CN112175869B

CN112175869B - 一种假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN112175869B
Application number: CN202011074653.6A
Authority: CN
Inventors: 路兆军; 苗杰; 刘瑞珍; 王淑惠; 马旭升; 王益星; 赵莹
Original assignee: Yantai Forestry Research Institute
Current assignee: Yantai Forestry Research Institute
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: CN112175869A

Abstract

本发明公开一种假单胞菌Pseudomonas sp.CGMCC No.20361，通过对该菌株进行形态特征观察、生理生化反应、16S rDNA序列比对，最终鉴定将其鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.本发明菌株及其发酵滤液对苹果斑点落叶病菌、苹果褐斑病菌有拮抗活性；本发明菌株培养条件简单，其发酵滤液制备工艺简单、施用方便，具备从中开发新型、高效的苹果相关病害生防菌剂的潜力。

Description

一种假单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种假单胞菌Pseudomonas sp，还涉及该菌株及其发酵液的应用。

背景技术

苹果富含碳水化合物、维生素和矿物质等多种元素，营养价值极高。我国种植苹果的历史悠久，可追溯至魏晋时期。自19世纪70年代国外品种“大苹果”引入我国以来，因其较佳的品质而逐渐发展成为我国苹果栽培的主要品种(张玉星2003)。目前我国已成为全球最大的苹果生产和消费国，随着集约化生产程度的提高及栽培品种的过度单一化，苹果病虫害的发生也越来越普遍和严重。

苹果斑点落叶病和苹果褐斑病是我国苹果产区普遍发生且危害最为严重的病害。病害流行可导致苹果叶片大量提前脱落，严重影响果树的生长发育及苹果的产量与质量。

目前，苹果斑点落叶病和苹果褐斑病的防治主要依赖化学农药，化学防治虽成本低见效快但长期使用会带来诸如病原菌抗药性、果品农残、人体健康、环境污染等问题。因此，开发相关的生防微生物制剂并在苹果生产中逐步替代化学农药，对促进苹果产业绿色、可持续健康发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种假单胞菌及其应用，该菌株及其发酵液对苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌具有显著抑制效果。

一种对苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌具有拮抗活性的假单胞菌，是从中国山东省烟台市蓬莱区健康苹果树根际土壤中分离得到。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日：2020年7月15日，保藏编号：CGMCC No.20361，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。该菌株分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.。

本发明的假单胞菌Pseudomonas sp.的培养条件简单，在多数培养基上生长良好，在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上形成近圆形、乳白色至淡黄色菌落，边缘较为规则，中央稍隆起，不透明，菌体杆状，无芽孢，有鞭毛，革兰氏阴性。该菌为好氧菌，销酸盐还原试验无颜色变化，可液化明胶试管培养基，葡萄糖发酵反应无气泡产生及颜色变化，淀粉水解反应不产生水解圈，在加入2％的氯化钠的平板上可正常生长但不能在加入5％的氯化钠的平板上生长，在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上于4℃条件下可缓慢生长。

以该菌株的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA序列通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3’)、1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)为引物PCR扩增出约1.5kb左右的片段，测序结果表明扩增出的序列长度为1435bp，测序结果见序列表的核苷酸序列。将该菌株的16S rDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号GenBank NO.MT378354。将该序列与GenBank数据库收录的代表菌株的16S rDNA基因核苷酸序列进行同源性比对，结果与假单胞菌(Pseudomonas sp.)的同源性达99％，用MEGA5构建系统发育树。结合形态观察、生理生化测定及分子鉴定结果，将该菌株命名为假单胞菌Pseudomonas sp.。

本发明涉及的基于上述菌株的发酵滤液是这样实现的：将菌株活化后按2％的体积比接入含100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃、200rpm震荡培养72h即得发酵液，发酵液经5000r/min离心10min，取上清液用0.22μm的微孔滤器过滤除菌后得到发酵滤液。发酵培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCL5g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.0-7.5，121℃灭菌20min。

本发明所述假单胞菌Pseudomonas sp.及其发酵滤液对苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌的拮抗活性是分别采用平板对峙法和生长速率法实现的。所述菌株及其发酵滤液对苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌有良好的拮抗活性。

上述假单胞菌的发酵滤液对上述2种病原菌在离体叶片上的防效测定是采用平皿叶片法实现的。所述假单胞菌的发酵滤液可显著降低上述2种病原菌在离体叶片上的病情指数，防效良好。

本发明提供的假单胞菌Pseudomonas sp.对苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌具有较强的拮抗活性，其发酵滤液对上述2种病原菌具有良好的离体叶片防效，且制备工艺简单、施用方便，具备从中开发新型、高效的苹果相关病害生防菌剂的潜力。

附图说明

图1：实施例1中假单胞菌Pseudomonas sp.在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，培养2d时的菌落形态；

