CN107517855A - 获得甘蔗健康种苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得甘蔗健康种苗的方法，对甘蔗植株分别进行SCBV、Lxx、SrMV、SCMV和ScYLV的PCR检测，将检测健康的甘蔗植株移种到具有隔离保护措施的网室大棚内，作为健康甘蔗种源以及为组培扩繁提供外植体材料。应用本发明能有效防止甘蔗免受病原物感染，从源头上保证所繁育出来的甘蔗种苗全部保持健康状态。总之，本发明具有目标明确、技术简单、健康率高、可持续产出、生产成本低廉等优点。
Description
技术领域
本发明属于甘蔗健康种苗高效繁育技术领域，尤其涉及一种获得甘蔗健康种苗的方法。
背景技术
甘蔗是我国主要的糖料作物，甘蔗产量和含糖量是制约糖业发展的关键因素。甘蔗在种植过程中常受到高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒、甘蔗黄叶病毒、甘蔗杆状病毒、宿根矮化病、甘蔗黑穗病和梢腐病等病害的危害，造成甘蔗产量和含糖量下降。
在生产上通常是以蔗茎作为种子进行无性繁殖，经多代无性繁殖后种茎携带各种病原物的比例大幅提高，导致甘蔗种茎种性退化严重，甘蔗产量和质量逐渐下降，给甘蔗产业造成巨大损失。此外，携带病原物的甘蔗也会作为毒源传染其他健康甘蔗植株，危害进一步扩大。为此，设法获得健康甘蔗种苗并对健康甘蔗种苗进行扩繁，以生产符合行业标准要求的合格甘蔗种茎是蔗糖产业健康发展迫切所需。因此，探寻简单、高效、低成本的甘蔗健康种苗繁育方法已成为一个研究热点。
目前茎尖脱毒是培育甘蔗健康种苗的主要方法，该方法以含病毒量相对低的甘蔗茎尖作为外植体进行组培快繁，然而这并不能彻底脱除甘蔗内的病毒，因此获得健康种苗的概率不高。而且，该方法有一定的盲目性，且组培苗生产数量庞大，检测成本过高，生产上很难实现大量样本的检测。另一种培育甘蔗健康种苗的方法是种茎温水处理法，该方法将甘蔗种茎放置在50℃左右的温水中浸泡一定时间，达到去除或钝化病原物的目的，然而该法需要特定设备，耗时、费力、增加生产成本，并且还不能彻底去除病毒。此外，目前甘蔗健康种苗的扩繁多在没有妥善保护措施的种苗繁育大田中进行。因此获得的各级种苗无法避免受病毒害的再次感染，也无法保证蔗种的健康性；并且种苗的优良种性退化严重，难以保障甘蔗健康种苗的可持续性产出。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种技术简单、成本低廉、健康率高且可持续产出的获得甘蔗健康种苗的方法，以期从源头上保证所繁育的甘蔗种苗保持健康状态。
为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：
获得甘蔗健康种苗的方法，对甘蔗植株分别进行SCBV、Lxx、SrMV、SCMV和ScYLV的PCR检测，将检测健康的甘蔗植株移种到具有隔离保护措施的网室大棚内，作为健康甘蔗种源以及为组培扩繁提供外植体材料。
PCR检测按以下操作进行：先提取甘蔗植株叶片的DNA，检测SCBV和Lxx，再对不带SCBV和Lxx的样品提取RNA，检测SrMV、SCMV、ScYLV，以上病毒害均不带者即为健康的甘蔗植株。
PCR检测各病毒害的PCR引物分别为：
SrMV：F：ACAGCAGAWGCAACRGCACAAGC，R：CTCWCCGACATTCCCATCCAAGCC；
SCMV：F：AATCTTGAGGAATGCGGAAAAC，R：ATCGATAGGCCCACAAATGAGTCT；
ScYLV：F：AATCAGTGCACACATCCGAG，R：GGAGCGTCGCCTACCTATT；
SCBV：F：GATGGATGACTGTTTCAGAGGC，R：GAGGGATGGTAAGATTTGGC：
Lxx：1：CCGAAGTGAGCAGATTGACC，2：ACCCTGTGTTGTTTTCAACG。
上述获得甘蔗健康种苗的方法，包括以下步骤：
A、健康甘蔗植株的筛选；
B、健康甘蔗植株的隔离保存；
C、健康外植体的培育；
D、健康种苗的扩繁。
