml, 무기염 용액 3 1mL를 가하는 것에 의해 제조했다. 배지는, 배양 기간 중에 계속하여 공급하기 위해, 적절히, 필요량을 제조했다. 활성 오니 현탁액은, 화학 공장의 폭기조로부터 활성 오니를 채취하고, 활성 오니 농도가 5000mg-MLSS/L가 되도록 순수를 이용하여 조정했다. MLSS란, 부유 고형물(Mixed liquor Volatile Suspended Solid)이다. MLSS는, 하수 시험 방법 상권―2012년도판-공익사단법인 일본하수도협회저에 기재된 방법에 따라 측정했다. 무기 미립자 담체 분산액은, 순수 800ml에 플라이 애쉬 500g을 가하여 혼합한 현탁액과, 수미플록 FA-40H(MT 아쿠아 폴리머사제) 60g을 순수 600ml에 용해한 액을 혼합하여 제조했다.
(미생물 제제의 제조)
폭기부와 고액 분리를 행하기 위한 침강부를 구비하는 에어리프트형 연속 반응조를 이용하여, 미생물 제제의 제조를 행했다. 반응조에 활성 오니 현탁액 10L, 질소 인 용액 10mL, 무기염 용액 1 10ml, 무기염 용액 2 10ml, 무기염 용액 3 10mL, 무기 미립자 담체 분산액 1.4L를 가하고 에어리프트에 의해 교반하고, 배양을 행했다. 이것들을 혼합한 배지는, 10질량% H3PO4 용액 및 10질량% Na2CO3 용액을 이용하여, pH 7.5 부근으로 제어했다. 수온은 25℃로 제어했다. 이하, 반응조 중의 배지를 배양액이라고 한다.
배양 개시 후, 배양액 중의 암모니아태 질소의 농도를 측정하여, 암모니아태 질소가 없어지면, 공급용 배지의 공급을 개시했다. 배양액 중의 암모니아태 질소 농도 및 배지의 유속은, 배양액 중의 암모니아 농도, 아질산 농도, 질산 농도, 및 질화 세균의 존재 비율의 측정 결과에 따라서, 질화 세균의 증식 저해가 일어나지 않도록 조정하여, 배양액 중의 암모니아태 질소 농도가 서서히 높아지도록 했다.
배양 후 36일째의 배양액을, 반응조의 폭기부로부터 회수하여, 이것을 질화 세균이 고밀도화된 미생물 제제로 했다.
(암모니아태 질소의 측정)
반응조의 침강부로부터 활성 오니가 침강 분리된 배양액을 회수하고, 이것을 공경 0.45μm, 직경 25mm의 시린지 필터(아드반테크사제)로 여과하고, 암모니아태 질소 검출 키트 및 분광 광도계 스펙트로퀀트 NOVA60(메르크밀리포어사제)을 이용하여 측정했다.
(암모니아태 질소 제거율의 산출)
반응조의 침강부로부터 활성 오니가 침강 분리된 배양액을 회수한 시점에 있어서의, 배양액 중에 포함되는 암모니아태 질소 농도 및 공급용 배지에 포함되는 암모니아태 질소 농도로부터, 암모니아태 질소 제거율을 산출했다.
Figure pct00001
(질소 처리 능력의 산출)
반응조의 침강부로부터 활성 오니가 침강 분리된 배양액을 회수한 시점에 있어서의, 배지 중에 포함되는 암모니아태 질소 농도, 공급용 배지에 포함되는 암모니아태 질소 농도, 공급용 배지의 유량 및 반응조 폭기부의 배양액 용량으로부터, 질소 처리 능력을 산출했다.
Figure pct00002
(미생물의 종류의 결정 및 각각의 미생물의 존재 비율의 산출)
· DNA의 조제
질화 세균의 검출 및 그 존재 비율의 산출은, 배양 중의 무기 미립자 담체에 활성 오니가 고착된 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 회수하여, 거기에 포함되는 미생물의 16S rRNA 유전자를 이용한 염기 서열 데이터에 기초하여 구했다. 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체 중의 미생물의 DNA는 이하의 방법으로 조제했다.
