CN107058183A - 一种甲基营养型芽孢杆菌及其生防菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌及其生防菌剂和应用。甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus GSBM05，该菌株对葡萄白腐病菌具有良好的抑制作用，并且对多种植物病原菌具有广谱抗性，对葡萄植株安全，大规模生产成本低，操作方便，防治效果稳定，能有效解决葡萄病害中农药防治所带来的农药残留和环境污染问题。对葡萄病害的生物防治方面具有巨大的应用潜力，为研制和开发微生物农药提供了新资源。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌及其生防菌剂和应用

技术领域

本发明涉及葡萄白腐病防治技术领域，特别是涉及一种甲基营养 型芽孢杆菌及其生防菌剂和应用。

背景技术

葡萄白腐病在全国葡萄产区均有发生，是葡萄的主要病害之一。 葡萄白腐病主要为害果穗，也可侵染枝蔓和叶片。初在穗轴和果梗上 产生水浸状、不规则的斑点，扩大后终至组织腐败坏死，果粒发病， 多在基部开始，初呈浅褐色斑，迅速扩展至整个果粒，后期果粒腐烂、 脱落。叶片受害多从叶尖、叶缘开始，初形成褐色、水浸状斑，后期 病组织上出现灰白色小粒点。

葡萄白腐病是由白腐盾壳霉(Coniothyrium diplodiella)侵染 引起的，无性生殖产生分生孢子，分生孢子褐色、单胞，半透明、光 滑、卵形，一端稍尖或钝圆，另一端平截，内含一至多个油球。

目前，葡萄白腐病的防治多采用农业措施与药剂防治相结合的策 略，生物防治研究较少。生物防治是利用有益的生物或其代谢产物防 治有害生物的方法，对人畜安全、对环境和果品没有污染，对有害生 物不产生抗性。葡萄不论作为鲜食还是加工，绿色无公害是非常必要 的。

芽孢杆菌以其繁殖速度快、抗逆性强等优势逐渐成为生物防治的 热点。已报道过的关于葡萄白腐病生物防治的微生物主要有枯草芽孢 杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌等。

甲基营养型芽孢杆菌是一类极具优势生防潜力的菌株。有研究报 道，甲基营养型芽孢杆菌可以防治由炭疽菌属(Colletotrichum)、 丝核菌属(Rhizoctonia)等引起的病害。并研究发现该菌有促进植 物生长的作用。但尚未见甲基营养型芽孢杆菌对由白腐盾壳霉 (Coniothyrium diplodiella)引起的葡萄白腐病防治的报道。

发明内容

本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种甲基营养型芽孢杆 菌及其生防菌剂和应用。本发明针对现有技术中对于葡萄白腐病的生 物防治研究欠缺，提出的甲基营养型芽孢杆菌GSBM05，对多种植物 病原菌具有广谱抗性，对葡萄白腐病、葡萄炭疽病等多种病害具有良 好的防治效果。对葡萄植株安全，大规模生产成本低，操作方便，防 治效果稳定，能有效解决葡萄病害农药防治所带来的农药残留和环境 污染问题。对葡萄病害的生物防治方面具有巨大的应用潜力，为研制 和开发微生物农药提供了新资源。

本发明的一种甲基营养型芽孢杆菌及其生防菌剂和应用技术方 案为，本发明公开了一株防治葡萄白腐病的甲基营养型芽孢杆菌菌 株。该菌株保藏名称为甲基营养型芽孢杆菌GSBM05，保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2017年1月10日，保 藏编号：13556。

所述的甲基营养型芽孢杆菌对葡萄植株安全。

所述的甲基营养型芽孢杆菌在防治葡萄白腐病、葡萄炭疽病、葡 萄穗轴褐枯病菌、葡萄枝枯病菌、杨树水泡溃疡病菌、杨树腐烂病菌 方面的应用。尤其是在防治葡萄白腐病方面的应用优势明显。

将甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus GSBM05制备 成生防菌剂。

一种甲基营养型芽孢杆菌生防菌剂，所述甲基营养型芽孢杆菌生 防菌剂包括甲基营养型芽孢杆菌发酵液或发酵液滤液，发酵液滤液的 制备步骤如下：

(1)活化菌株：将保存好的甲基营养型芽孢杆菌GSBM05于NA培养 基中划线并置于28℃培养箱中24h；

(2)制备种子液：挑取NA培养基上的GSBM05单菌落接种到NB液体 培养基中，28℃下180r/min震荡培养24h；

(3)制备发酵液：按体积比以5％接种量将步骤(2)中制备的GSBM05 种子液接种于发酵培养基中，培养基初始pH为6.5、发酵温度为28℃、 震荡频率为150r/min、发酵时间为60h；经平板计数，菌液浓度大于 2.0×10¹⁰cfu/mL；

(4)制备发酵液滤液：将步骤(3)中制备得到的GSBM05发酵液在 10000r/min下离心20min，取上清液，经直径为0.22um的微孔滤膜 过滤得到发酵滤液。

所述步骤(3)中微生物菌剂的发酵培养基为：淀粉20g/L、大 豆饼粉5g/L、酵母提取物20g/L、NaCl 5g/L、CaCO₃ 2g/L，初始pH6.5。

所述的一种甲基营养型芽孢杆菌GSBM05微生物菌剂在防治鲜食 葡萄白腐病上的应用。

本发明的有益效果为：本发明的甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus GSBM05，该菌株对葡萄白腐病菌有强烈的抑制作 用，对多种植物病原菌具有广谱抗性，对葡萄植株安全，大规模生产 成本低，操作方便，防治效果稳定，能有效解决葡萄病害农药防治所 带来的农药残留和环境污染问题。对葡萄病害的生物防治方面具有巨 大的应用潜力，为研制和开发微生物农药提供了新资源。

附图说明：

图1所示为本发明的甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus GSBM05在NB培养基上的菌落形态；

图2所示为葡萄白腐病菌空白对照培养与菌株GSBM05发酵滤液培养 照片。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技 术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1

试验方法

1.培养基

NA培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，葡萄糖2.5g，琼脂 15g，调节pH值至7.0，定容1L。121℃灭菌20min，用于GSBM05 菌株斜面培养与活化；

NB培养基：不加琼脂的NA培养基，用于GSBM05菌株种子液培 养；

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL， 用于真菌培养及抑菌试验。

2.菌株GSBM05种子液的制备

菌株GSBM05于NA培养基活化后接于装有100mL NB培养液的 250mL三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养24h。

3.甲基营养型芽孢杆菌GSBM05的鉴定

3.1形态学鉴定

在NB培养基上培养4d，菌落圆形，乳白色，边缘不整齐，表面 突起，半湿润，随着培养时间延长，菌落渐变土黄色，外缘褶皱明显。 图说明书附图图1所示。

显微镜下观察，菌体呈短杆状，革兰氏染色阳性。

3.2生理生化鉴定如表1所示：

表1

通过生理生化指标的测定，GSBM05为好氧菌，厌氧条件下生长 微弱；在含有7％和10％NaCl的液体培养基均不生长；不能利用柠檬 酸盐及硝酸盐，可以水解淀粉和明胶，VP实验阳性，接触酶实验阳 性。能利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖作为碳源。

3.3分子生物学鉴定

采用天根细菌基因组DNA小量制备试剂盒提取DNA，用引物27F： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R： 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’进行PCR扩增，PCR产物用天根DNA 凝胶回收试剂盒回收后，委托上海派森诺生物科技股份有限公司进行 测序，将所得到的的16s rDNA序列用NCBI Blast程序与NCBI ribosomal RNA sequence数据库中的数据进行比对。

从分析结果看，GSBM05与甲基营养型芽孢杆菌KM659226.1基因 序列的同源性最近，同源率在99％以上，该测序结果与生理生化鉴定 相吻合，确定GSBM05菌属于甲基营养型芽孢杆菌。

甲基营养型芽孢杆菌GSBM05基因序列片段：

4.GSBM05对病原菌的拮抗作用

4.1 GSBM05菌剂的制备

发酵培养基为：淀粉20g/L、大豆饼粉5g/L、酵母提取物20g/L、NaCl 5g/L、CaCO₃2g/L，初始pH6.5。

微生物菌剂的制备方法，制备步骤如下：

1)活化菌株：将保存好的甲基营养型芽孢杆菌GSBM05于NA培养基 中划线并置于28℃培养箱中24h；

2)制备种子液：挑取NA培养基上的GSBM05单菌落接种到NB液体培 养基中，28℃下180r/min震荡培养24h；

3)制备发酵液：按体积比以5％接种量将步骤2)中制备的GSBM05种 子液接种于发酵培养基中，培养基初始pH为6.5、发酵温度为28℃、 震荡频率为150r/min、发酵时间为60h。经平板计数，菌液浓度大于 2.0×10¹⁰cfu/mL；