步骤A按以下操作进行：从甘蔗种植大田中采集长势良好、外观没有病害症状的甘蔗植株叶片，对这些甘蔗植株进行SrMV、SCMV、ScYLV、SCBV和Lxx病毒害检测，先提取这些叶片的DNA，检测SCBV和Lxx；再对不带SCBV和Lxx样品的样品提取RNA，检测SrMV、SCMV、ScYLV，以上病毒害均不带者即为健康甘蔗。
步骤B按以下操作进行：将经检测的健康甘蔗植株移种到具有隔离保护措施的网室大棚内。
步骤C按以下操作进行：
①外植体处理：去除蔗芽的外层老叶，经75％酒精消毒后放入灭菌的超净台，取芽尖2-3mm的生长点接种；或者用甘蔗顶端去除老叶的分生组织作为外植体，需先用75％酒精消毒15min，再经升汞消毒30min，蒸馏水翻转震荡洗涤3-4遍，每遍洗涤5min，将消毒后的分生组织放入灭菌的超净台，再去除1-2层老叶，将其切成1-2mm厚的薄片接种；
②诱导与分化：将步骤①中获得的外植体接种在诱导培养基上，每瓶接种2个芽尖或5个分生组织薄片；当形成愈伤组织时将其转接到分化培养基上，每瓶接种四块，诱导与分化的培养条件均为温度29-31℃、光强2300Lx左右；
③生根培养与假植：将分化出嫩叶的组培苗转接到生根培养基上，置于29-31℃、2300Lx左右光强度的条件培养25天长成完整植株；经炼苗后将组培苗假植在大棚内的沙床上，26-28天即可移种。
步骤C中：
诱导培养基为MS+3.0mg/L 2，4一D+3％柠檬酸+3％Sugar+0.6％Agar，
分化培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+3％柠檬酸+3％Sugar+0.6％Agar，
生根培养基为1/2MS+4.0mg/L NAA+3％Sugar+0.6％Agar。
步骤D按以下操作进行：
①将步骤C③中获得的组培苗种植在具有防虫网的大棚内，种植行距为1.0-1.2m，种植沟深30cm，株距为25-30cm；控制棚内温度为28-37℃，种植170-180天后每棵甘蔗苗可获得2-4根甘蔗，每根甘蔗拥有7-12个有效芽，此即为原原种；
②将步骤D①中甘蔗收获切成15-20cm长的双芽段，种植在具有防虫网的大棚内，种植行距为1.0-1.2m，种植沟深30cm，，株距为25-30cm；控制棚内温度为28-37℃，种植170-180天后每棵甘蔗苗可获得2-4根甘蔗，每根甘蔗拥有7-12个有效芽，此即为原种；
③将步骤D②中原种切成15-20cm长的双芽段，种植在具有防虫网的大棚内，种植行距为1.0-1.2m，种植沟深30cm，株距为25-30cm；控制棚内温度为28-37℃，种植170-180天后每棵甘蔗苗可获得2-4根甘蔗，每根甘蔗拥有7-12个有效芽，此即为生产用种。
甘蔗为新台糖22、柳城05-136、桂糖42、桂糖46、桂糖49、福农41。
针对现有甘蔗健康种苗繁育方法存在的问题，发明人建立了一种获得甘蔗健康种苗的方法，对甘蔗植株分别进行SCBV、Lxx、SrMV、SCMV和ScYLV的PCR检测，将经检测的健康甘蔗植株移种到具有隔离保护措施的网室大棚内，作为健康甘蔗种源以及为组培扩繁提供外植体材料。应用本发明能有效防止甘蔗免受病原物感染，从源头上保证所繁育出来的甘蔗种苗全部保持健康状态。与现有获得甘蔗健康种苗的方法相比，本发明具有以下突出优点：
(1)本发明以健康甘蔗提供外植体，除芽尖外植株顶端去除老叶的分生组织也可作为外植体，因此比茎尖脱毒法节省甘蔗材料。
(2)本发明在组培前筛选健康甘蔗植株，比茎尖脱毒法筛选组培苗需要检测的样品量少，因此筛选成本低廉。
(3)本发明以健康甘蔗提供外植体，比茎尖脱毒的“盲目”筛选节省组培培养基和场地等资源，因此快繁成本低廉。
(4)本发明获得的组培苗健康率高。茎尖脱毒法不能保证获得的组培苗为健康种苗，其健康率虽比普通组培法的高，但并没有本发明所得甘蔗种苗的健康率高。
(5)本发明在网室大棚中进行健康种苗假植，从源头保证甘蔗种苗的健康性。
总之，本发明具有目标明确、技术简单、健康率高、可持续产出、生产成本低廉等优点，对加速甘蔗健康种苗的推广和甘蔗产业的发展具有积极的推动作用。
具体实施方式
