CN110358790A - 一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法 - Google Patents

一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110358790A
CN110358790A CN201910631965.3A CN201910631965A CN110358790A CN 110358790 A CN110358790 A CN 110358790A CN 201910631965 A CN201910631965 A CN 201910631965A CN 110358790 A CN110358790 A CN 110358790A
Authority
CN
China
Prior art keywords
shoot
apexstems
virus
plant
genetic transformation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910631965.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110358790B (zh
Inventor
刘起丽
李成伟
徐克东
胡海燕
李东宵
宋普文
孙海丽
卜瑞方
于永昂
魏琦超
易伦
王伟鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Institute of Science and Technology
Original Assignee
Henan Institute of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Institute of Science and Technology filed Critical Henan Institute of Science and Technology
Priority to CN201910631965.3A priority Critical patent/CN110358790B/zh
Publication of CN110358790A publication Critical patent/CN110358790A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110358790B publication Critical patent/CN110358790B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，包括：制备无顶芽茎段，无顶芽茎段的预培养，制备农杆菌菌液并注射于无顶芽茎段，无顶芽茎段的暗培养，无顶芽茎段腋芽的剥离，腋芽的种植；无顶芽茎段具有不对称“Y”型结构，相对叶背浸润法与茎基注射法，容纳相同浓度的农杆菌菌液的空间更大，而采用注射方式能对接种液的体积进行精确定量。此外，本发明利用了病毒更易侵染植物幼嫩芽叶的特性，特别适合于病毒介导的遗传转化或病毒的接种，且明显促进了病毒介导的基因沉默效果、加快了DNA病毒的侵染速度和效率，适用于扦插易成活、有腋芽的植物，具有较好的应用价值。

Description

一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法
技术领域
本发明涉及农业技术领域，更具体的说是涉及一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法。
背景技术
植物的遗传转化是研究基因功能以及获得转基因植物的途径，常用的方法有基因枪法、蘸花法、农杆菌介导法等。
DNA病毒引起的病毒病是近年来危害作物生产的重要病害，尤其是番茄黄化曲叶病毒：tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)严重危害我国番茄的生产。鉴定和选育抗病品种是防治病毒病的有效途径。利用含有病毒侵染性克隆的农杆菌培养液，通过叶背浸润法和茎基部注射法是接种DNA病毒的两种常用方法。
但是，现有植物的遗传转化的方法，或应用成本高、转化步骤繁琐，或转化植物的成活率不高、转化效率低下。现有接种DNA病毒方法，存在以下不足：叶背浸润法接种只能每片叶片依次接种，浸润时速度缓慢、力度不易把控、渗入叶片的农杆菌的菌液量有限且无法准确定量；茎基部注射法容易破坏幼苗茎部组织、农杆菌不易注入、注射量不易控制等，仅可以满足少量幼苗接种需要，而当鉴定植物抗性需要大量接种时，则耗时、低效。