4)制备发酵液滤液：将步骤3)中制备得到的GSBM05发酵液在 10000r/min下离心20min，取上清液，经直径为0.22um的微孔滤膜 过滤得到发酵滤液。

4.2GSBM05菌剂对葡萄白腐病的抑菌活性

4.2.1 GSBM05菌剂对葡萄白腐病菌菌丝生长的影响

(1)GSBM05发酵液对葡萄白腐病菌菌丝生长的影响

采用对峙培养法：在PDA平板中心接种葡萄白腐病菌，将8mm无 菌滤纸片蘸取发酵液后对称贴在距离病原菌菌饼2.5cm处，25℃培 养，3d后观察并记录病原菌生长直径并计算抑菌率。

(2)GSBM05发酵滤液对葡萄白腐病菌菌丝生长的影响

采用菌落生长速率法：将获得的发酵液与PDA培养基按1:10体 积比混合制作PDA平板，在平板中央接直径为0.5cm的指示菌菌碟， 25℃下培养，定期检查并测定菌落生长直径，并计算抑菌率。

生长抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落 直径×100％

如说明书附图图2所示，菌株GSBM05发酵液及发酵滤液均对葡 萄白腐病菌表现出强烈的抑菌作用，抑菌率分别达到75％及87.5％。

4.2.2 GSBM05菌剂对葡萄白腐病菌孢子萌发的影响

在无菌条件下，用1％葡萄糖溶液配制成孢子悬浮液，将孢子悬 浮液与发酵液和发酵滤液分别按照1:1体积混合，采用凹玻片悬滴法 进行分生孢子萌发实验，培养皿保湿，以未加发酵液的孢子悬浮液为 对照，28℃培养12h，调查孢子萌发率。

孢子萌发率＝孢子萌发数/未萌发孢子数×100％

12h后，对照萌发率为90％，添加了发酵液与发酵滤液的孢子萌 发率为8％、10％。均有效地抑制了孢子萌发，抑制率分别为91％、89％。

4.2.3 GSBM05发酵液对真菌的抑菌谱测定

将葡萄炭疽病菌、葡萄穗轴褐枯病菌、葡萄枝枯病菌、杨树水泡 溃疡病菌、杨树腐烂病菌在PDA培养基上活化备用，采用菌落生长速 率法：将获得的发酵液与PDA培养基按1:10体积比混合制作PDA平 板，在平板中央接直径为0.5cm的上述病原菌的菌碟，25℃下培养， 定期检查并测定菌落生长直径，并计算抑菌率。

结果如表2所示，菌株GSBM05对5种供试植物病原真菌均表现 出强烈的抑制效果，抑菌率均在50％以上，说明菌株GSBM05具有广 谱的抑菌能力，可用于多种病害的生物防治。

表2

4.3 GSBM05菌剂对葡萄白腐病的防治作用

4.3.1葡萄果实和叶片预处理：选取外观整齐、无病虫害、无外 伤的果实和叶片，先用自来水冲洗干净，然后用75％酒精喷洒消毒， 2min后用无菌滤纸擦干。将叶片和果实放入铺有无菌滤纸的直径为 100mm的培养皿中，加入无菌水保湿，每个处理叶片和果实各8个， 重复3次。

4.3.2接种液制备：葡萄白腐病菌在PDA平板上28℃培养，待 充分产孢后，加无菌1％葡萄糖溶液10mL，用无菌棉签洗下孢子和菌 丝体，经无菌脱脂棉过滤，除去菌丝体，再用无菌1％葡萄糖溶液配 成悬浮液，将孢子含量调到10×10倍视野含80-100个孢子。

分别取葡萄白腐病菌的孢子悬浮液1mL、0.5mL、2mL与1mL GSBM05 发酵液加入到离心管中混匀，并标号为a、b、c，分别取葡萄白腐病 菌的孢子悬浮液1mL、0.5mL、2mL与1mLGSBM05发酵滤液加入到离 心管中混匀，并标号为d、e、f，以只接种GSBM05的发酵液、发酵滤液、葡萄白腐病菌、无菌水为对照，并分别标号为g、h、i、j。