应用本发明建立甘蔗健康种苗繁育体系，具体如下：
A、健康甘蔗植株的筛选
从甘蔗种植大田中采集长势高大粗壮，叶片深绿、无病斑、无卷曲的新台糖22、柳城05-136、桂糖42、桂糖46、桂糖49、福农41等优良品种的甘蔗植株叶片，对这些甘蔗植株进行SrMV(高粱花叶病毒)、SCMV(甘蔗花叶病毒)、ScYLV(甘蔗黄叶病毒)、SCBV(甘蔗杆状病毒)和Lxx(宿根矮化病)等病毒害检测，其中SrMV、SCMV、ScYLV为RNA病毒，需先提取相应甘蔗的RNA，再反转录为cDNA，最后进行PCR检测；SCBV为DNA病毒，Lxx为细菌病害，均以提取的总DNA为模板进行PCR检测；因此，筛选过程中先提取DNA检测SCBV和Lxx，再对不带SCBV和Lxx的样品检测RNA病毒，从而提高筛选效率，降低筛选成本和工作量，以上病毒害均不带者即为健康甘蔗。
PCR检测各病毒害的PCR引物分别为：
SrMV：F：ACAGCAGAWGCAACRGCACAAGC，R：CTCWCCGACATTCCCATCCAAGCC；
SCMV：F：AATCTTGAGGAATGCGGAAAAC，R：ATCGATAGGCCCACAAATGAGTCT；
ScYLV：F：AATCAGTGCACACATCCGAG，R：GGAGCGTCGCCTACCTATT；
SCBV：F：GATGGATGACTGTTTCAGAGGC，R：GAGGGATGGTAAGATTTGGC；
Lxx：1：CCGAAGTGAGCAGATTGACC，2：ACCCTGTGTTGTTTTCAACG。
为了提高筛选健康甘蔗的效率，在采样时可排除甘蔗叶片呈黄绿相间不规则条斑或斑驳症状的带病甘蔗，其中症状在嫩叶基部最为明显；此外，叶片发黄或带有褐色斑点以及植株相对矮小的也均为带毒植株；采样时应选取长势高大粗壮，叶片深绿、无病斑、无卷曲的甘蔗，据此可极大的提高获得健康甘蔗的概率，健康率可达到10％-20％。
B、健康甘蔗植株的隔离保存
将经检测的健康甘蔗植株移种到具有隔离保护措施的网室大棚中，防止蚜虫、老鼠等传播病毒，保证蔗种的健康性，以此作为健康甘蔗种源以及为组培扩繁提供外植体材料。
C、健康外植体的培育
①外植体处理：去除蔗芽的外层老叶，经75％酒精消毒后放入灭菌的超净台，取芽尖2-3mm的生长点接种；或者用甘蔗顶端去除老叶的分生组织作为外植体，需先用75％酒精消毒15min，再经升汞消毒30min，蒸馏水翻转震荡洗涤3-4遍，每遍洗涤5min，将消毒后的分生组织放入灭菌的超净台，再去除1-2层老叶，将其切成1-2mm厚的薄片接种；
②诱导与分化：将步骤①中获得的外植体接种在诱导培养基(MS+3.0mg/L 2，4-D+3％柠檬酸+3％Sugar+0.6％Agar)上，每瓶接种2个芽尖或5个分生组织薄片；当形成愈伤组织时将其转接到分化培养基(MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+3％柠檬酸+3％Sugar+0.6％Agar)上，每瓶接种四块，诱导与分化的培养条件均为温度29-31℃、光强2300Lx左右；
③生根培养与假植：将分化出嫩叶的组培苗转接到生根培养基(1/2MS+4.0mg/LNAA+3％Sugar+0.6％Agar)上，置于29-31℃、2300Lx左右光强度的条件培养25天左右即可长成完整植株；经炼苗后将组培苗假植在大棚内的沙床上，26-28天即可移种；所得甘蔗健康种苗可作为原原种、原种或生产用种进行扩繁或大田种植。
D、健康种苗的扩繁
①将步骤C③中获得的组培苗种植在具有防虫网的大棚内，种植行距为1.0-1.2m，种植沟深30cm，株距为25-30cm；控制棚内温度为28-37℃，种植170-180天后每棵甘蔗苗可获得2-4根甘蔗，每根甘蔗拥有7-12个有效芽，此即为原原种；
②将步骤D①中甘蔗收获切成15-20cm长的双芽段，种植在具有防虫网的大棚内，种植行距为1.0-1.2m，种植沟深30cm，，株距为25-30cm；控制棚内温度为28-37℃，种植170-180天后每棵甘蔗苗可获得2-4根甘蔗，每根甘蔗拥有7-12个有效芽，此即为原种；
