CN104480141A - 一种番茄转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供了一种番茄转基因方法，涉及农业生物技术领域，可以不在无菌环境中进行，且简易、易操作、成本低。所述方法包括：将农杆菌活化至OD600＝0.6；将生长2.5-3.5个月的番茄植株，剪去4个侧枝，获得4个剪口；在剪出所述剪口的当天，利用OD600＝0.6的农杆菌对所述剪口进行浸染；转基因所用载体为pCAMBIA3301-N，所述载体中包含β-半乳糖苷酶(GUS)报告基因。待所述剪口处萌发的不定芽生长至6～10cm时，剪取所述不定芽的小叶柄进行PCR/GUS染色；将小叶柄染为蓝色的不定芽确定为转基因不定芽，将非转基因不定芽去除，以确保转基因不定芽的营养供给。

Description

一种番茄转基因方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种番茄转基因方法。

背景技术

番茄作为一种基因工程研究的模式植物，在果实发育、品质等性状相关基因的功能鉴定中具有重要作用。

常规的番茄转基因方法如下：第一步：将番茄种子在无菌条件下利用酒精和次氯酸钠消毒，然后用无菌水洗涤；第二步：将处理好的番茄种子播种于预先配制的MS培养基上，于23℃左右、黑暗条件下培养3～4天；第三步，待种子萌发后转移至光下继续培养，直至子叶完全展开；第四步，将子叶在无菌条件下剪下，去除两端，保留中间大约０.5cm长部分(叶背向下)接种于预先配制的分化培养基，于黑暗条件下预培养2～4天；第五步，将农杆菌活化至OD600＝0.6，离心收集菌体，以等体积的MS液体培养基进行稀释，将预培养的子叶放入菌液中，震荡培养15～20分钟，之后，将其在无菌滤纸上吸干菌液，转接至分化培养基上，于23℃左右、黑暗条件下共培养2～4天；第六步，以抗生素(头孢噻肟钠)溶液对共培养的子叶进行洗涤，之后无菌水洗涤，于无菌滤纸上吸干，转移至预先配制的筛选培养基上，每隔20天左右继代一次，待长出有生长点的小苗后，转移至生根培养基上；第七步，将生根的小苗通过PCR/GUS染色的方法进行转基因检测，确定为转基因小苗进行炼苗后，移栽至营养钵中，于网室内进行培养。

综上可见，常规的转基因方法需要专门的仪器设备(高压灭菌锅、超净工作台和光照培养箱/培养室等)，且耗时长、操作繁琐、易污染，成本较高。

发明内容

本发明的实施例提供一种番茄转基因方法，可以不在无菌环境中进行，且简易、易操作、成本低。

一种番茄转基因方法，包括：

将农杆菌活化至OD600＝0.6；

将生长2.5～3.5个月的番茄植株，剪去4个侧枝，获得4个剪口；

在剪出所述剪口的当天，利用OD600＝0.6的农杆菌对所述剪口进行浸染；转基因所用载体为pCAMBIA3301-N，所述载体中包含β-半乳糖苷酶GUS报告基因。

可选的，所述方法还包括：待所述剪口处萌发的不定芽生长至6～10cm时，剪取所述不定芽的小叶柄进行PCR/GUS染色；

将小叶柄染为蓝色的不定芽确定为转基因不定芽，将非转基因不定芽去除，以确保转基因不定芽的营养供给。

上述技术方案较传统方法(在无菌条件下侵染番茄子叶)简便易行，且不必在无菌条件下进行，萌发的不定芽可直接利用GUS染色或PCR检测，省去移栽过程，能迅速结果，大大缩短了获得转基因果实的时间，方法简单、易操作、成本低。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一种番茄转基因方法的流程示意图；

图2为本发明实施例提供的番茄植株处理后的侧枝，造成剪口的图示；

图3为本发明实施例提供的番茄植株上侧枝剪口萌发的不定芽图示；

图4为本发明实施例提供的番茄植株上主枝剪口萌发的不定芽图示；

图5为不定芽的GUS染色检测结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种番茄转基因方法，如图1所示，所述方法包括以下步骤：