대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 포함하는 배지 1.5mL를 회수하여, 실온에서 원심분리(13000rpm, 5분간)했다. 상청을 제거한 후, 멸균 생리 식염수를 1mL 가하고, 5초간 정도 전도(轉倒) 혼합하고, 실온에서 원심분리(13000rpm, 5분간)했다. 상청을 제거한 후, Lysis buffer(에이엠알사제)를 300μL 가하고 잘 혼합했다. 이 현탁액을 비즈가 들어간 튜브(이지 익스트랙트 for DNA(에이엠알사제))에 첨가 후, 볼텍스 믹서로 2분간 교반 파쇄했다. 파쇄액에 300μL의 TE 용액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0)(이하, TE 용액이라고 한다.)을 첨가하고, 4℃에서 원심분리(13000rpm, 5분간)했다. 그 후, 상청액 450μL를 새로운 튜브에 넣고 이것에 600μL의 페놀 혼용액(이지 익스트랙트 for DNA에 부속된 것(에이엠알사제))을 가하고 1분간 볼텍스 믹서로 교반한 후, 4℃에서 원심분리(13000rpm, 5분간)했다. 상청 300μL를 회수하여 새로운 튜브(1.5mL)로 옮기고, 이것에 1200μL의 에탄올(99.5%)을 가하고, 4℃에서 원심분리(13000rpm, 5분간)했다. 상청을 제거한 후, 튜브에 1000μL의 냉 에탄올(70%)을 가하고, 4℃에서 원심분리(13000rpm, 5분간)하고, 얻어진 DNA 펠릿을 진공 건조했다. 건조한 DNA 펠릿에 150μL의 TE 용액을 가한 것을, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체 중의 미생물의 DNA 용액으로 했다.
· 16S rRNA 유전자의 증폭
조제한 DNA 용액 중의 2본쇄 DNA 농도를 측정하고, 그 측정치에 기초하여 계산한 50ng의 DNA를 주형으로 하고, 유니버설 프라이머 세트(포워드 프라이머 및 리버스 프라이머)를 이용하여, 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 PCR 증폭했다. PCR은 다카라바이오사제의 「Premix Ex Taq Hot Start Version」(등록상표)을 이용하여, 각 프라이머를 50pmol 포함하는 반응액 50μL를 조제하고, 94℃에서 2분간의 프리히팅을 행한 후, 변성, 어닐링, 신장을 각각 98℃×10초간, 50℃×30초간, 72℃×80초간으로 행하고, 이것을 25사이클 반복했다. 유니버설 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의해, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체에 포함되는 각종 미생물의 DNA 단편(약 570bp)을 증폭했다.
포워드 프라이머로는, 5' 말단측으로부터, 서열 번호 1에 기재된 염기 서열 로 이루어지는 어댑터 A 서열, 10염기로 이루어지는 바코드 서열, 서열 번호 2에 기재된 염기 서열로 이루어지는 유니버설 프라이머 서열을 갖는 것을 이용했다. 리버스 프라이머로는, 5' 말단측으로부터, 서열 번호 3에 기재된 염기 서열로 이루어지는 어댑터 B 서열, 서열 번호 4에 기재된 염기 서열로 이루어지는 유니버설 프라이머 서열을 갖는 것을 이용했다.
· 시퀀스 해석
증폭한 PCR 산물을, DNA 클리너(와코준야쿠사제)로 처리하여, DNA를 정제했다. 정제 DNA는 200μL의 TE 용액으로 용출·회수했다. 회수한 정제 DNA 용액을 아가로스 겔 전기 영동에 제공하고, 약 570bp의 위치에 검출되는 밴드를 겔마다 잘라냈다. 잘라낸 겔로부터 MinElute Gel Extraction Kit(키아겐사제)를 이용하여 DNA를 추출하고, 이것을 시퀀서에 제공하는 시퀀스용 샘플로 했다.
