CN111328836A - 一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂 - Google Patents

Abstract

一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，包括如下份数的组分：芽孢杆菌GSBM05发酵液90‑110体积份数；硅藻土2‑10重量份数；羧甲基纤维素钠0.1‑0.7重量份数；聚乙烯醇0.1‑0.7重量份数；黄原胶0.1‑0.6重量份数。本发明所生产的涂抹剂，较化学药剂相比对环境影响小，不会产生抗药性，且使用方便，涂抹使用即可，最为重要的是本发明所制得的涂抹剂在葡萄植株患病后仍能起到很好的防治效果，能够有效的确保患病葡萄植株的成活率。芽孢杆菌GSBM05是由本实验室在健康葡萄园根际土壤中分离得到的菌株，试验表明，该菌对葡萄根癌病菌具有良好的抑菌活性，因此，将该菌制成涂抹剂防治葡萄根癌病，对葡萄的安全生产具有重大意义。

Description

一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂

技术领域

本发明属于葡萄根癌病防治领域，具体地说是一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂及其制备方法。

背景技术

葡萄根癌病属于系统侵染性病害，它的典型症状是在葡萄的根颈、老龄树干、幼龄枝蔓等器官上出现一至数个大小不等、形状各异的瘿瘤，在葡萄整个生长期内均可发生。受害植株由于皮层及疏导组织遭到破坏，故生长衰弱，叶片小而黄，果穗小，严重者全株枯死。根癌病的发生，已成为对酿酒葡萄优质高效、安全生产潜在危险较大的病害。另外也极大的降低了葡萄酒品质。尤其在威海、蓬莱、济南等地区的一些葡萄园根癌病的发生极为严重。已对农民造成了重大经济损失。目前，化学防治是葡萄根癌病的一个重要手段，但是长期使用会造成环境污染、病原物抗药性等诸多问题。在寻求安全有效的防治措施中，生防菌以其独特的优势成为一类极具应用潜能的新的资源生物。对于生防菌的研究，近年来多是对这些菌株生防机理方面的研究，这些菌株多是从冠瘿瘤中分离获得的非致病菌，通过产生农杆菌素抑制根癌病发生。总体来讲是由于其抢先占领伤口位点，通过位点及营养竞争、分泌细菌素、诱导植物产生抗性等阻止病菌从伤口侵入，但其作用总的来说是预防而不是治疗，植株一旦发病，其作用极其有限。

发明内容

本发明提供一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，用以解决现有技术中的缺陷。

本发明通过以下技术方案予以实现：

一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，包括如下份数的组分：

如上所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，所述的芽孢杆菌GSBM05发酵液的制备包括如下步骤：

步骤一：选取芽孢杆菌GSBM05菌株放入培养液中在28℃的温度下180rpm震荡培养24h，得种子液；

步骤二：向种子液中加入培养液，在28℃的温度下180rpm震荡培养72h，得芽孢杆菌GSBM05发酵液。

如上所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，所述的培养液为牛肉膏-蛋白胨-氯化钠混合水溶液。

如上所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，所述的培养液中牛肉膏的浓度为5g/L。

如上所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，所述的培养液中蛋白胨的浓度为10g/L。

如上所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，所述的培养液中氯化钠的浓度为5g/L。

如上所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，所述的步骤二中种子液与加入的培养液的体积比为1:20。

如上所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，制备方法为在搅拌条件下向发酵液中分批次加入硅藻土、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、黄原胶，至搅拌均匀为止，得涂抹剂。

本发明的优点是：本发明所生产的涂抹剂，较化学药剂相比对环境影响小，不会产生抗药性，且使用方便，涂抹使用即可，最为重要的是本发明所制得的涂抹剂在葡萄植株患病后仍能起到很好的防治效果，能够有效的确保患病葡萄植株的成活率。芽孢杆菌GSBM05是由本实验室在葡萄园根际土壤中分离得到的菌株，试验表明，该菌对葡萄根癌病菌具有良好的抑菌活性，因此，将该菌制成涂抹剂防治葡萄根癌病，对葡萄的安全生产具有重大意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实验室制备的菌剂成品；

图2是芽孢杆菌GSBM05发酵液平板抑菌试验的示意图；

图3是涂抹剂活菌验证时涂板的示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

步骤一：准确称量50g牛肉膏、100g蛋白胨、50g氯化钠，加蒸馏水溶解并补加蒸馏水定容至10L，得培养液；

步骤二：选取芽孢杆菌GSBM05单菌落放入5L培养液中在28℃的温度下180rpm震荡培养24h，得种子液；

步骤三：取250ml种子液中加入5L培养液，在28℃的温度下180rpm震荡培养72h，得芽孢杆菌GSBM05发酵液。

实施例2

准确称取2g硅藻土、0.1g羧甲基纤维素钠、0.1g聚乙烯醇、0.2g黄原胶，混合后在搅拌条件下分批次加入100ml的实施例1至混合均匀，记为实施例2。

实施例3

准确称取2g硅藻土、0.3g羧甲基纤维素钠、0.3g聚乙烯醇、0.4g黄原胶，混合后在搅拌条件下分批次加入100ml的实施例1至混合均匀，记为实施例3。

实施例4

准确称取2g硅藻土、0.5g羧甲基纤维素钠、0.5g聚乙烯醇、0.6g黄原胶，混合后在搅拌条件下分批次加入100ml的实施例1至混合均匀，记为实施例4。

实施例5

准确称取5g硅藻土、0.1g羧甲基纤维素钠、0.3g聚乙烯醇、0.6g黄原胶，混合后在搅拌条件下分批次加入100ml的实施例1至混合均匀，记为实施例5。

实施例6

准确称取5g硅藻土、0.3g羧甲基纤维素钠、0.5g聚乙烯醇、0.2g黄原胶，混合后在搅拌条件下分批次加入100ml的实施例1至混合均匀，记为实施例6。

实施例7

准确称取5g硅藻土、0.5g羧甲基纤维素钠、0.1g聚乙烯醇、0.4g黄原胶，混合后在搅拌条件下分批次加入100ml的实施例1至混合均匀，记为实施例7。

实施例8

准确称取10g硅藻土、0.1g羧甲基纤维素钠、0.5g聚乙烯醇、0.4g黄原胶，混合后在搅拌条件下分批次加入100ml的实施例1至混合均匀，记为实施例8。

实施例9

准确称取10g硅藻土、0.3g羧甲基纤维素钠、0.1g聚乙烯醇、0.6g黄原胶，混合后在搅拌条件下分批次加入100ml的实施例1至混合均匀，记为实施例9。

实施例10

准确称取10g硅藻土、0.5g羧甲基纤维素钠、0.3g聚乙烯醇、0.2g黄原胶，混合后在搅拌条件下分批次加入100ml的实施例1至混合均匀，记为实施例10。

实施例11

挑取保存的葡萄根癌病菌菌株与YEB液体培养基(酵母提取物1g，牛肉浸膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，七水合硫酸镁0.5g，加蒸馏水至1L，琼脂15g，pH 7.8)平板上划线，28℃培养72h，挑取单菌落于YEB液体培养基中28℃160r/min培养24h，制备浓度为1×10⁸cfu/mL的菌悬液。将5mL菌液加入100mL YEB固体培养基中混匀倒平板，培养皿中央用打孔器打1cm的孔，中间加入本发明所得涂抹剂50μL。28℃培养48h，在培养皿中央形成了半径为1.5cm的抑菌圈。

由实施例11的验证结果可以得出，本发明所制得的涂抹剂能够有效的起到抑制葡萄根癌病菌生长的作用。

验证实验1

取实施例2-10所得涂抹剂进行粘度和成膜时间检测，并将实施例2-10涂抹剂密封室温保存一个月后，采用稀释平板法对活菌量进行检测；其结果如表一所示。

涂抹剂的粘度检测方法：采用ZAHN蔡恩杯5号杯进行检测，使用前现将杯体清洗干净并干燥，将样品和流出杯温度调节至23℃±0.5℃，手指插入手柄上的小环中，快速而平稳地将杯体从待测样品中垂直提起，当杯体离开液面起计时，当出现第一个断点时停止计时，此时流出的时间秒数表示一定大小的粘度值。

按照下面公式将流出时间换算成运动粘度；

V＝K×(t-c)

式中：V＝运动粘度，cst；t＝流出时间；K值为23；C值为0。

成膜时间的检测方法：将葡萄成熟期枝条剪成5cm小段，用毛笔将菌剂涂抹在枝条上，并计时，菌剂成膜后停止计时。

组别	粘度(cst)	成膜时间(min)	活菌量(cfu/mL)
				实施例2	435.39	9	2.52×10<sup>7</sup>
实施例3	690.77	5	1.09×10<sup>8</sup>
				实施例4	1840.00	3	1.67×10<sup>8</sup>
实施例5	1285.82	7	1.40×10<sup>8</sup>
				实施例6	331.12	5	5.02×10<sup>7</sup>
实施例7	823.4	4	3.12×10<sup>7</sup>
				实施例8	525.24	2	5.17×10<sup>7</sup>
实施例9	1123.09	3	7.90×10<sup>7</sup>
				实施例10	340.17	3	1.04×10<sup>8</sup>