101、将农杆菌活化至OD600＝0.6。

首先挑农杆菌于50mL的三角瓶中，液体培养基中振荡过夜，次日早晨，取0.5mL菌液转移至150mL的三角瓶中，加入25mL液体培养基继续振荡培养，直至OD600＝0.6。

其中，所述液体培养基包括：酵母提取物(1％)，蛋白胨(1％)，氯化钠(0.5％)，卡那霉素(Kanamycin，50mg·L^-1)，利福平(Rifampicin，50mg·L^-1)。

102、将生长2.5～3.5个月的番茄植株，剪去4个侧枝，获得4个剪口。

示例的如图2所示，选取生长约3个月左右的番茄植株，剪去侧枝(可以留一小茎段，也可以全抹去)，每株番茄可处理多个侧枝，获得多个人造伤口。

103、在剪出所述剪口的当天，利用OD600＝0.6的农杆菌对所述剪口进行浸染；转基因所用载体为pCAMBIA3301-N，所述载体中包含GUS(β-半乳糖苷酶)报告基因。

将步骤101中获得的农杆菌收集菌体，用等体积的10mM的氯化镁溶液进行悬浮，加入100μM的乙酰丁香酮，利用棉签沾取菌液，对剪口进行涂抹，转基因所用载体为pCAMBIA3301-N，载体中包含GUS(β-半乳糖苷酶)报告基因。

104、待所述剪口处萌发的不定芽生长至6～10cm时，剪取所述不定芽的小叶柄进行GUS染色。

如图3和图4所示，分别为所述番茄植株上侧枝剪口萌发的不定芽和主枝剪口萌发的不定芽。

105、将小叶柄染为蓝色的不定芽确定为转基因不定芽，将非转基因不定芽去除，以确保转基因不定芽的营养供给。

示例的如图5所示，1和2号：GUS染色检测的叶柄为蓝色，即这两个不定芽即为转基因芽；3和4号：GUS染色检测的叶柄没有发现蓝色，即为非转基因的不定芽。

根据以上步骤即可得到番茄的转基因植株，以下为具体实施例：

选取3株生长约3个月左右的番茄植株，每株剪去4个侧枝(可以留一小茎段，也可以全抹去)，共处理获得12个剪口，于当天利用活化好的农杆菌(OD600＝0.6左右)对上述剪口进行浸染；载体为pCAMBIA3301-N。于45～55天左右，所述剪口处萌发的不定芽生长至6～10cm时，对所述剪口萌发的小芽进行GUS(β-半乳糖苷酶)染色鉴定；鉴定芽数量为80个，其中有2个小芽的茎段染成了蓝色(图5的1和2号)，证明载体已成功转入番茄植株内，此时将其他未染成蓝色的小芽去除，只保留1号和2号对应的小芽。

试验表明，应用本发明实施例提供的方法，其转化率约为2.5％，且较传统方法(在无菌条件下侵染番茄子叶)简便易行，且不必在无菌条件下进行，萌发的小苗省去移栽过程，能迅速结果，大大缩短了获得转基因果实的时间。整个方法简单、易操作、成本低。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种番茄转基因方法，其特征在于，包括：

将农杆菌活化至OD600＝0.6；

将生长2.5～3.5个月的番茄植株，剪去多个侧枝，从而造成多个伤口；

在造成所述伤口的当天，利用OD600＝0.6的农杆菌对所述剪口进行浸染；转基因所用载体为pCAMBIA3301-N，所述载体中包含β-半乳糖苷酶GUS报告基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

待所述剪口处萌发的不定芽生长至6～10cm时，剪取所述不定芽的小叶柄进行GUS染色；

将小叶柄染为蓝色的不定芽确定为转基因不定芽，将非转基因不定芽去除，以确保转基因不定芽的营养供给。