상기 시퀀스용 샘플을, GS FLX+ System 시퀀서(로슈사제)에 제공하여, 시퀀스 해석을 행했다. 시퀀스의 조건·공정 등은 메이커 소정의 프로토콜에 따랐다. 얻어진 각 염기 서열의 데이터에 대해서는, 각 염기 서열 데이터에 포함되는 샘플 고유의 바코드 서열에 기초하여, 각 염기 서열 데이터를 각각의 고유의 샘플로 분류했다. 그 후, 염기 서열 데이터의 서열 길이 200염기 미만, 1000염기 이상, 유니버설 프라이머 서열(포워드 프라이머)과의 미스매치 1염기 이상, 및 시퀀서에 부속된 퀄리티 프로그램을 이용하여 결정되는 서열 결정한 염기 서열 데이터의 평균 퀄리티값이 25 이하인 서열 데이터를 제거하는 것에 의해, 고정밀도 염기 서열 데이터를 추출했다.
· OTU 해석
상기 고정밀도 염기 서열 데이터를, OTU 해석에 제공했다. OTU 해석에서는, 95% 이상의 상동성을 갖는 각 서열 데이터끼리를 동일한 그룹으로 분류하여, 복수의 그룹을 형성했다. OTU 해석은, Uclust를 이용하여 행했다. OTU 해석에 의해 얻어진 정보로부터, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체에 포함되는 미생물의 종류의 결정 및 각각의 미생물의 존재 비율의 산출을 행했다.
(결과)
대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 각 일수 배양한 후의 암모니아태 질소 제거율, 질소 처리 능력 및 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체에 포함되는 질화 세균(암모니아 산화 세균(Nitrosomonas속), 아질산 산화 세균(Nitrobacter속, Nitrospira속))의 존재 비율을 집계한 것을 표 1에 나타낸다. 배양 중의 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체에 포함되는 미생물의 유전자 해석 정보에 의해, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체 중에 포함되는 질화 세균의 존재 비율의 변화를 경시적으로 측정할 수 있었다. 또한, 각종 질화 세균의 증가에 수반하여, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체의 질소 처리 능력이 증가하고 있음도 나타났다.
Figure pct00003
[실시예 2]
(재료)
배지의 제조에 이용하는 성분의 농축액을 이하에 나타내는 방법으로 조제했다. MgSO4·7H2O 100g을 순수 1000mL에 용해하여, 무기염 용액 A로 했다. Na2HPO4 4.152g과 NaH2PO4 2.244g과 (NH4)2SO4 1.2g을 순수 300mL에 용해하여, 무기염 용액 B로 했다. (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산(순도 약 85질량%) 1.18g을 순수 100mL에 용해한 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 용액(10g/L)을 이용했다. 무기 미립자 담체 분산액은, 순수 250ml에 활성 오니 소각회 50g을 가하고 혼합, 현탁하여 제조했다. 활성 오니 현탁액은, 화학 공장의 폭기조로부터 활성 오니를 채취한 것을 그대로 이용했다. 배양 중에 공급하는 배지는, (NH4)2SO4 1.0g과 Na2HPO4 1.3g과 NaH2PO4 0.9g을 순수 1000mL에 용해하고, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 용액 4.0mL, 및 무기염 용액 1 1ml, 무기염 용액 2 1ml, 무기염 용액 3 1mL를 가하는 것에 의해 제조했다. 배지는, 배양 기간 중에 계속하여 공급하기 위해, 적절히, 필요량을 제조했다. 그 외, 배양 개시 시에 이용하는 탄소원으로서 메탄올과 물을 7:3(v/v) 정도의 비율로 포함하는 공장 유래 부생유를 이용했다.
(미생물 제제의 제조)
폭기부(용량 1L) 및 침강부(용량 0.4L)를 구비하는 에어리프트형 연속 반응조를 이용하여, 미생물 제제의 제조를 행했다. 반응조에, 활성 오니 현탁액 570mL와 무기염 용액 A 4.9mL와 무기염 용액 B 300mL와 공장 유래 부생유 13.2μL와 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 용액 9.876mL와 무기 미립자 담체 분산액 250 mL와, 순수 70mL를 가하여 배지를 조제했다. 이 배지를 에어리프트에 의해 교반하고, 배양을 행했다. 배지는, 10질량% Na2CO3 용액을 이용하여, pH 6.9 부근으로 제어했다. 수온은 25℃로 제어했다. 이하, 반응조 중의 배지를 배양액이라고 한다.
