CN109566410A

CN109566410A - 一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法

Info

Publication number: CN109566410A
Application number: CN201810619682.2A
Authority: CN
Inventors: 朱文丽; 陈松笔; 李开绵
Original assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Current assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Priority date: 2018-06-13
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2038-06-13
Also published as: CN109566410B

Abstract

本发明提供了一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法，包括以下步骤：预培养：取感染ACMV的木薯嫩茎经常规表面消毒后切取带腋芽茎段或未脱毒完全‑感染病毒试管苗的带腋芽茎段，接种到腋芽膨大诱导培养基上进行暗培养3‑7天；体细胞胚胎诱导培养：剥离经培养后膨大的腋芽，接种于体细胞胚胎诱导培养基上进行暗培养25‑35天；体细胞胚胎成熟培养：将体细胞胚胎组织块接种到体细胞胚成熟培养基上进行光照培养25‑35天；植株再生培养：将成熟体细胞胚胎组织块接种到植株再生培养基上进行光照培养28‑40天。本发明脱毒效率和繁殖系数高，外植体材料多，操作简易，速度快，再生植株数量多，苗生根率高，长势健壮。

Description

一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法

技术领域

本发明涉及一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法。

背景技术

木薯(Manihot esculenta Crantz)是大戟科(Euphorbiaceae)植物，染色体数为2n＝36，多年生灌木，高1-5m。木薯是仅次于水稻、玉米、高粱的第四大热带作物，其块根含有丰富的淀粉，既可作粮食，也可作为工业原料或饲料，是热带、亚热带地区6亿人的主要粮食来源。木薯起源于南美，于16-18世纪传入非洲、亚洲及大洋洲。现在木薯已广泛地分布于全球的热带及部分亚热带地区。木薯于1820年前由东南亚华侨引入我国，至今已有180多年的栽培历史。目前我国木薯产区包括海南、广东、广西、福建、云南等省区，四川、贵州、湖南、江西等地也有种植，现有栽培面积50余万公顷，鲜薯产量1000万吨。木薯主要的优点是具有很高的产量潜力。它是一种C3-C4中间型作物，在适宜的条件下具有很高的光合作用效率，而在干旱和高温的胁迫下，也能保持较高的光合效率。

木薯花叶病是木薯最重要病毒之一，往往会导致木薯产量损失50％以上，严重的可超过 80％，严重威胁木薯产业的发展。对以木薯为主要食物的热带地区低收入农户来说，不仅极大的影响了木薯种植的经济效益，更会严重威胁种植户的食物来源，造成极其严重的后果。木薯花叶病由许多不同种的双生病毒科(Geminiviridae)引起，目前已经鉴定的病毒有7种，包括非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus,ACMV)、东非木薯花叶病毒(East African cassava mosaic Cameroon virus)、东非木薯花叶喀麦隆病毒(EastAfrican cassava mosaic Cameroon virus)、东非木薯花叶肯尼亚病毒(EastAfrican cassava mosaic Kenya virus)、东非木薯花叶马拉维病毒(East Africancassava mosaic Malawi virus)、东非木薯花叶桑给巴尔病毒(East African cassavamosaic Zanzibar virus)和南非木薯花叶病(South African cassava mosaic virus)。

木薯花叶病毒可通过嫁接、汁液接种、种茎及昆虫介体传播，开始是在叶片上显现出褪绿的斑点，然后逐步扩大并和周围的正常绿色组织混成一片，最后形成典型的花叶，严重时可导致木薯整株死亡，造成极大的经济损失。由于长期采用无性繁殖，木薯产量下降、品质下降、种性退化，母株一旦感染木薯花叶病毒，病毒在木薯体内传染，并逐代累积。通过现有的方法生产出的组培苗仍然携带病毒，移栽后极易引起木薯花叶病大面积发生，造成难以估量的损失，也严重影响了木薯的推广。