③将步骤D②中原种切成15-20cm长的双芽段，种植在具有防虫网的大棚内，种植行距为1.0-1.2m，种植沟深30cm，株距为25-30cm；控制棚内温度为28-37℃，种植170-180天后每棵甘蔗苗可获得2-4根甘蔗，每根甘蔗拥有7-12个有效芽，此即为生产用种。
因为高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒、甘蔗黄叶病毒、甘蔗杆状病毒和宿根矮化病等会经过蚜虫叮咬、老鼠啃咬的方式传播，因此；所述具有防虫网的大棚可以防止咬过带病毒甘蔗的蚜虫和老鼠将病毒带入棚内传播给健康甘蔗。
将蔗茎切为双芽段的切刀需在切甘蔗前用95％酒精擦拭并灼烧消毒，因为以上病毒也可以通过机械损伤传播；用消毒的切刀切割蔗种可以避免病毒传播，维持蔗种的健康性。
参照上法，发明人已获得新台糖22、柳城05-136、桂糖42、桂糖46、桂糖49、福农41等优质健康甘蔗种苗。
健康蔗种和普通蔗种种植所得的甘蔗差异显著，以福农41为例，在相同种植情况下健康蔗种每个芽可分蘖6-8条甘蔗，普通蔗种分蘖4-6条甘蔗，前者的分蘖数约是后者的1.5倍；健康蔗种种出的甘蔗平均单条质量为1.6-1.8kg，普通蔗种的为1.2-1.4kg，前者约是后者的1.3倍；亩产量前者是后者的1.5倍左右。因此，选育健康甘蔗种苗是甘蔗高产的前提，意义重大。
序列表
<110> 广西大学
<120> 获得甘蔗健康种苗的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acagcagawg caacrgcaca agc 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcwccgaca ttcccatcca agcc 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcttgagg aatgcggaaa ac 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcgataggc ccacaaatga gtct 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatcagtgca cacatccgag 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggagcgtcgc ctacctatt 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatggatgac tgtttcagag gc 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagggatggt aagatttggc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgaagtgag cagattgacc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accctgtgtt gttttcaacg 20
Claims (10)
1.一种获得甘蔗健康种苗的方法，其特征在于对甘蔗植株分别进行SCBV、Lxx、SrMV、SCMV和ScYLV的PCR检测，将检测健康的甘蔗植株移种到具有隔离保护措施的网室大棚内，作为健康甘蔗种源以及为组培扩繁提供外植体材料。
2.根据权利要求1所述的获得甘蔗健康种苗的方法，其特征在于所述PCR检测按以下操作进行：先提取甘蔗植株叶片的DNA，检测SCBV和Lxx，再对不带SCBV和Lxx的样品提取RNA，检测SrMV、ScMV、ScYLV，以上病毒害均不带者即为健康的甘蔗植株。
3.根据权利要求2所述的获得甘蔗健康种苗的方法，其特征在于所述PCR检测各病毒害的PCR引物分别为：
SrMV：F：ACAGCAGAWGCAACRGCACAAGC，R：CTCWCCGACATTCCCATCCAAGCC；