배양 개시 후, 배양액 중의 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 농도를 측정하여, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산의 농도의 현저한 감소가 인정되면, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산을 소정의 농도 함유하는 배지를 연속적으로 공급하여 연속 배양을 행했다. 추가하는 배지에 포함되는 염류는 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 첨가량에 따라서 증가시켰다. 배양 중의 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체에 포함되는 미생물의 변천을 파악하기 위해, 수시로, 배양 중의 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체에 포함되는 미생물의 DNA 추출을 행했다.
((S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 농도의 측정)
배지 중의 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 농도는, 배지를 하기의 조건에서 HPLC에 제공함으로써 산출했다.
· 장치: LC-10A(시마즈제작소사제)
· 컬럼: SUMIPAX ODS A-211 4.6mm×250mm, 5μ(스미카분석센터사제)
용매: A액 0.01% TFA 수용액, B액 아세토나이트릴, A액:B액=4:6
유속: 1.0mL/분
오븐 온도: 40℃
검출기: UV 220nm
샘플 주입량: 10μL
((S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 제거율의 산출)
반응조의 침강부로부터 활성 오니가 침강 분리된 배양액을 회수한 시점에서의, 배양액 중에 포함되는 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 농도, 공급용 배지에 포함되는 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 농도로부터, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 제거율을 산출했다.
Figure pct00004
((S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 처리 능력의 산출)
반응조의 침강부로부터 활성 오니가 침강 분리된 배양액을 회수한 시점에서의, 배지 중에 포함되는 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 농도, 공급용 배지에 포함되는 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 농도, 공급용 배지의 유량, 반응조 폭기부의 배양액 용량으로부터, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 처리 능력을 산출했다.
Figure pct00005
(미생물의 종류의 결정 및 각각의 미생물의 존재 비율의 산출)
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 분해균의 검출 및 그 존재 비율의 산출은, 배양 중의 무기 미립자 담체에 활성 오니가 고착된 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 회수하여, 그 DNA를 이용한 유전자 해석 정보에 기초하여 구했다. 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체 중의 미생물의 유전자 해석 정보는 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 얻었다.
(결과)
대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 각 일수 배양한 후의 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 제거율, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 처리 능력 및 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체에 포함되는 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 분해성균(Sphingomonadaceae과)의 존재 비율을 집계한 것을 표 2에 나타낸다. 배양 중의 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체에 포함되는 미생물의 유전자 해석 정보에 의해, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 분해성균의 존재 비율의 변화를 경시적으로 측정할 수 있었다. 또한, Sphingomonadaceae과 세균의 증가에 수반하여, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체의 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 처리 능력이 증가하고 있음도 나타났다.
Figure pct00006
[실시예 3]
배지의 제조에 이용하는 무기염 용액은, 실시예 1과 동일한, 무기염 용액 1, 무기염 용액 2, 무기염 용액 3으로 했다. (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 용액은, 실시예 2와 동일한 것을 이용했다. 유입수는, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 용액 1mL, (NH4)2SO4 1g, Na2HPO4 1.298g, NaH2PO4 0.912g을 순수 1000mL에 용해하고, 무기염 용액 1 1ml, 무기염 용액 2 1ml, 무기염 용액 3 1mL를 가하는 것에 의해 제조했다. 유입수는, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 제거 반응 기간 중에 계속하여 공급하기 위해, 적절히, 필요량을 제조했다. 활성 오니 현탁액은, 화학 공장의 폭기조로부터 활성 오니를 채취한 것을 그대로 이용했다.
((S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 제거 반응)
폭기부(용량 3L) 및 침강부(용량 1L)를 구비하는 에어리프트형 연속 반응조를 이용하여, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 제거 반응을 행했다. (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 제거 반응은, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 분해성 미생물 제제가 없는 조건(A 계열)과 있는 조건(B 계열)의 2종류의 조건에서 행했다. 반응조에 유입수를 가하고, 활성 오니 현탁액을 가하고, 활성 오니 농도가 2408mg-MLSS/L가 되도록 조정하여, 배양액으로 했다. MLSS란, 부유 고형물(Mixed liquor Volatile Suspended Solid)이다. B 계열에만, 추가로 상청을 원심분리에 의해 제거한 실시예 2에서 제조한, 배양 후 54일째의 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 분해성 미생물 제제를 459mL 분가(分加)하여 배양액으로 했다. A 계열 및 B 계열의 배양액을 교반하여, 반응을 개시했다. 유입수는 1mL/분의 속도로 가했다. 유입수는, 10질량% Na2CO3 용액을 이용하여, pH 7 부근으로 제어했다. 수온은 25℃로 제어했다. 미생물 제제 중의 미생물의 유전자 해석 정보는 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 얻었다.