目前，脱毒苗的生产一般选用植物的茎尖生长点作为外植体，通过加大培养代数获得脱毒苗。如中国发明专利CN103202232A，根据病毒在植株顶端生长点的数量远远少于植株下部成熟部位的原理，加大取生长点代数，达到脱毒的目的。但是上述获得脱毒苗的方法，需进行多代取生长点进行组织培养，培养周期长，脱毒苗繁殖效率低，影响了脱毒苗的大规模推广，也极大的阻碍着优质木薯种质资源的引进和交流。尤其是涉及到从木薯花叶病毒大规模爆发的疫区引进木薯种质资源的过程中，快速地培育脱毒种苗成了引种的关键因素之一。此外，茎尖的生长点不仅长度小，而且十分幼嫩，在剥离的过程中，难以快速寻找到准确的位点，而且剥离和转移过程中极易破碎和损伤，操作十分困难，不仅浪费材料，而且难以进行大规模生产。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中不足，提供一种高效的木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法，利用木薯腋芽为外植体诱导体细胞胚胎离体培养获得脱毒苗，该方法脱毒效率和繁殖系数高，外植体材料多，操作简易，速度快，数量多，苗生根率高，更健壮。

本发明的第一个方面是提供一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法，包括以下步骤：

步骤1，预培养：取感染ACMV的木薯的嫩茎经常规表面消毒后切取带腋芽茎段或未脱毒完全-感染病毒试管苗的带腋芽茎段，接种到腋芽膨大诱导培养基上进行暗培养3-7天直至腋芽膨大；

步骤2，体细胞胚胎诱导培养：剥离经培养后膨大的腋芽，接种于体细胞胚胎诱导培养基上进行暗培养25-35天；

步骤3，体细胞胚胎成熟培养：将体细胞胚胎组织块接种到体细胞胚成熟培养基上进行光照培养25-35天；

步骤4，植株再生培养：将成熟体细胞胚胎组织块接种到植株再生培养基上进行光照培养 28-40天。

其中，所述腋芽膨大诱导培养基为添加5-20mg/L6-BA的MS培养基，6-BA的的添加量可以为例如5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、15mg/L、16mg/L、17mg/L、18mg/L、19mg/L或20mg/L等。优选地，所述腋芽膨大诱导培养基中6-BA的浓度为10-20mg/L。

其中，所述体细胞胚胎诱导培养基在MS培养基中添加有0.2-0.8mg/LCuSO₄和5-15mg/L 氨氯吡啶酸。CuSO₄的添加量可以为例如0.2mg/L、0.25mg/L、0.3mg/L、0.35mg/L、0.4 mg/L、0.45mg/L、0.5mg/L、0.55mg/L、0.6mg/L、0.65mg/L、0.7mg/L、0.75mg/L、或0.8mg/L等。氨氯吡啶酸的添加量可以为例如5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、 10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、或15mg/L等。优选地，所述体细胞胚胎诱导培养基中氨氯吡啶酸的浓度为10-15mg/L。

其中，所述体细胞胚成熟培养基为在MS培养基中添加有0.2-0.8mg/LCuSO₄、 0-0.1mg/L6-BA和15-25g/L蔗糖。CuSO₄的添加量可以为例如0.2mg/L、0.25mg/L、0.3 mg/L、0.35mg/L、0.4mg/L、0.45mg/L、0.5mg/L、0.55mg/L、0.6mg/L、0.65mg/L、0.7 mg/L、0.75mg/L、或0.8mg/L等。蔗糖的添加量可以为例如15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、 19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、或25g/L等。6-BA的添加量可以为例如 0、0.01mg/L、0.02mg/L、0.03mg/L、0.04mg/L、0.05mg/L、0.06mg/L、0.07mg/L、0.08 mg/L、0.09mg/L或0.1mg/L等。优选地，所述体细胞胚成熟培养基中6-BA的浓度为0.01-0.05 mg/L。