因此，提供一种植株快速遗传转化或感染DNA病毒的方法以提高效率、节省时间为本领域技术人员目前亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种植株快速遗传转化或感染DNA病毒的方法，解决了传统遗传转化方法应用成本高、转化步骤繁琐、转化效率低下，以及DNA病毒接种速度慢、定量困难的问题。特别适用于扦插易成活且具有腋芽的植物。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，包括如下步骤：
(1)制备无顶芽茎段：将植株顶芽切掉，将茎切成若干个带有一个侧枝或一片复叶的茎段，筛选出其中含腋芽的茎段；
(2)无顶芽茎段的预培养：将人工剪取的无顶芽茎段种在培养基质中培养；
(3)制备农杆菌菌液并注射于无顶芽茎段：制备含有病毒介导的基因沉默载体的农杆菌菌液和/或含有DNA病毒侵染性克隆的农杆菌菌液，并将其注射于无顶芽茎段；
(4)无顶芽茎段的暗培养：置于黑暗条件下培养；
(5)无顶芽茎段腋芽的剥离，腋芽的种植；将暗培养结束的茎段继续培养，将表现症状的腋芽从茎段上取下，种于培养基质中培养。
优选的：步骤(1)制备无顶芽茎段具体为：取35-40cm高的植株，将顶芽切掉，将茎切成若干个带有一个侧枝或一片复叶的茎段，每个茎段长4-6cm，茎的形态学上端切口为平切口，形态学下端切口为30°，筛选出其中含腋芽的茎段，腋芽长度为1-3cm；茎段的形态学上切口距离侧枝或复叶基部为2.5-3.5cm，形态学下切口距离侧枝或复叶基部为1.5-2.5cm。
优选的：侧枝长度大于10cm，则切断侧枝顶部，保留侧枝3-5片叶。
优选的：无顶芽茎段具有不对称“Y”型结构。
无顶芽茎段具有不对称“Y”型结构，相对叶背浸润法与茎基注射法，容纳相同浓度的农杆菌菌液的空间更大，而采用注射方式能对接种液的体积进行精确定量。
优选的：步骤(2)无顶芽茎段的预培养具体为：需将人工剪取的无顶芽茎段种在培养基质中，置于23-26℃、光照强度1200-1800Lux、光照时间16h/d的环境培养1d；所述培养基为松针土和蛭石以1:0.5-0.7的比例混合。
优选的：步骤(3)制备农杆菌菌液并注射于无顶芽茎段具体为：制备含有病毒介导的基因沉默载体的农杆菌菌液和/或含有DNA病毒侵染性克隆的农杆菌菌液，并将其注射于无顶芽茎段，注射部位在所述无顶芽茎段的形态学上端切口，注射0.5-1ml菌液持续1-2min，拔出针头，使菌液在上切口处自然形成一层液膜。
向形态学上端切口注射菌液时会有阻力，不容易注射，需要慢慢压入，同时持续1-2min，上端平切口能使液膜保持水平不易滑落，利于促进浸润进去更多的农杆菌，利于后期出现症状。形态学下端切口30°(参见附图1)能形成契形结构并与土壤有更大的接触面，易于吸水和吸取营养，相对于平切口和其它角度的切口效果好。利于无茎芽茎段快速生长。
优选的：步骤(4)无顶芽茎段的暗培养具体为：保持所述液膜不滑落，置于23-26℃、相对湿度80-90％、黑暗的条件下培养24h-48h。
因光照对农杆菌的侵入有影响，所以适宜的暗培养时间至关重要，24-48h更利于农杆菌侵入植物细胞。
优选的：步骤(5)无顶芽茎段腋芽的剥离，腋芽的种植具体为：将暗培养结束的茎段置于保湿、温度23-26℃、光照强度1200-1800Lux、光照时间16h/d的防虫温室中培养5-10d后，将表现症状的腋芽从茎段上取下，种于培养基质中，置于保湿，温度23-26℃、光照强度1200-1800lux、光照16h/d的防虫温室中培养，所述培养基质为松针土和蛭石以1:0.5-0.7的比例混合。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明益处为：利用人工塑形后的无顶芽茎段，在遗传转化或病毒接种过程中具有简便、高效、接种液易定量的优势，对无顶芽茎段注射遗传转化液或接种病毒后，腋芽能够快速表现症状，剥离腋芽种植后即可获得转化植株或发病的整株植株，特别适合于有腋芽且可扦插成活的植物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为番茄茎段注射示范；
图2为病毒介导的番茄PDS基因沉默效果(接种后15d番茄的白化症状)；
图3为接种TYLCV病毒10d后番茄的黄化曲叶症状效果。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Moneymaker番茄、中蔬四号番茄和威尼斯F199番茄均为本领域公知品种，种子可商业化采购，农杆菌GV3101是商品化菌种，pTRV1、pTRV2载体为市售载体。pTRV2-SlPDS构建的具体步骤，参见文献：