SCMV：F：AATCTTGAGGAATGCGGAAAAC，R：ATCGATAGGCCCACAAATGAGTCT；
ScYLV：F：AATCAGTGCACACATCCGAG，R：GGAGCGTCGCCTACCTATT；
SCBV：F：GATGGATGACTGTTTCAGAGGC，R：GAGGGATGGTAAGATTTGGC；
Lxx：1：CCGAAGTGAGCAGATTGACC，2：ACCCTGTGTTGTTTTCAACG。
4.根据权利要求3所述的获得甘蔗健康种苗的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、健康甘蔗植株的筛选；
B、健康甘蔗植株的隔离保存；
C、健康外植体的培育；
D、健康种苗的扩繁。
5.根据权利要求4所述的获得甘蔗健康种苗的方法，其特征在于步骤A按以下操作进行：
从甘蔗种植大田中采集长势良好、外观没有病害症状的甘蔗植株叶片，对这些甘蔗植株进行SrMV、SCMV、ScYLV、SCBV和Lxx病毒害检测，先提取这些叶片的DNA，检测SCBV和Lxx；再对不带SCBV和Lxx样品的样品提取RNA，检测SrMV、SCMV、ScYLV，以上病毒害均不带者即为健康甘蔗。
6.根据权利要求4所述的获得甘蔗健康种苗的方法，其特征在于步骤B按以下操作进行：
将经检测的健康甘蔗植株移种到具有隔离保护措施的网室大棚中。
7.根据权利要求4所述的获得甘蔗健康种苗的方法，其特征在于步骤C按以下操作进行：
①外植体处理：去除蔗芽的外层老叶，经75％酒精消毒后放入灭菌的超净台，取芽尖2-3mm的生长点接种；或者用甘蔗顶端去除老叶的分生组织作为外植体，需先用75％酒精消毒15min，再经升汞消毒30min，蒸馏水翻转震荡洗涤3-4遍，每遍洗涤5min，将消毒后的分生组织放入灭菌的超净台，再去除1-2层老叶，将其切成1-2mm厚的薄片接种；
②诱导与分化：将步骤①中获得的外植体接种在诱导培养基上，每瓶接种2个芽尖或5个分生组织薄片；当形成愈伤组织时将其转接到分化培养基上，每瓶接种四块，诱导与分化的培养条件均为温度29-31℃、光强2300Lx左右；
③生根培养与假植：将分化出嫩叶的组培苗转接到生根培养基上，置于29-31℃、2300Lx左右光强度的条件培养25天长成完整植株；经炼苗后将组培苗假植在大棚内的沙床上，26-28天即可移种。
8.根据权利要求7所述的获得甘蔗健康种苗的方法，其特征在于步骤C中：
诱导培养基为MS+3.0mg/L 2，4-D+3％柠檬酸+3％Sugar+0.6％Agar，
分化培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+3％柠檬酸+3％Sugar+0.6％Agar，
生根培养基为1/2MS+4.0mg/L NAA+3％Sugar+0.6％Agar。
9.根据权利要求4所述的获得甘蔗健康种苗的方法，其特征在于步骤D按以下操作进行：
①将步骤C③中获得的组培苗种植在具有防虫网的大棚内，种植行距为1.0-1.2m，种植沟深30cm，株距为25-30cm；控制棚内温度为28-37℃，种植170-180天后每棵甘蔗苗可获得2-4根甘蔗，每根甘蔗拥有7-12个有效芽，此即为原原种；
②将步骤D①中甘蔗收获切成15-20cm长的双芽段，种植在具有防虫网的大棚内，种植行距为1.0-1.2m，种植沟深30cm，，株距为25-30cm；控制棚内温度为28-37℃，种植170-180天后每棵甘蔗苗可获得2-4根甘蔗，每根甘蔗拥有7-12个有效芽，此即为原种；
③将步骤D②中原种切成15-20cm长的双芽段，种植在具有防虫网的大棚内，种植行距为1.0-1.2m，种植沟深30cm，株距为25-30cm；控制棚内温度为28-37℃，种植170-180天后每棵甘蔗苗可获得2-4根甘蔗，每根甘蔗拥有7-12个有效芽，此即为生产用种。
10.根据权利要求1所述的获得甘蔗健康种苗的方法，其特征在于：所述甘蔗为新台糖22、柳城05-136、桂糖42、桂糖46、桂糖49、福农41。
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