图2：实施例1中依据16S rDNA序列构建的假单胞菌菌株Pseudomonas sp.与相关菌株的系统发育树；

图3：实施例2中采用平板对峙法的假单胞菌Pseudomonas sp.对苹果斑点落叶病菌的拮抗效果图(A为对照，B为对峙平板)；

图4：实施例2中采用平板对峙法的假单胞菌Pseudomonas sp.对苹果褐斑病菌的拮抗效果图(A为对照，B为对峙平板)。

所述假单胞菌Pseudomonas sp.已于2020年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为：CGMCC，保藏编号：CGMCC No.20361。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员了解本发明。

以下实施例所用培养基如下：

马铃薯胡萝卜培养基(PCDA)的组分及配比以g/L计为：马铃薯100g，胡萝卜100g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min。用于苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌的培养、保存，以及一种假单胞菌Pseudomonas sp.对上述2种病原菌的拮抗活性分析。

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)的组分及配比以g/L计为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCL5g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min。用于一种假单胞菌Pseudomonassp.的斜面及平板的培养和保存。

牛肉膏蛋白胨液体培养基(NB)的组分及配比以g/L计为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCL5g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.0-7.5，121℃灭菌20min。用于一种假单胞菌Pseudomonas sp.的发酵培养。

实施例1

本发明的假单胞菌Pseudomonas sp.的分离及鉴定

A、假单胞菌Pseudomonas sp.的分离及保存

步骤1)标本采集：采集中国山东省烟台市蓬莱区健康苹果树根际土壤，用无菌袋装好备用。

步骤2)假单胞菌Pseudomonas sp.的分离纯化：将采集到的土壤样品风干后研碎。称取土样10g放入锥形瓶中，加入90mL无菌水，摇床震荡30min，得到土样的悬浊液。吸取1mL悬浊液，加入到装有9mL无菌水的小试管中，混合均匀，制得浓度为10^-2的土样稀释液，采用相同方法依次得到浓度为10^-5、10^-6的土样稀释液。吸取2种浓度的稀释液各100μL分别在NA培养基上用涂布棒涂布，3次重复，30℃培养2d后，用接种针挑出单菌落，用划线法将菌株接种于NA培养基上，30℃培养2d后挑出单菌落保存。

步骤3)菌种保存：将纯化好的菌株置于4℃冰箱保存，保存培养基为NA培养基。

B、假单胞菌Pseudomonas sp.的鉴定

本发明所述的假单胞菌Pseudomonas sp.是依据其菌落形态特征、生理生化特征、16S rDNA基因序列的系统发育树进行鉴定。

步骤1)形态特征

所述菌株在NA平板上形成近圆形、乳白色至淡黄色菌落，边缘较为规则，中央稍隆起，不透明(图1)，菌体杆状，无芽孢，有鞭毛，革兰氏阴性。

步骤2)所述菌株的生理生化特征

表1、假单胞菌Pseudomonas sp.的生理生化特征

检测项目	结果	检测项目	结果
				需氧性	+	淀粉水解	-
硝酸盐还原	-	2％NaCl	+
				明胶液化	+	5％NaCl	-
葡萄糖发酵	-	4℃生长	+

步骤3)所述菌株的分子鉴定

以所述菌株的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA序列通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3’)、1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)为引物PCR扩增出约1.5kb左右的片段，测序结果表明扩增出的序列长度为1435bp，测序结果见序列表的核苷酸序列，将该菌株的16S rDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号GenBank NO.MT378354。将该序列与GenBank数据库收录的代表菌株的16S rDNA基因核苷酸序列进行同源性比对，结果与假单胞菌(Pseudomonas sp.)的同源性达99％，用MEGA5构建系统发育树(图2)。结合形态观察、生理生化测定及分子鉴定结果，将该菌株命名为假单胞菌Pseudomonas sp.。

实施例2

本发明的假单胞菌Pseudomonas sp.的抗菌活性分析

采用平板对峙生长法对所述的假单胞菌Pseudomonas sp.进行抗菌活性分析：以苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌为指示菌，用6mm打孔器打取活化好的指示菌菌饼置于平板中央，采用点接法接种假单胞菌Pseudomonas sp，两菌相距约4.5cm，且在一条直径上，对照组只接种指示菌菌饼，3次重复，28℃黑暗中静置培养，待对照组长满平板后观察试验组病原菌生长情况，测量抑菌带(图3、图4、表2)。

表2、假单胞菌Pseudomonas sp.对2种指示菌的抗菌活性分析

指示菌	对照组半径(mm)	处理组半径(mm)	抑菌带宽度(mm)
				苹果斑点落叶病菌	42.08±1.08	15.03±0.70	27.05±0.13
苹果褐斑病菌	11.67±0.58	3.33±0.58	8.33±0.12