Liu,Y.,Schi,M.,Dinesh-Kumar,S.P.,Virus-induced gene silencing intomato.Plant Journal,2002,31:777-786.doi:10.1046/j.1365-313X.2002.01394.x。
本发明所使用的包含pTRV1载体和pTRV2-SlPDS载体的农杆菌直接来自上文第一作者的馈赠，也可按其公开的构建方法采购菌种、载体合成。
本发明所使用的TYLCV侵染性克隆来自下述文献中通讯作者的馈赠：Zhang,H.,Gong,H.,Zhou,X.Molecular characterization and pathogenicity of tomato yellowleaf curl virus in China.Virus Genes,2002,39:249-255.doi:10.1007/s11262-009-0384-8。也可按其公开的构建方法采购菌种、构建侵染性克隆。
实施例1
Moneymaker番茄无顶芽茎段转化和接种例
供试材料为Moneymaker番茄品种
(1)番茄制备无顶芽茎段：选取自生长至35-40cm的Moneymaker番茄植株，切掉顶芽部位，然后将番茄茎切成若干个带有一片复叶或一个侧枝的4-6cm的茎段；茎的形态学上端切口为平切口，形态学下端切口为30°(参见附图1)筛选出其中含腋芽的茎段，腋芽长度为1-3cm；如侧枝较长，大于10cm，切断侧枝顶部，只保留侧枝3-5片叶；茎段的形态学上端切口距离侧枝或复叶基部为2.5-3.5cm，形态学下切口距离侧枝或复叶基部1.5-2.5cm，保证每个茎段有一腋芽，无顶芽茎段外观呈形态不对称的“Y”型结构；
(2)番茄无顶芽茎段的预培养：将剪取的番茄无顶芽茎段种在松针土和蛭石以1:0.5的比例混合的培养基质中，置于23℃、光照强度1200lux、光照时间16h/d的防虫温室中培养1d；
(3)制备农杆菌菌液
制备含有病毒介导的基因沉默载体的农杆菌菌液，步骤为：分别挑取含有pTRV1载体的农杆菌GV3101、含有pTRV2-SlPDS载体(针对番茄PDS基因构建的)的农杆菌的单菌落，分别接种到5ml含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin)和100mg/L利福平(Rifampicin)的YEB液体培养基中，在温度28℃，震荡转速170rpm条件下分别培养48h，然后各取1ml转接于100ml含有50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的YEB液体培养基中，在温度28℃、转速160-180rpm的条件下分别培养至菌液OD600＝0.8时在4℃4000rpm离心10min，弃上清，将沉淀悬浮于100ml成分为10mM的吗啉乙磺酸，10mM的氯化镁，150μM的乙酰丁香酮的悬浮缓冲液中，混匀后静置3h以上，以1:1的体积比混合两种农杆菌菌液作为备用农杆菌菌液①；制备含有TYLCV病毒侵染性克隆的农杆菌菌液：挑选农杆菌EHA105(含有TYLCV侵染性克隆载体)的单菌落，接种到5ml含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin)和100mg/L利福平(Rifampicin)的YEB液体培养基中，在温度28℃，震荡转速170rpm条件下培养48h，然后取1ml转接于100ml含有50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的YEB液体培养基中，在温度28℃、转速160-180rpm的条件下培养至菌液OD600＝1.0时在4℃4000rpm离心10min，弃上清，将沉淀悬浮于100ml成分为10mM的吗啉乙磺酸，10mM的氯化镁，150μM的乙酰丁香酮的悬浮缓冲液中混匀后静置3h以上，作为备用农杆菌菌液②；
(4)将制备的农杆菌菌液注射于番茄无顶芽茎段：用5ml注射器分别吸取制备好的农杆菌菌液①和②，用针头插入番茄无顶芽茎段的形态学上端切口，注射0.5-1ml菌液并保持1-2min，缓慢拔出针头，使菌液在上切口处自然形成一层液膜(参见附图1)；
(5)无顶芽茎段的暗培养：注射完毕后将茎段小心放置于23℃人工气候箱中，在80％相对湿度，黑暗的条件下培养24h；
(6)症状观察：将暗培养结束的茎段置于保湿，温度23℃，光照强度1200lux，光照时间16h/d的防虫温室中培养5d观察症状，注射农杆菌菌液①的番茄茎段，腋芽长大并出现明显的白化症状(参见附图2)，注射农杆菌菌液②的番茄茎段，腋芽长大并出现黄化、曲叶的典型病毒病症状(参见附图3)；
(7)无顶芽茎段的腋芽的剥离，腋芽的种植：将表现明显症状的腋芽从茎段上取下，种于松针土和蛭石以1:0.5的比例混合的培养基质中，置于保湿，温度23℃，光照强度1200Lux，光照时间16h/d的防虫温室中培养获得整株遗传转化的番茄植株A和全株感病毒的番茄植株B。