4.3.3病原菌接种：用消毒接种针在每个果实上刺伤一个1mm左 右的伤口，叶片刺伤4-5个伤口，在伤口处分别接种50uL a、b、c、 d、e、f、g、h、i、j接种液，28℃保湿培养，3d后进行病情调查并 计算病情指数和防治效果。室内离体组织试验病级分类按表3标准进 行。

表3葡萄白腐病果实病斑分级标准

病斑直径	分级	代表值
			0	0	0
1.00～5.99	I	1
			6.00～10.99	II	2
11.00～15.99	III	3
			16.00～19.99	IV	4
＞20.00	V	5

表4葡萄白腐病叶片分级标准

判定标准	分级	代表值
			无病斑	0	0
病斑占叶片面积25％以下	I	1
			病斑占叶片面积25％-50％	II	2
病斑占叶片面积50％-75％	III	3
			病斑占叶片面积75％以上	IV	4

表5 GSBM05菌剂对葡萄离体果实的防治效果测定

表6 GSBM05菌剂对葡萄离体叶片的防治效果测定

由表5、表6可知，GSBM05菌剂对葡萄白腐病菌侵染后的葡萄叶 片和果实均有较好的抑制效果，病斑直径和面积明显小于只接种葡萄 白腐病菌的对照组。单独接种发酵液和发酵滤液对葡萄果实和叶片也 没有影响，说明，GSBM05菌剂对葡萄没有毒性，并且可以抑制病原 菌的生长，可有效控制病原菌的侵染。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省葡萄研究院

<120> 一种甲基营养型芽孢杆菌及其生防菌剂和应用

<130> 无

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ctacggctac cttgttacga 20

<210> 3

<211> 1425

<212> DNA

<213> Bacillus methylotrophicus

<400> 3

tcggcggctg gctcctaaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt 60

gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120

tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga 180

tttgtgggat tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg 240

tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300

tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg 360

cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420

cctgtcactc tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga 480

cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540

ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat 600

gcgttagctg cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg 660

cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag 720

ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc 780

gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc 840

tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac 900

gcccaataat tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960

tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt 1020

cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc 1080

gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140

gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg 1200

tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga 1260

agccaccttt tatgtctgaa ccatgcggtt caaacaacca tccggtatta gccccggttt 1320

cccggagtta tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1380

aacatcaggg agcaagctcc catctgtccg ctcgactgca tgtat 1425

Claims (7)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌，其特征在于，甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus GSBM05，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC NO.13556，保藏日期为2017年1月10日。

2.一种甲基营养型芽孢杆菌，其特征在于，所述的甲基营养型芽孢杆菌对葡萄植株安全。

3.如权利要求所述的甲基营养型芽孢杆菌在防治葡萄白腐病方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus GSBM05制备成生防菌剂。

5.一种甲基营养型芽孢杆菌生防菌剂，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌生防菌剂包括甲基营养型芽孢杆菌发酵液或发酵液滤液，制备步骤如下：

(1)活化菌株：将保存好的甲基营养型芽孢杆菌GSBM05于NA培养基中划线并置于28℃培养箱中24h；

(2)制备种子液：挑取NA培养基上的GSBM05单菌落接种到NB液体培养基中，28℃下180r/min震荡培养24h；

(3)制备发酵液：按体积比以5％接种量将步骤(2)中制备的GSBM05种子液接种于发酵培养基中，培养基初始pH为6.5、发酵温度为28℃、震荡频率为150r/min、发酵时间为60h；经平板计数，菌液浓度大于2.0×10¹⁰cfu/mL；

(4)制备发酵液滤液：将步骤(3)中制备得到的GSBM05发酵液在10000r/min下离心20min，取上清液，经直径为0.22um的微孔滤膜过滤得到发酵滤液。

6.根据权利要求5所述的一种甲基营养型芽孢杆菌生防菌剂，其特征在于，所述步骤(3)中微生物菌剂的发酵培养基为：淀粉20g/L、大豆饼粉5g/L、酵母提取物20g/L、NaCl 5g/L、CaCO₃ 2g/L，初始pH6.5。

7.如权利要求5所述的一种甲基营养型芽孢杆菌GSBM05微生物菌剂在防治葡萄白腐病上的应用。