表一

由表一数据可知实施例4所得涂抹剂粘度最高，成膜时间较短，且活菌量最大，故而实施例4的组分配比应为最优配比。

验证实验2

挑取保存的葡萄根癌病菌菌株与YEB液体培养基(酵母提取物1g，牛肉浸膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，七水合硫酸镁0.5g，加蒸馏水至1L，琼脂15g，pH 7.8)平板上划线，28℃培养72h，挑取单菌落于YEB液体培养基中28℃160r/min培养24h，制备浓度为1×10⁸cfu/mL的菌悬液。选取生长状况相似的葡萄幼苗3300株，以划伤接种方式用灭菌脱脂棉蘸取菌液接种到葡萄幼苗根茎处，每株葡萄幼苗的菌液接种体积为50-100μL用保鲜膜包裹并保湿。将3300株葡萄幼苗每100株分为一组，以无菌水处理作为对照例1，以5度石硫合剂水溶液处理作为对照例2加上本发明实施例2-10所得的涂抹剂，实施例2-10以及对照例1-2每个药剂分别选取3组已经接种葡萄根癌病菌的葡萄幼苗，每个产品的3组已经接种葡萄根癌病菌的葡萄幼苗选择3种施药方式，即先接种药剂后24h再接种病原菌、病原菌和药剂混合后同时接种、接种病原菌后24h后接种药剂，实施例2-10以及对照例1-2均采用用灭菌脱脂棉或毛笔蘸取涂抹在葡萄幼苗根茎处的处理方式，同时实施例2-10以及对照例1-2的每株葡萄幼苗根茎的涂抹体积为50-100μL。将处理好的33组葡萄幼苗在28℃、光照4000lx条件下培养，30天后观察统计葡萄幼苗生长状况，对每组未患葡萄根癌病的健康葡萄幼苗数量进行统计，其结果如表二所示。

表二

由表二数据可以得知在对照组1仅使用无菌水接种根癌病菌后幼苗大量死亡，对照例2使用5度石硫合剂水溶液在预防葡萄根癌病菌有较好的作用，但是对于已经患病的幼苗其防治效果较差，而本发明实施例2-10不仅能够起到良好的预防葡萄根癌病菌作用，而且针对已经患病的幼苗还有很高的防治效果，较对照例2而言，对于已经患病的幼苗能够大大提高其成活率，且本发明实施例2-10对于葡萄根癌病菌的预防效果也好于对照例2，且生物制剂对环境影响较小，适于在葡萄种植领域广泛推广。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，其特征在于：包括如下份数的组分：

芽孢杆菌GSBM05发酵液 90-110体积份数；

硅藻土 2-10重量份数；

羧甲基纤维素钠 0.1-0.7重量份数；

聚乙烯醇 0.1-0.7重量份数；

黄原胶 0.2-0.6重量份数。

2.根据权利要求1所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，其特征在于：所述的芽孢杆菌GSBM05发酵液的制备包括如下步骤：

步骤一：从平板上挑取芽孢杆菌GSBM05单菌落于培养液中在28℃的温度下180 rpm震荡培养24 h，得种子液；

步骤二：向种子液中加入培养液，在28℃的温度下180 rpm震荡培养72 h，得芽孢杆菌GSBM05发酵液。

3.根据权利要求2所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，其特征在于：所述的培养液为牛肉膏-蛋白胨-氯化钠混合水溶液。

4.根据权利要求3所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，其特征在于：

所述的培养液中牛肉膏的浓度为5g/L；

所述的培养液中蛋白胨的浓度为10g/L；

所述的培养液中氯化钠的浓度为5g/L。

5.根据权利要求1所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，其特征在于：所述的步骤二中种子液与加入的培养液的体积比为1:20。

6.根据权利要求1所述的一种防治葡萄根癌病的芽孢杆菌涂抹剂，其特征在于：制备方法为在搅拌条件下向发酵液中分批次加入硅藻土、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、黄原胶，至搅拌均匀为止，得涂抹剂。

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