(8)植株鉴定：提取上述遗传转化的番茄植株A的RNA，用一步法实时荧光定量RT-PCR检测番茄PDS基因的表达情况，检测引物为引物1：5’～CGGGGTACCGGCACTCAACTTTATAAACC～3’(SEQ ID No.1)，引物2：5’～CGGGGATCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC～3’(SEQ ID No.2)；番茄的内参基因引物为引物3：5’～TGTGTTGGACTCTGGTGATGGTGT～3’(SEQ ID No.3)；引物4：5’～ATCCAAACGAAGAATGGCATGCGG～3’(SEQ ID No.4)。将上述感染TYLCV病毒的番茄植株B提取DNA，用实时荧光定量PCR检测TYLCV的病毒积累情况，检测引物为引物5：5’～GAGTTCCCCTGTGCGTGA～3’(SEQ ID No.5)；引物6：5’～CTGTTCGCAAGTATCAATCAAGGT～3’(SEQ ID No.6)；以上实时荧光定量RT-PCR的内参基因引物为引物7：5’～ATAACCGCATCAGGTCTCCA～3’(SEQ ID No.7)；引物8：5’～CCGAAGTTACGGATCCATTT～3’(SEQ ID No.8)。检测番茄植株A和B的实时荧光定量RT-PCR检测扩增体系均为：cDNA/DNA 2.0ul、SYBR Premix Ex TaqTM II 12.5ul、Primer-FR(10uM)1.0ul、Primer-RR(10uM)1.0ul、RNase Free H2O 8.5ul，扩增程序为95℃30s变性，95℃5s，60℃20s，后两步共40个循环。
对番茄植株A和B的叶片进行DAB染色，检测叶片受病毒侵染后细胞的活性氧积累情况，以反映病毒侵染程度，结合上述实时荧光定量PCR检测结果，最终确定遗传转化成功的转化植株、获得整株发病的番茄植株。DAB染色方法参见文献：Hückelhoven,R.,Fodor,J.,Preis,C.,Kogel,K.H.Hypersensitive cell death and papilla formation inbarley attacked by the powdery mildew fungus are associated with hydrogenperoxide but not with salicylic acid accumulation.Plant Physiology,1999,119:1251-1260.Doi:10.1104/pp.119.4.1251。
实施例2
与实施例1的区别仅在于部分参数调整，其余同实施例1，具体为：步骤(2)番茄无顶芽茎段的预培养：松针土和蛭石以1:0.6的比例混合的培养基质中，温度为24℃，光照强度为1500Lux；步骤(5)无顶芽茎段的暗培养：注射完毕后将茎段小心放置于24℃人工气候箱中，在85％相对湿度，黑暗的条件下培养36h；步骤(6)症状观察：将暗培养结束的茎段置于24℃，光照强度1500Lux，培养7d观察症状，步骤(7)无顶芽茎段的腋芽的剥离，腋芽的种植：将表现明显症状的腋芽从茎段上取下，种于松针土和蛭石以1:0.6的比例混合的培养基质中，置于24℃，光照强度1500Lux。
实施例3
与实施例1的区别仅在于部分参数调整，其余同实施例1，具体为：步骤(2)番茄无顶芽茎段的预培养：松针土和蛭石以1:0.7的比例混合的培养基质中，温度为26℃，光照强度1800Lux；步骤(5)无顶芽茎段的暗培养：注射完毕后将茎段小心放置于26℃人工气候箱中，在90％相对湿度，黑暗的条件下培养48h；步骤(6)症状观察：将暗培养结束的茎段置于26℃，光照强度1800Lux，培养10d观察症状，步骤(7)无顶芽茎段的腋芽的剥离，腋芽的种植：将表现明显症状的腋芽从茎段上取下，种于松针土和蛭石以1:0.7的比例混合的培养基质中，置于26℃，光照强度1800Lux。
实施例1-3实验结果
每个实施例注射50个番茄无顶芽茎段进行遗传转化，最终，平均获得35个转化成功的PDS基因沉默的番茄植株，所需时间为10-15d；每个实施例对50个番茄无顶芽茎段进行病毒接种，平均获得45个发病的番茄植株，所需时间为8-10d。
对比例1
与实施例2的区别仅在于供试材料为Moneymaker番茄品种，选取3片真叶期的番茄幼苗，采用叶背浸润法分别接种实施例2步骤(3)的农杆菌菌液①和②，浸润完毕后将幼苗置于人工气候箱中，在80％-90％相对湿度，黑暗的条件下培养48h；之后置于23-26℃、光照强度1200-1800Lux、光照时间16h/d的防虫温室中培养，观察番茄出现症状，检测方法同实施例2的步骤(8)。最终，利用叶背浸润法对50株番茄幼苗进行遗传转化，获得15个转化成功的PDS基因沉默的番茄植株，所需时间为30-60d；利用叶背浸润法对50株番茄进行病毒接种，获得20个发病的番茄植株，所需时间为23-45d。转化成功率远低于实施例1-3，发病时间比实施例1-3所需时间长。