其中，所述植株再生培养基为在MS培养基中添加有0.005-0.02mg/L6-BA、 0.01-0.03mg/LGA3、0.01-0.03mg/LNAA和15-20g/L蔗糖。蔗糖的添加量可以为例如15g/L、 16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、或25g/L等。 6-BA的添加量可以为例如0.005mg/L、0.007mg/L、0.008mg/L、0.01mg/L、0.012mg/L、 0.014mg/L、0.015mg/L、0.016mg/L、0.018mg/L或0.02mg/L等。GA3的添加量可以为例如0.01mg/L、0.012mg/L、0.014mg/L、0.015mg/L、0.016mg/L、0.018mg/L、0.02mg/L、 0.022mg/L、0.024mg/L、0.025mg/L、0.026mg/L、0.028mg/L、或0.03mg/L等。NAA 的添加量可以为例如0.01mg/L、0.012mg/L、0.014mg/L、0.015mg/L、0.016mg/L、0.018 mg/L、0.02mg/L、0.022mg/L、0.024mg/L、0.025mg/L、0.026mg/L、0.028mg/L、或0.03 mg/L等。

优选地，所述植株再生培养基中添加有6-BA浓度为0.01mg/L，GA3浓度为0.02mg/L， NAA浓度为0.02mg/L。

本发明的第二个方面是提供一种用于培养木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养基组，包括腋芽膨大诱导培养基、体细胞胚胎诱导培养基、体细胞胚成熟培养基和植株再生培养基。

其中，所述腋芽膨大诱导培养基为添加5-20mg/L6-BA的MS培养基，6-BA的的添加量可以为例如5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、 14mg/L、15mg/L、16mg/L、17mg/L、18mg/L、19mg/L或20mg/L等。优选地，所述腋芽膨大诱导培养基中6-BA的浓度为10-20mg/L。

其中，所述体细胞胚胎诱导培养基为在MS培养基中添加有0.2-0.8mg/LCuSO₄和5-15mg/L氨氯吡啶酸。CuSO₄的添加量可以为例如0.2mg/L、0.25mg/L、0.3mg/L、0.35 mg/L、0.4mg/L、0.45mg/L、0.5mg/L、0.55mg/L、0.6mg/L、0.65mg/L、0.7mg/L、0.75 mg/L、或0.8mg/L等。氨氯吡啶酸的添加量可以为例如5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、 9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、或15mg/L等。优选地，所述体细胞胚胎诱导培养基中氨氯吡啶酸的浓度为10-15mg/L。

其中，所述植株再生培养基为在MS培养基中添加有0.005-0.02mg/L6-BA、 0.01-0.03mg/LGA3、0.01-0.03mg/LNAA和15-20g/L蔗糖。蔗糖的添加量可以为例如15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、或25g/L等。 6-BA的添加量可以为例如0.005mg/L、0.007mg/L、0.008mg/L、0.01mg/L、0.012mg/L、 0.014mg/L、0.015mg/L、0.016mg/L、0.018mg/L或0.02mg/L等。GA3的添加量可以为例如0.01mg/L、0.012mg/L、0.014mg/L、0.015mg/L、0.016mg/L、0.018mg/L、0.02mg/L、 0.022mg/L、0.024mg/L、0.025mg/L、0.026mg/L、0.028mg/L、或0.03mg/L等。NAA 的添加量可以为例如0.01mg/L、0.012mg/L、0.014mg/L、0.015mg/L、0.016mg/L、0.018 mg/L、0.02mg/L、0.022mg/L、0.024mg/L、0.025mg/L、0.026mg/L、0.028mg/L、或0.03 mg/L等。

本发明对含有腋芽茎段进行预处理，使腋芽膨大后剥离，进行体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎成熟培养和成熟体胚植株再生培养，获得脱毒苗，本发明脱毒效率和繁殖系数高，外植体材料来源广泛，剥离操作简易，剥离速度快，再生植株数量多，苗生根率高，长势健壮，有利于脱毒苗的规模化生产。