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 제거율 및 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 분해성 미생물의 측정은, 실시예 2에 기재된 방법과 마찬가지로 하여 행했다.
(결과)
A 계열 및 B 계열에 있어서의, 유입수의 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 제거율 및 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 분해성 미생물의 비율을 집계한 것을, 표 3에 나타낸다. B 계열에서는, 반응 개시 시부터 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 분해성 미생물 제제를 가하고 있기 때문에, 4.6일째의 시점부터 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 분해성 미생물의 비율이 높고, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 제거율도 높았다. 한편, A 계열에서는 B 계열에 비해, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 분해성 미생물의 비율의 상승이 늦고, (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산 제거율도 낮았다.
Figure pct00007
1…배양조, 2…폭기 부분, 3…격벽, 4…정류판, 5…침강 부분, 6…슬로프, 7…산기 장치, 8…공기 또는 고산소 분압 가스, 9…유입수, 10…배출구, 11…처리수, 100…반응조
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Claims (6)

  1. 대상 화합물 분해성 미생물을 담지하는 미생물 제제의 제조 방법으로서,
    대상 화합물을 포함하는 배지 중에서, 상기 대상 화합물 분해성 미생물을 포함하는 바이오매스와, 무기 미립자 담체를 첨가하고, 상기 바이오매스에 포함되는 미생물을 상기 무기 미립자에 담지시켜, 상기 무기 미립자 담체에 담지된 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 감시하면서, 배양하는 공정과,
    대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이 소정의 값에 도달한 후, 대상 화합물 분해성 미생물을 담지한 무기 미립자 담체를 회수하여, 미생물 제제를 얻는 공정
    을 구비하고,
    상기 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이,
    상기 무기 미립자 담체에 담지된 미생물의 16S rRNA 유전자의 소정의 영역을 증폭하여 증폭 산물을 얻는 공정과,
    상기 증폭 산물의 염기 서열 데이터를 해석하고, 얻어진 염기 서열 데이터를 각 염기 서열 데이터간의 상동성에 기초하여 복수의 그룹으로 나누어, 각각의 그룹의 염기 서열 데이터를 갖는 미생물을 단일의 종류로 하고, 각각의 그룹의 대표 염기 서열 데이터에 기초하여, 대상 화합물 분해성 미생물의 종류를 결정하고, 얻어진 염기 서열 데이터의 수에 기초하여, 모든 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 산출하는 공정
    을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 대상 화합물이 (S)-2-(4-클로로페닐)-3-메틸뷰탄산인, 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 대상 화합물이 암모니아인, 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조된, 미생물 제제.
  5. 제 4 항에 기재된 미생물 제제를 이용한, 화합물 분해 방법.
  6. 제 4 항에 기재된 미생물 제제의 평가 방법으로서,
    상기 미생물 제제에 포함되는 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 지표로 하여 상기 미생물 제제를 평가하는 공정을 구비하고,
    상기 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율이,
    상기 미생물 제제에 포함되는 미생물의 16S rRNA 유전자의 소정의 영역을 증폭하여 증폭 산물을 얻는 공정과,
    상기 증폭 산물의 염기 서열 데이터를 해석하고, 얻어진 염기 서열 데이터를 각 염기 서열 데이터간의 상동성에 기초하여 복수의 그룹으로 나누어, 각각의 그룹의 염기 서열 데이터를 갖는 미생물을 단일의 종류로 하고, 각각의 그룹의 대표 염기 서열 데이터에 기초하여, 대상 화합물 분해성 미생물의 종류를 결정하고, 얻어진 염기 서열 데이터의 수에 기초하여, 모든 미생물에 있어서의 대상 화합물 분해성 미생물의 존재 비율을 산출하는 공정
    을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 평가 방법.
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