对比例2
与实施例2的区别仅在于采用茎基部注射法分别接种实施例2步骤(3)的农杆菌菌液①和②。最终，利用茎基部注射法对50株番茄幼苗进行遗传转化，最终获得18个转化成功的PDS基因沉默的番茄植株，所需时间为35-60d；利用茎基部注射法对50株番茄进行病毒接种，获得24个发病的番茄植株，所需时间为30-45d。转化成功率远低于实施例1-3，发病时间比实施例1-3所需时间长。
结论：按实施例1修剪的无顶芽茎段因具有不对称“Y”型结构，相对叶背浸润法与茎基注射法，容纳相同浓度的农杆菌菌液的空间更大，并且采用注射方式能对接种液的体积进行精确定量。本发明利用病毒更易侵染植物幼嫩芽叶的特性，特别适合于病毒介导的遗传转化或病毒的接种，且明显促进了病毒介导的基因沉默效果、加快了DNA病毒的侵染速度和效率，适用于扦插易成活、有腋芽的植物，具有较好的应用价值。
对比例3
与实施例2的区别仅在于，步骤(1)中，茎的形态学上端切口为斜切口，形态学下端切口为30°。经过对比培养发现上端平切口能使液膜不滑落，利于促进浸润进更多的农杆菌，利于后期出现症状。
对比例4
与实施例2的区别仅在于，步骤(1)中，茎的形态学上端切口为平切口，形态学下端切口为60°。
对比例5
与实施例2的区别在于，步骤(1)中，茎的形态学上端切口为平切口，形态学下端切口为45°。
经过对比培养发现，实施例2下端切口为30°时形成的契形结构，与土壤有最大的接触面，最易于吸水和吸取营养，无茎芽茎段生长所需时间最短。
实施例4
中蔬四号番茄无顶芽茎段遗传转化和病毒接种例
与实施例1的区别仅在于，供试材料为中蔬四号番茄，利用50个番茄无顶芽茎段，获得38个转化成功的PDS基因沉默的番茄植株，所需时间为12-15d；接种病毒TYLCV，利用50个番茄无顶芽茎段获得40个发病的番茄植株，所需时间为10-15d。
对比例6
与对比例1的区别仅在于，供试材料为中蔬四号番茄。最终，利用叶背浸润法对50株番茄幼苗进行遗传转化，获得14个转化成功的PDS基因沉默的番茄植株，所需时间为35-60d；利用叶背浸润法对50株番茄进行病毒接种，获得23个发病的番茄植株，所需时间为30-45d。转化成功率远低于实施例4，发病时间比实施例4所需时间长。
对比例7
与对比例2的区别仅在于，供试材料为中蔬四号番茄。最终，利用茎基部注射法对50株番茄幼苗进行遗传转化，最终获得20个转化成功的PDS基因沉默的番茄植株，所需时间为35-60d；利用茎基部注射法对50株番茄进行病毒接种，获得26个发病的番茄植株，所需时间为30-45d。转化成功率远低于实施例4，发病时间比实施例4所需时间长。
实施例5
威尼斯F199番茄无顶芽茎段遗传转化和病毒接种例
与实施例1的区别仅在于，供试材料为威尼斯F199番茄，利用50个番茄无顶芽茎段，获得40个转化成功的PDS基因沉默的番茄植株，所需时间为9-13d；接种病毒TYLCV，利用50个番茄无顶芽茎段获得42个发病的番茄植株，所需时间为10-12d。
对比例8
与对比例1的区别仅在于，供试材料为威尼斯F199番茄。最终，利用叶背浸润法对50株番茄幼苗进行遗传转化，获得19个转化成功的PDS基因沉默的番茄植株，所需时间为40-54d；利用叶背浸润法对50株番茄进行病毒接种，获得27个发病的番茄植株，所需时间为35-48d。转化成功率远低于实施例5，发病时间比实施例5所需时间长。
对比例9
与对比例2的区别仅在于，供试材料为威尼斯F199番茄。最终，利用茎基部注射法对50株番茄幼苗进行遗传转化，最终获得14个转化成功的PDS基因沉默的番茄植株，所需时间为36-48d；利用茎基部注射法对50株番茄进行病毒接种，获得25个发病的番茄植株，所需时间为28-42d。转化成功率远低于实施例5，发病时间比实施例5所需时间长。
注射无顶芽茎段法、叶背浸润法和茎基部注射法三种方法的效果比较数据整理如下表1：
表1
由表格数据分析可知，注射无顶芽茎段法进行处理，其转化成功率和病毒病发病率均显著高于叶背浸润法和茎基部注射法两种处理，且所需时间更短。由于叶背浸润法和茎基部注射法接种的菌液有限，对其转化效率、发病率及所需时间均造成影响。
注射无顶芽茎段法利用了病毒更易侵染植物幼嫩芽叶的特性，对茎段进行人工塑形，由于容纳农杆菌菌液的空间更大，注射器带有刻度，注射时可以大大提高接种量且可对接种液体积进行定量，因此该方法能更准确、更多接种量地进行接种，明显促进了病毒介导的基因沉默进程、加快了DNA病毒的侵染速度和效率。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