附图说明

图1为SC8侵染ACMV盆栽苗和SC5和SC8感病和健康叶片。

图2为木薯腋芽体细胞胚胎离体脱毒培养各阶段结果照片：A.腋芽膨大培养；B.膨大腋芽体细胞胚胎诱导培养；C.体细胞胚胎成熟培养；D.再生植株培养；

图3为部分再生植株的RT-PCR检测电泳图：M.DL2000marker；1～13.再生植株；14.阴性对照；15.阳性对照；

图4为部分再生植株的RT-PCR检测结果Actin电泳图：M.DL2000marker；1～13.再生植株；14.阴性对照；15.阳性对照。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施方式对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

一、ACMV木薯感病材料的制备

1、材料

非洲木薯花叶病毒(ACMV)DNA-A、DNA-B侵染性克隆由中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所薯类生物技术研究实验室保存。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：LBA4404

2、注射法和嫁接法ACMV侵染木薯

农杆菌注射法：将木薯组培苗移到温室中，种植于防虫网中，温度为25±2℃，相对湿度60％，16h/8h光照/黑暗周期。含有ACMV-NOg DNA-A and DNA-B的农杆菌LBA4404，在YEB固体培养基(Rif 25mg/L，Strep 100mg/L，Kan 50mg/L)上划线，28℃培养48 小时。之后混合A和B的菌，用含针头的无菌注射器反复刺5-6片叶期木薯植株的顶端分生组织。

嫁接法：采用切接法，砧木为未感染的扦插盆栽苗；接穗为感染ACMV的嫩茎，切成带有3～4腋芽、长约8cm的接穗。在接穗腋芽3厘米处的下端两侧削成2～3厘米长的楔形斜面。当砧木比接穗粗时，接穗下端削成偏楔形，使有顶芽的一侧较厚，另一侧稍薄，有利于接口密接。砧木与接穗粗细一致时，接穗可削成正楔形，这样不但利于砧木含夹，而且两者接触面大，有利于愈合。接穗面要平整光滑，这样削面容易和砧木劈口紧靠，使砧木和接穗之间的形成层及维管束紧密结合，两面形成层容易愈合。

3、实验结果

当用农杆菌注射法或嫁接法成功将ACMV侵染SC5和SC8木薯后，可以看到侵染的表型：叶片褪绿发黄且比对照组变小、叶片扭曲(图1B、C)，随后在新长出的叶上都出现病毒表型，呈系统侵染症状(图1A)。

二、腋芽体细胞胚胎离体脱毒培养

1、材料

中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所薯类生物技术研究室人工气候室感染 ACMV(非洲木薯花叶病毒)的SC8盆栽植株的带腋芽茎段，SC8盆栽植株的制备方法如“一、 ACMV木薯感病材料的制备”所示。

2、不同6-BA浓度预培养诱导腋芽膨大的筛选

选取感染ACMV的SC8盆栽植株的嫩茎，经过常规消毒处理，在超净工作台上切取带腋芽茎段，接种到含6-BA浓度为5、10、15、20mg/L不同浓度的MS基本培养基上进行腋芽膨大诱导，暗培养，每个处理接种10个外植体，重复3次，3d、5d和7d后观察腋芽膨大和生长情况。

带腋芽茎段接种3d后，6-BA浓度为10、20mg/L可见腋芽开始萌动。5d后6-BA浓度为10、20mg/L处理的腋芽开始出现膨大，20mg/L处理膨大尤为明显，具备腋芽剥离操作(图2，A)；而6-BA浓度为5mg/L处理的腋芽部分可见开始萌动。7d后6-BA浓度为10、 20mg/L处理的腋芽均见明显膨大，节间基部冒出直径1-1.5mm的凸起(如小米粒大小)，萌动十分明显；6-BA浓度为5mg/L处理的腋芽膨大不明显，而部分腋芽长出了叶子(不适合剥离)。结合节约时间角度考虑，6-BA浓度为20mg/L在预培养5天，腋芽萌动、膨大时即可进行腋芽剥离，是诱导腋芽膨大最佳浓度。