实施例3

本发明的假单胞菌Pseudomonas sp.的发酵滤液的抗菌活性分析

将本发明的假单胞菌Pseudomonas sp.活化后按2％的体积比接入含100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃、200rpm震荡培养72h即得发酵液，发酵液经5000r/min离心10min，取上清液用0.22μm的微孔滤器过滤除菌后得到发酵滤液。发酵滤液按1：50的体积比与50℃左右已灭菌的PCDA培养基混匀后倒平板，以苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌为指示菌，用6mm打孔器打取活化好的指示菌菌饼置于平板中央，采用生长速率法分析该菌发酵滤液的抗菌活性，以未加发酵滤液的平板为对照，3次重复，抑菌率计算公式：抑菌率(％)＝(对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径)/对照病原菌菌落直径×100％(表3)。

表3、假单胞菌Pseudomonas sp.发酵滤液对2种指示菌的抗菌活性

指示菌	对照组直径(mm)	处理组直径(mm)	抑菌率(％)
				苹果斑点落叶病菌	83.59±1.76	33.94±1.32	59.40±0.02
苹果褐斑病菌	20.46±1.28	7.11±0.54	65.23±0.03

实施例4

本发明的假单胞菌Pseudomonas sp.的发酵滤液对苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌在离体叶片上的防效测定

采用平皿叶片法测定所述假单胞菌Pseudomonas sp.的发酵滤液对苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌的生防效果：纱布浸湿后平铺在培养皿底部，用浸湿的脱脂棉包裹叶柄后将叶龄、大小一致的健康新鲜苹果叶片置于纱布上。用发酵滤液对叶片进行喷雾处理，每24h喷雾一次，共3次，以无菌水喷雾为对照。发酵滤液喷雾处理结束24h后用手术刀擦伤叶片，配制浓度为10⁶个/ml的病原菌孢子悬液，对处理后的叶片进行病原菌孢子悬液喷雾，每个处理20片叶子，3次重复。10天后按照病情分级标准进行调查和统计防效。病情分级标准、病情指数和防治效果计算公式如下：

病情分级标准为：

0级：叶面无病斑

1级：病斑占叶片面积的10％以下；

3级：病斑占叶片面积的11％-25％；

5级：病斑占叶片面积的26％-40％；

7级：病斑占叶片面积的41％-65％；

9级：病斑占叶片面积的66％以上；

表4、假单胞菌Pseudomonas sp.的发酵滤液的防效测定

结果表明：所述假单胞菌Pseudomonas sp.的发酵滤液可显著降低苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌在苹果离体叶片上的发病程度，处理组病情指数明显降低，该菌株的发酵滤液对上述2种病原菌的离体叶片防效分别为54.50％、63.55％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 烟台市林业科学研究所

<120> 一种假单胞菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1435

<212> DNA

<213> 一种假单胞菌(Pseudomonas sp.)

<400> 1

gctacctgca agtcgagcgg tagagaggtg cttgcacctc ttgagagcgg cggacgggtg 60

agtaatacct aggaatctgc ctggtagtgg gggataacgt tcggaaacgg acgctaatac 120

cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga ccttcgggcc ttgcgctatc agatgagcct 180

aggtcggatt agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag gctacgatcc gtaactggtc 240

tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc 300

agtggggaat attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa 360

ggtcttcgga ttgtaaagca ctttaagttg ggaggaaggg cattaaccta atacgttagt 420

gctttgacgt taccgacaga ataagcaccg gctaactctg tgccagcagc cgcggtaata 480

cagagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcgcgtagg tggtttgtta 540

agttgaatgt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca tccaaaactg gcaagctaga 600

gtatggtaga gggtggtgga atttcctgtg tagcggtgaa atgcgtagat ataggaagga 660

acaccagtgg cgaaggcgac cacctggact gatactgaca ctgaggtgcg aaagcgtggg 720

gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcaa ctagccgttg 780

ggagtcttga actcttagtg gcgcagctaa cgcattaagt tgaccgcctg gggagtacgg 840

ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 900

ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggccttgac atccaatgaa ctttctagag 960

atagattggt gccttcggga acattgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020

cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct tgtccttagt taccagcacg 1080

taatggtggg cactctaagg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1140

caagtcatca tggcccttac ggcctgggct acacacgtgc tacaatggtc ggtacaaagg 1200

gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc ataaaaccga tcgtagtccg gatcgcagtc 1260

tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgt gaatcagaat gtcacggtga 1320

atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaccagaa 1380

gtagctagtc taaccctcgg gaggacggtt accacggtgt gattcatgac tgggt 1435

Claims

1.一种假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株，其特征在于：该菌株于2020年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20361。

2.如权利要求1所述的一种假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株或其发酵滤液在抑制苹果斑点落叶病菌和苹果褐斑病菌中的应用，其特征在于，所述菌株的发酵滤液的制备方法为：将菌株活化后按2%的体积比接入含100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃、200rpm震荡培养72h即得发酵液，发酵液经5000r/min离心10min，取上清液用0.22μm的微孔滤器过滤除菌后得到发酵滤液。