序列表
<110> 河南科技学院
<120> 一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggggtaccg gcactcaact ttataaacc 29
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggggatcct tcagttttct gtcaaacc 28
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtgttggac tctggtgatg gtgt 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atccaaacga agaatggcat gcgg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgttcgcaa gtatcaatca aggt 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgttcgcaa gtatcaatca aggt 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ataaccgcat caggtctcca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgaagttac ggatccattt 20

Claims (8)

1.一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备无顶芽茎段：将植株顶芽切掉，将茎切成若干个带有一个侧枝或一片复叶的茎段，筛选出其中含腋芽的茎段；
(2)无顶芽茎段的预培养：将人工剪取的无顶芽茎段种在培养基质中培养；
(3)制备农杆菌菌液并注射于无顶芽茎段：制备含有病毒介导的基因沉默载体的农杆菌菌液和/或含有DNA病毒侵染性克隆的农杆菌菌液，并将其注射于无顶芽茎段；
(4)无顶芽茎段的暗培养：置于黑暗条件下培养；
(5)无顶芽茎段腋芽的剥离，腋芽的种植；将暗培养结束的茎段继续培养，将表现症状的腋芽从茎段上取下，种于培养基质中培养。
2.如权利要求1所述的一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)制备无顶芽茎段具体为：取35-40cm高的植株，将顶芽切掉，将茎切成若干个带有一个侧枝或一片复叶的茎段，每个茎段长4-6cm，茎的形态学上端切口为平切口，形态学下端切口角度为30°，筛选出其中含腋芽的茎段，腋芽长度为1-3cm；茎段的形态学上切口距离侧枝或复叶基部为2.5-3.5cm，形态学下切口距离侧枝或复叶基部为1.5-2.5cm。
3.如权利要求1或2所述的一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，其特征在于，所述侧枝长度大于10cm，则切断侧枝顶部，保留侧枝3-5片叶。
4.如权利要求1或2所述的一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，其特征在于，所述无顶芽茎段具有不对称“Y”型结构。
5.如权利要求1所述的一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)无顶芽茎段的预培养具体为：需将人工剪取的无顶芽茎段种在培养基质中，置于23-26℃、光照强度1200-1800Lux、光照时间16h/d的环境培养1d；所述培养基为松针土和蛭石以1:0.5-0.7的比例混合。
6.如权利要求1所述的一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)制备农杆菌菌液并注射于无顶芽茎段具体为：制备含有病毒介导的基因沉默载体的农杆菌菌液和/或含有DNA病毒侵染性克隆的农杆菌菌液，并将其注射于无顶芽茎段，注射部位在所述无顶芽茎段的形态学上端切口，注射0.5-1ml菌液持续1-2min，拔出针头使菌液在上切口处自然形成一层液膜。
7.如权利要求1所述的一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，其特征在于，所述步骤(4)无顶芽茎段的暗培养具体为：保持所述液膜不滑落，置于23-26℃、相对湿度80-90％、黑暗的条件下培养24h-48h。