3、不同Picloram浓度诱导腋芽愈伤组织和体细胞胚胎的筛选

在解剖镜下剥离经预培养后萌动、膨大的腋芽，接种于以MS+CuSO₄ 0.5mg/L为基础培养基，分别添加5、10、12、15mg/L Picloram(氨氯吡啶酸)的体细胞胚胎诱导培养基上进行体细胞胚胎诱导培养，每个处理接种20个外植体，重复3次，30d后统计愈伤组织诱导率和体细胞胚胎诱导率。

愈伤组织诱导率(％)＝(诱导出的愈伤组织数/接种外植体数)×100％。

体细胞胚胎诱导率(％)＝(诱导出的体细胞胚胎数/接种外植体数)×100％。

不同浓度Picloram对膨大腋芽的愈伤组织诱导率差异不显著，体细胞胚胎诱导率差异达显著(表1)。当Picloram浓度为10、15mg/L时，体细胞胚胎诱导率均为83.3％，没有差异。实验观察到，当Picloram为15mg/L时，愈伤组织生长过于旺盛，有的体细胞胚胎被愈伤组织包裹，对体细胞胚胎后期生长不利；而当Picloram浓度较低时，愈伤组织和体细胞胚胎萌动和生长缓慢。因此，最优的膨大腋芽体细胞胚胎诱导的Picloram为10mg/L。

比较不同外植体微茎尖和膨大腋芽体细胞胚胎诱导的Picloram浓度发现，两者的最适浓度它们是一致的。对两种外植体的愈伤组织和体细胞胚胎诱导率进行比较，不难看出，膨大腋芽的体细胞胚胎诱导率明显高于微茎尖外植体(图2，B)。

表1不同浓度Picloram对腋芽愈伤组织和体细胞胚胎诱导的影响

说明：邓肯氏新复极差法显著性测验，同一列不同小写字母表示均数间差异显著(P< 0.05)。

4、不同6-BA浓度对体细胞胚胎成熟培养的筛选

将获得的体细胞胚胎组织块接种到体细胞胚成熟培养基上：以MS+CuSO₄ 0.5mg/L+蔗糖20g/L为基础培养基，分别加入0、0.01、0.05、0.1mg/L6-BA上进行培养，光照培养，每个处理接种10个体胚块，重复3次；培养30d后，统计体细胞胚胎产量和观测生长状况。

体细胞胚产量(个)＝体细胞胚总数/产生体细胞胚胎的外植体数。

体细胞胚胎组织块在体细胞胚成熟培养基30d后，将每个组织块的成熟子叶胚统计分析后，可见，不同6-BA浓度对平均体细胞胚胎产量差异不显著(表2)。当6-BA浓度为0.01mg/L 和0.05mg/L时，体细胞胚胎平均产量均达最高，但体细胞胚胎组织块基部的愈伤组织生长较旺盛，不利于体细胞胚胎的营养吸收；并且接触培养基部分的子叶异常膨大，给后续的转接操作带来麻烦。结合生长情况和经济角度考虑，BA浓度为0.01mg/L是本研究体细胞胚胎成熟培养的适宜浓度(图2，C)。

表2不同6-BA浓度对体细胞胚胎成熟培养的影响

说明：邓肯氏新复极差法显著性测验，同一列不同小写字母表示均数间差异显著(P<0. 05)

5、植株再生

将成熟体细胞胚接种到植株再生培养基：MS+BA 0.01mg/L+GA₃0.02mg/L+NAA0.02 mg/L+20g/L蔗糖上进行光照培养，35d后统计体细胞胚的植株再生率：