8.如权利要求1所述的一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，其特征在于，所述步骤(5)无顶芽茎段腋芽的剥离，腋芽的种植具体为：将暗培养结束的茎段置于保湿、温度23-26℃、光照强度1200-1800Lux、光照时间16h/d的防虫温室中培养5-10d后，将表现症状的腋芽从茎段上取下，种于培养基质中，置于保湿，温度23-26℃、光照强度1200-1800lux、光照16h/d的防虫温室中培养，所述培养基质为松针土和蛭石以1:0.5-0.7的比例混合。
CN201910631965.3A 2019-07-12 2019-07-12 一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法 Active CN110358790B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910631965.3A CN110358790B (zh) 2019-07-12 2019-07-12 一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910631965.3A CN110358790B (zh) 2019-07-12 2019-07-12 一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110358790A true CN110358790A (zh) 2019-10-22
CN110358790B CN110358790B (zh) 2023-02-24

Family

ID=68219326

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910631965.3A Active CN110358790B (zh) 2019-07-12 2019-07-12 一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110358790B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0937646A (ja) * 1995-07-29 1997-02-10 Takagi Ind Co Ltd トマトの栽培方法
CN101684468A (zh) * 2003-04-14 2010-03-31 林忠平 一种人工合成的人胰岛素基因及其在培育转基因番茄中的应用
CN103194486A (zh) * 2013-04-18 2013-07-10 天津大学 一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法
CN104480141A (zh) * 2014-07-06 2015-04-01 中国农业科学院果树研究所 一种番茄转基因方法
CN105613288A (zh) * 2015-12-24 2016-06-01 安徽农业大学 一种金边黄杨快繁体系的构建方法
CN106755084A (zh) * 2017-01-06 2017-05-31 福建农林大学 一种茶树快速转基因方法
CN107439378A (zh) * 2017-08-30 2017-12-08 福建省农业科学院农业工程技术研究所 一种番茄试管苗高效增殖的方法
CN109566410A (zh) * 2018-06-13 2019-04-05 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0937646A (ja) * 1995-07-29 1997-02-10 Takagi Ind Co Ltd トマトの栽培方法
CN101684468A (zh) * 2003-04-14 2010-03-31 林忠平 一种人工合成的人胰岛素基因及其在培育转基因番茄中的应用
CN103194486A (zh) * 2013-04-18 2013-07-10 天津大学 一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法
CN104480141A (zh) * 2014-07-06 2015-04-01 中国农业科学院果树研究所 一种番茄转基因方法
CN105613288A (zh) * 2015-12-24 2016-06-01 安徽农业大学 一种金边黄杨快繁体系的构建方法
CN106755084A (zh) * 2017-01-06 2017-05-31 福建农林大学 一种茶树快速转基因方法
CN107439378A (zh) * 2017-08-30 2017-12-08 福建省农业科学院农业工程技术研究所 一种番茄试管苗高效增殖的方法