平均植株再生系数＝再生植株数/体细胞胚胎组织块总数。

成熟的体细胞胚胎在再生植株培养上培养35d后获得再生植株(图2，D)，每个体细胞组织块的平均植株再生系数均达3以上，再生植株生根率达95.0％以上，长势良好。

6、RT-PCR法的病毒检测

健康SC8植株叶片为阴性对照材料，感染ACMVSC8植株叶片为阳性对照材料，体细胞再生植株试管苗为检测材料。

取SC8健康和带病植株(对照)盆栽苗和试管苗幼嫩叶片各0.1g，液氮研磨，分别提取总RNA，反转录成cDNA，采用20μL PCR反应体系进行扩增，1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。根据两种主要ACMV病毒的序列设计引物，进行RT-PCR检测，计算病毒脱除率。具体如下：

病毒脱除率(％)＝脱除病毒植株数/总植株数×100

(1)PCR引物设计

根据GenBank登录的ACMV CP基因编码序列进行比对,在其保守区设计引物，其中上游引物命名为AC1F，下游引物命名为AC1R，扩增片段约240bp；根据肌动蛋白(β-actin)基因设计1 对半定量RT-PCR内参照基因扩增引物,其中上游引物命名为ActinF,下游引物命名为 ActinR，扩增产物约为220bp。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物序列如下：

AC1F:5c-GGATTTTCCAGGAGCCACCA-3c；

AC1R:5c-GGCCCATATCGTCTTCCCTG-3c；

ActinF:5c-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3c；

ActinR:5c-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3c

(2)木薯总RNA提取

对试验材料木薯健康植株、携带ACMV病株和脱毒试管苗进行总RNA提取。总RNA提取参考植物总RNA提取试剂(货号DP437,Tiangen，Beijing，China)说明书。

主要步骤为：组织在液氮中迅速研磨后加入裂解液充分震荡，4℃12,000rpm离心10min，上清液转移新的无RNase离心管。加入0.1mL 5M NaCl，温和混匀。加入0.3mL氯仿，上下颠倒混匀。过滤掉沉淀后利用吸附原理收集总RNA，4℃12,000rpm离心10min，取上层水相转移新的无RNase离心管。加与水相等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。4℃12,000rpm离心10min。弃掉上清，加1mL 75％乙醇。4℃12,000rpm离心5min。倒出液体，室温晾干 2-3min。加30-50μL无RNase水，反复吹打混匀，充分溶解RNA。加入DNase I 37℃30min消除基因组DNA污染，然后65℃10min除去DNase I，-70℃备用。取2uL总RNA测定其在260、 280nm处的光密度,计算D 260/D280的值,估计总RNA的纯度，通过D 260的值对木薯总 RNA进行定量。取5uL总RNA在1.0％普通琼脂糖凝胶上分离总RNA,检测总RNA的完整性。

(3)cDNA第1链的合成

用RNAprep Pure Plant kit(Tiangen，Beijing，China)从木薯叶片中分离出总mRNA。利用反转录酶合成cDNA，即2μg总RNA在反转录酶ReverTra Ace(Code：TRT-101，TOYOBO，上海)作用下于20μL反应体系中合成cDNA。20μL标准反转录体系具体如下：总RNA取2μg, 5pmoles Oligo(dT)取2.5μL,5×Buffer 4μL,10mM dNTPs2μL,ReverTraAce(100U/μL)，RNase Inhibitor 20U，加DEPC水(或无RNase的双蒸水)补足20μL。

(4)ACMV特异引物和β-actin基因的PCR扩增

以上述合成的cDNA为模板,总反应体积为20μL,其中包含cDNA模板1.0μL，2×TaqPCR master Mix10.0μL，上下游引物(或β-actin基因)各1.0μL，加超纯水补足至20.0μL。

PCR反应程序为:95℃预变性5min；循环条件为95℃变性40s,58℃退火50s,72℃延伸 60s，30个循环数；72℃延伸10m in；16℃保温。

主要试剂：植物总RNA提取试剂盒(Tiangen，Beijing)；

PCR产物回收试剂盒(Tiangen，Beijing)；

Real-time PCR检测试剂盒(Toyobo，Shanghai)；

主要仪器：ND-1000 V3.7.0紫外分光光度计

Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪

利用RT-PCR法可以稳定地从阳性对照(携带ACMV病株)中检测到ACMV的目标带(图4，泳道15)，阴性对照(健康植株)没有检测到ACMV目标带(图4，泳道14)。图1 所检测的13份再生植株材料中，有1份扩增到条带，但条带明显浅于ACMV所扩增的特异性条带，即带毒较轻(图4，泳道2)；其他12份脱毒苗均没有扩增出目标带(图4，泳道1、3-13)。目前为止，所检测的225份再生植株材料中，其中来自微茎尖体细胞胚胎再生植株100株，5 株再生植株的检测出目的条带，病毒脱除率95.0％；腋芽体细胞胚胎再生植株125株，3株再生植株的检测出目的条带，病毒脱除率97.6％(图3，4)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，预培养：取感染ACMV的木薯的嫩茎经常规表面消毒后切取带腋芽茎段或未脱毒完全-感染病毒试管苗的带腋芽茎段，接种到腋芽膨大诱导培养基上进行暗培养3-7天直至腋芽膨大，所述腋芽膨大诱导培养基为添加5-20mg/L6-BA的MS培养基；

步骤2，体细胞胚胎诱导培养：剥离经培养后膨大的腋芽，接种于体细胞胚胎诱导培养基上进行暗培养25-35天，所述体细胞胚胎诱导培养基为在MS培养基中添加有0.2-0.8mg/LCuSO₄和5-15mg/L氨氯吡啶酸；

步骤3，体细胞胚胎成熟培养：将体细胞胚胎组织块接种到体细胞胚成熟培养基上进行光照培养25-35天，所述体细胞胚成熟培养基为在MS培养基中添加有0.2-0.8mg/LCuSO₄、0-0.1mg/L6-BA和15-25g/L蔗糖；

步骤4，植株再生培养：将成熟体细胞胚胎组织块接种到植株再生培养基上进行光照培养28-40天，所述植株再生培养基为在MS基础培养基中添加有0.005-0.02mg/L6-BA、0.01-0.03mg/LGA3、0.01-0.03mg/LNAA和15-20g/L蔗糖。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述腋芽膨大诱导培养基中6-BA的浓度为10-20mg/L。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述体细胞胚胎诱导培养基中氨氯吡啶酸的浓度为10-15mg/L。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述体细胞胚成熟培养基中6-BA的浓度为0.01-0.05mg/L。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述植株再生培养基中添加有6-BA浓度为0.01mg/L，GA3浓度为0.02mg/L，NAA浓度为0.02mg/L。

6.一种用于培养木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养基组，其特征在于，包括腋芽膨大诱导培养基、体细胞胚胎诱导培养基、体细胞胚成熟培养基和植株再生培养基，其中，

所述腋芽膨大诱导培养基为添加5-20mg/L6-BA的MS培养基；

所述体细胞胚胎诱导培养基在MS培养基中添加有0.2-0.8mg/LCuSO₄和5-15mg/L氨氯吡啶酸；

所述体细胞胚成熟培养基为以MS培养基为在MS培养基中添加有0.2-0.8mg/LCuSO₄、0.01-0.05mg/L6-BA和15-25g/L蔗糖；

所述植株再生培养基为在MS培养基中添加有0.005-0.02mg/L6-BA、0.01-0.03mg/LGA3、0.01-0.03mg/LNAA和15-20g/L蔗糖。

7.根据权利要求6所述的培养基组，其特征在于，所述腋芽膨大诱导培养基中6-BA的浓度为10-20mg/L。

8.根据权利要求6所述的培养基组，其特征在于，所述体细胞胚胎诱导培养基中氨氯吡啶酸的浓度为10-15mg/L。

9.根据权利要求6所述的培养基组，其特征在于，所述体细胞胚成熟培养基中6-BA的浓度为0.01-0.05mg/L。

10.根据权利要求6所述的培养基组，其特征在于，所述植株再生培养基中添加有6-BA浓度为0.01mg/L，GA3浓度为0.02mg/L，NAA浓度为0.02mg/L。