CN109566410A (zh) * 2018-06-13 2019-04-05 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 一种木薯腋芽体细胞胚胎离体培养脱毒苗的培养方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QILI LIU ET AL.: "A rapid, simple, and highly efficient method for VIGS and in vitro-inoculation of plant virus by INABS applied to crops that develop axillary buds and can survive from cuttings", 《BMC PLANT BIOLOGY》 *
付超等: "农杆菌介导番茄遗传转化的相关因素优化", 《分子植物育种》 *
任永霞 等: "根癌农杆菌介导的番茄遗传转化", 《河北北方学院学报（自然科学版）》 *
张世忠 等: "番茄离体扦插快繁的影响因素研究", 《山东农业科学》 *
李文甲 等: "番茄侧枝扦插研究进展", 《长江蔬菜（学术版）》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110358790B (zh) 2023-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101849509B (zh) 一种紫马铃薯根尖脱毒与快繁技术
CN102392080B (zh) 一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法
CN102876712A (zh) 一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法
CN102181473B (zh) 一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法
CN102783415B (zh) 一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法
CN109735562A (zh) 一种经济植物有效根系转基因系统的构建方法
CN101643745B (zh) 盐芥v-焦磷酸酶基因启动子序列和其缺失突变体的应用
CN105132457B (zh) 一种快速遗传转化苜蓿的方法
CN105103947B (zh) 一种天然林下外生菌根合成的专用菌源的使用方法
CN102286526B (zh) 一种快速获得辣椒转基因植株的方法
CN105647966A (zh) 一种以棉花幼胚为受体接种trv病毒诱导基因沉默方法
CN103146744A (zh) 一种植物病毒接种方法
CN100491535C (zh) 川草二号老芒麦转抗虫基因技术
CN104152487A (zh) 一种优化的植物病毒接种方法
CN101935672B (zh) 木本植物的活体生长锥农杆菌转化法
CN110358790A (zh) 一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法
CN103026966B (zh) 一种利用离体叶片鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法
CN109804913A (zh) 一种白羊草-内生真菌共生体的构建方法
MacKinnon et al. Progress towards transformation of fibre hemp
CN103695537A (zh) 一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法
CN110904144B (zh) 一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法
CN104630261B (zh) 一种提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法
CN103451229A (zh) 一种抗玉米矮花叶病RNAi载体的构建及应用
CN109825456B (zh) 一种玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1及其应用
CN102533851A (zh) 一种高通量农杆菌介导的玉米基因原位转化方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant