CN103598010A - 桑黄原生态仿野生栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种桑黄原生态仿野生栽培方法，该方法包括如下步骤：（1）从野生桑黄子实体上分离的菌株经纯化后接种到母种培养基中培养获得桑黄母种；（2）桑黄母种接种到原种培养基上培养获得桑黄原种；（3）将桑黄原种接种到栽培袋内的木钉培养基中培养获得木钉栽培种；（4）将长满桑黄菌丝体的木钉栽培种接种到桑树活体上进行自然培养。本发明是通过野生桑黄分离纯化获得Inonotussanghuang(桑黄)菌种，然后将菌种直接接种在桑园的活桑树上，以桑树活体作为桑黄生长寄主，人为增加桑树感染桑黄菌的几率，栽培方式更加仿野生，子实体与野生相似，药用价值更高。

Description

桑黄原生态仿野生栽培方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种桑黄原生态仿野生栽培方法。

背景技术

桑黄，又称桑臣、桑耳、胡孙眼、桑黄菇。《神农本草经》中记载其药用功效：“利五脏，宣肠胃气，排毒气。”据现代医学研究资料，桑黄是目前国际公认的生物治癌药剂中有效率排在第一位的珍稀药用真菌。桑黄隶属担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、层孔菌属，是一种珍贵多年生大型药用真菌。文献报道的“桑黄”曾先后采用Phellinus linteus (裂蹄木层孔菌)、Phellinus igniarius (火木层孔菌)、Phellinusbaumii (暴麻子, 鲍姆木层孔菌)等学名。吴声华、戴玉成等经6年研究,发现真正的桑黄是以往未曾报道的世界新种Inonotus sanghuang (桑黄)，且仅生长在桑属（Morus）树干。

目前，由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，桑黄在自然界中形成子实体困难，造成天然的桑黄数量非常稀少，自然界中可供药用的资源有限，加之国内外市场对桑黄的需求量越来越大，致使国内各产地药农掠夺性采集，子实体无法大量形成，难以成为稳定的工业产品来源，对桑黄产业的发展十分不利，因此通过人工培植来弥补野生资源的不足显得尤为重要。但是桑黄人工栽培极其困难，存在着培养条件苛刻、生长周期长的问题。

目前栽培的人工栽培主要有两种，一种是以桑树、杨树、栎树的段木栽培为主，段木栽培需要大量的木材资源，资源浪费比较严重，难以规模化栽培；另一种是袋料栽培，但是存在培养基营养供给不充分，子实体发育较小、易染杂菌等问题。申请号为200410041704.X的中国专利公开了一种桑黄人工高产栽培方法及桑黄子实体的应用，该发明采用袋料栽培，为了解决培养基营养供给不充分，子实体发育较小、易染杂菌等问题。在培养基中添加了生长素，生长素的添加没有从根本上解决培养基的问题，而且生长素的添加对桑黄的品质有影响，同时不利于桑黄的天然生长。

发明内容

本发明提供一种桑黄原生态仿野生栽培方法，该方法以桑树活体作为桑黄生长寄主，人为增加桑树感染桑黄菌的机率，栽培方式更加仿野生，子实体与野生相似，药用价值高且产量稳定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种桑黄原生态仿野生栽培方法，该方法包括如下步骤：（1）从野生桑黄子实体上分离的菌株经纯化后接种到母种培养基中培养获得桑黄母种；（2）桑黄母种接种到原种培养基上培养获得桑黄原种；（3）将桑黄原种接种到栽培袋内的木钉培养基中培养获得木钉栽培种；木钉培养基按重量配比的配方为：桑枝段45-55％、桑木屑15-20％、麸皮12-18％、玉米粉12-18％、糖0.8-1.2％、碳酸钙0.8-1.2％，上述配方组分总量计100%，另加硫酸铵0.5％。所述桑枝段直径0.7-1厘米，长3-4厘米，一端尖；（4）将长满桑黄菌丝体的木钉栽培种接种到桑树活体上进行自然培养。本发明是通过野生桑黄分离纯化获得Inonotus sanghuang (桑黄)菌种，然后将菌种直接接种在桑园的活桑树上，以桑树活体作为桑黄生长寄主，人为增加桑树感染桑黄菌的机率，栽培方式更加仿野生，子实体与野生相似，药用价值更高。本发明的仿野生栽培方式同样适用于其他桑黄品种。

作为优选，所述木钉培养基按重量配比的配方为：桑枝段50％、桑木屑18％、麸皮15％、玉米粉15％、糖1％、碳酸钙1％，另加硫酸铵0.5％。所述桑枝段直径0.8厘米，长3厘米。桑枝木钉菌种具有：菌种不易老化、保质期长、萌发快、接种方便快捷、不易死亡等优点，可大大提高成活率。

作为优选，步骤（4）中的接种过程如下：在修枝后的桑树枝丫、节疤或瘤状突起部打孔穴，深1.5-2厘米，将所述的木钉栽培种塞入该孔穴内，封上树皮盖，树皮盖事先从相同树种上取得，用槌子敲打平实。

作为优选，步骤（4）中的接种工具为电钻或皮带冲。

作为优选，母种培养基的配方为：桑黄浸汁100ml、马铃薯250g、葡萄糖20g、琼脂18 g～23g、硫酸铵1.5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g，加水至1000ml； 

母种培养基的配制方法如下：按配方称取所需原料，马铃薯去皮挖芽眼、切片，马铃薯片煮后用纱布过滤，取其滤液加入琼脂、葡萄糖，加热至琼脂溶化；桑黄切片浸泡或煮汁得到桑黄浸汁，与其他组分混合后，补足水至1000ml，调pH5～6.5。桑黄浸汁组分的加入，使母种菌丝更加强壮，并有利于桑黄菌种的复壮。

作为优选，母种培养基的配方为：桑枝屑50 g、新鲜麸皮20 g、马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18 g～23g、硫酸铵1.5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g；母种培养基的配制方法如下：按配方称取所需原料，桑枝屑和新鲜麸皮加500-600ml水混合煮汁，用纱布过滤，取滤液；马铃薯去皮挖芽眼、切片，马铃薯片煮后用纱布过滤，取其滤液加入琼脂、葡萄糖，加热至琼脂溶化，与前面制得的桑枝屑和新鲜麸皮滤液混合，并补足水至1000ml，调pH5～6.5。该母种培养基的配方相对PDA培养基营养更丰富，更适宜桑黄菌丝生长。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、蚕桑业是我国有5500多年历史的传统产业，2010年我国有1210万亩桑园，在桑园内进行桑树活体接种桑黄菌，可快速、规模化栽培桑黄子实体。     2、本发明培养方式简单，处于自然野生环境，因此近似野生桑黄，药用价值高且产量稳定，每株桑树至少产桑黄干品20克。解决了目前人工袋料栽培技术中桑黄子实体难形成，袋料、段木人工栽培中桑黄子实体形态和药用成份差异的难题。     3、本发明采用以桑树活体作为培养寄主，省去了现有栽培技术中备料、粉碎、装袋、灭菌以及接种后室内培养等繁杂工序，生产成本只含有菌种款和接种人工费，大大降低了生产成本及劳动强度，保守计算只有传统方法的二十分之一左右。     4、仿生态栽培桑黄及桑黄深加工产品良好的市场前景，将为桑园带来巨大经济效益，促进农民种桑保桑的积极性，对稳定我国桑园面积，实现蚕桑产业与药用菌产业的双赢作出一定成绩。 

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。

实施例1：

1、桑黄菌种分离及桑黄母种的培养

从桑树上选取朵大、肉厚、菌褶面鲜黄色、无病虫害的桑黄子实体作为分离材料。对桑黄子实体的表面冲洗消毒后，在无菌条件下将子实体切开，在子实体中间层挑取约0.5厘米见方的组织块按一定距离放在母种培养基平板上，每皿六块，置28℃左右条件下培养，24小时后组织块上长出细密绒毛菌丝，用接种刀将先端菌丝移接入母种培养基上，置25℃左右条件下培养10天，菌丝布满斜面。

如发现糊状粘稠菌落或生长很快的真菌菌落则不予转管，需重新分离。桑黄菌种分离也可采用孢子分离、基内菌丝分离，无论哪种分离方法，在大面积栽培前必须进行出菇试验，证实确无异常现象，菌种才能扩大投入生产。

母种培养基可选择PDA 培养基，或者是PDA改良培养基。本实施例采用如下配方（PDA改良培养基）：桑黄浸汁适量、马铃薯250g、葡萄糖20g、琼脂18 g～23g、硫酸铵1.5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g，加水至1000ml。桑黄浸汁组分的加入，使母种菌丝更加强壮，并有利于桑黄菌种的复壮。

母种培养基的配制方法：按配方称取所需原料，马铃薯去皮挖芽眼、切片，马铃薯片经煮后用纱布过滤，取其滤液加入琼脂、葡萄糖，加热至琼脂溶化；桑黄切片浸泡或煮汁得到桑黄浸汁，与其他组分混合后，补足水至1000ml，调pH5～6.5。趁热分装入试管内，每支试管的培养基容量约占试管高度的1/5，一般1000ml培养基可装20×200试管100支、管口塞上棉塞或硅胶塞，用薄膜包扎，灭菌。

培养基灭菌：用高压蒸汽灭菌锅灭菌。使用方法按各压力锅使用说明：盖紧锅盖，旺火加温并打开排气阀，当水沸腾时，锅内排气软管蒸汽冲出排气阀，约5 min～8 min，冷空气排尽，方可关闭排气阀，待锅内压力指针上升至0.103Mpa，温度121℃时，保压30min，停止加热，待压力指针降到0时逐步打开盖子，利用余热烘干棉塞，而后取出试管，趁热斜摆放，上覆棉絮或其他保暖物，以减少管壁冷凝水，冷却后即成斜面试管。

、桑黄原种生产

取分离得到，经出菇试验无异常的优良桑黄母种，转管、扩大培养后用于原种、栽培种的生产。

桑黄原种生产一般采用750克蘑菇瓶或15×33cm低压聚乙烯袋，瓶子应事先清洗消毒，有条件情况下最好置烘箱中干热灭菌后装料。

桑黄原种培养基组分和配制方法：桑木屑77％、麸皮15％、玉米粉15％、硫酸铵0.5％、糖1％、碳酸钙1％，另加0.5％的硫酸铵。原种培养基必须进行高压灭菌，在121℃下高压灭菌保持2 小时。自然下磅，冷却。

接种培养 在无菌条件下在灭菌后的原种培养基上接入优良的桑黄母种，于25℃左右的恒温箱（室）中培养。一般情况下30天左右菌丝满瓶（袋）。菌丝满瓶（袋）后，再继续培养7天左右得到桑黄原种。

、木钉栽培种生产

木钉培养基的配制  在现有的桑黄生产工艺中，栽培种一般采用谷粒培养基或木屑培养基。而本发明选用桑枝木段加工成的桑枝木钉为主的木钉培养基。

木钉培养基：桑枝段50％（桑枝段直径0.8厘米，长3厘米，一端尖。如使用干桑枝段需清水浸泡8小时后捞出备用）、桑木屑18％、麸皮15％、玉米粉15％、糖1％、碳酸钙1％。上述组分混合后得到的混合物总重量计100%，再加入占该混合物总重量0.5％的硫酸铵。充分拌匀后装入15cm×33cm的低压聚乙烯袋（或蘑菇瓶）中。

将桑黄原种接种到栽培袋内的木钉培养基中培养获得木钉栽培种。在无菌条件下接入优良的桑黄原种，在温度25℃左右的培养箱中培养，一般情况下30天左右菌丝满袋。再继续培养7天左右，促使菌丝长透桑枝段内。

、木钉栽培种接种到桑树活体生产桑黄

培养场所及寄主的选择：栽培场地选择蚕桑生产区自然桑园，桑园树上己长有野生桑黄的桑园区更佳。寄主选择树龄在10年以上，且经反复修枝，树杆瘤状突起多的桑树。

桑树活体接种季节：一般选择每年桑树修枝后进行，每年的2月中旬—4月或9月中旬—10月均可。按自然气温条件来说，气温稳定在10℃以上可以接种。

接种使用工具：接种工具为电钻（电源方便场所可采用电钻进行打孔）或皮带冲（打孔的皮带冲口径为9.6毫米，取树皮盖的皮带冲口径为12.7毫米）。

接种方法：菌种事先从瓶中取出或撕开菌袋，将菌种放入经消毒后的洁净盆内。在修枝后的桑树枝丫、节疤、瘤状突起部打孔穴，深1.5-2厘米。将木钉栽培种塞入孔穴内，封上树皮盖（用直径10.7毫米皮带冲事先从相同树种上取盖，）用槌子轻轻敲打平实。选睛天接种，菌种避免阳光直射，打孔穴、接种、封盖应流水作业不间断，当天打孔和当天挖出的菌种应当天用完，不得过夜。工具、种瓶、容器、手部等操作前均需经过消毒。

发菌管理：其目的就是让接入的桑枝段菌种能尽快在桑树中得定植和蔓延。因此接种7～10天后，应对接种孔穴进行发菌检查，特别是接种后即遇雨天、低温时应及时检查。如发现孔穴变黑、红、黑、绿等杂菌感染现象或死穴时，应及时进行补种。

桑枝木钉菌种能迅速在桑树反复剪伐而膨大的节疤、瘤状部的枯死部分定植、蔓延。菌丝经3~4个月的生长后，一般在活体桑树经反复剪伐而膨大的节疤、瘤状部下方陆续可见柠檬黄或嫩黄色的桑黄子实体原基生成并不断延展增大。遇不适宜子实体生长的季节，子实体缓慢生长或暂时休眠，待环境条件适宜时，子实体又继续快速延展增大。桑黄子实体经2~3年自然生长后便可采收。本发明培养方式简单，处于自然野生环境，因此近似野生桑黄，药用价值高且产量稳定，每株桑树至少产桑黄干品20克。解决了目前人工袋料栽培技术中桑黄子实体难形成，袋料、段木人工栽培中桑黄子实体形态和药用成份差异的难题。本发明采用以桑树活体作为培养寄主，省去了现有栽培技术中备料、粉碎、装袋、灭菌以及接种后室内培养等繁杂工序，生产成本只含有菌种款和接种人工费，大大降低了生产成本及劳动强度，保守计算只有传统方法的二十分之一左右。

实施例2：

具体方法同实施例1，不同之处在于：母种培养基采用如下配方：桑枝屑50 g、新鲜麸皮20 g、马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18 g～23g、硫酸铵1.5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g。

母种培养基的配制方法：按配方称取所需原料，桑枝屑和新鲜麸皮加500-600ml水混合煮汁，用纱布过滤，取滤液。马铃薯去皮挖芽眼、切片。马铃薯片煮后用纱布过滤，取其滤液加入琼脂、葡萄糖，加热至琼脂溶化，与前面制得的桑枝屑和新鲜麸皮滤液混合，并补足水至1000ml，调pH5～6.5。趁热分装入试管内，每支试管的培养基容量约占试管高度的1/5，一般1000ml培养基可装20×200试管100支、管口塞上棉塞或硅胶塞，用薄膜包扎，灭菌。

实施例3：

具体方法同实施例1，不同之处在于：木钉培养基按重量配比的配方为：桑枝段45％、桑木屑20％、麸皮16.6％、玉米粉16％、糖1.2％、碳酸钙1.2％，另加硫酸铵0.5％。所述桑枝段直径0.7厘米，长4厘米，一端尖。

实施例4：

具体方法同实施例1，不同之处在于：木钉培养基按重量配比的配方为：桑枝段55％、桑木屑19.4％、麸皮12％、玉米粉12％、糖0.8％、碳酸钙0.8％，另加硫酸铵0.5％。所述桑枝段直径1厘米，长3厘米，一端尖。

实施例5：

具体方法同实施例1，不同之处在于：木钉培养基按重量配比的配方为：桑枝段50％、桑木屑15％、麸皮18％、玉米粉15％、糖1％、碳酸钙1％，另加硫酸铵0.5％。所述桑枝段直径0.8厘米，长4厘米，一端尖。

本发明采用以桑树活体作为培养寄主，省去了现有栽培技术中备料、粉碎、装袋、灭菌以及接种后室内培养等繁杂工序，生产成本只含有菌种款和接种人工费，大大降低了生产成本及劳动强度，保守计算只有传统方法的二十分之一左右。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (6)

1.一种桑黄原生态仿野生栽培方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

（1）从野生桑黄子实体上分离的菌株经纯化后接种到母种培养基中培养获得桑黄母种；

（2）桑黄母种接种到原种培养基上培养获得桑黄原种；

（3）将桑黄原种接种到栽培袋内的木钉培养基中培养获得木钉栽培种；

木钉培养基按重量配比的配方为：桑枝段45-55％、桑木屑15-20％、麸皮12-18％、玉米粉12-18％、糖0.8-1.2％、碳酸钙0.8-1.2％，上述配方组分总量计100%，另加硫酸铵0.5％；所述桑枝段直径0.7-1厘米，长3-4厘米，一端尖；

（4）将长满桑黄菌丝体的木钉栽培种接种到桑树活体上进行自然培养。

2.根据权利要求1所述的桑黄原生态仿野生栽培方法，其特征在于所述木钉培养基按重量配比的配方为：桑枝段50％、桑木屑18％、麸皮15％、玉米粉15％、糖1％、碳酸钙1％，所述桑枝段直径0.8厘米，长3厘米。

3.根据权利要求1所述的桑黄原生态仿野生栽培方法，其特征在于：步骤（4）中的接种过程如下：在修枝后的桑树枝丫、节疤或瘤状突起部打孔穴，深1.5-2厘米，将所述的木钉栽培种塞入该孔穴内，封上树皮盖，树皮盖事先从相同树种上取得，用槌子敲打平实。

4.根据权利要求1或3所述的桑黄原生态仿野生栽培方法，其特征在于：步骤（4）中的接种工具为电钻或皮带冲。

5.根据权利要求1或2或3所述的桑黄原生态仿野生栽培方法，其特征在于：母种培养基的配方为：桑黄浸汁100ml、马铃薯250g、葡萄糖20g、琼脂18 g～23g、硫酸铵1.5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g，加水至1000ml； 

母种培养基的配制方法如下：按配方称取所需原料，马铃薯去皮挖芽眼、切片，马铃薯片煮后用纱布过滤，取其滤液加入琼脂、葡萄糖，加热至琼脂溶化；桑黄切片浸泡或煮汁得到桑黄浸汁，与其他组分混合后，补足水至1000ml，调pH5～6.5。

6.根据权利要求1或2或3所述的桑黄原生态仿野生栽培方法，其特征在于：母种培养基的配方为：桑枝屑50 g、新鲜麸皮20 g、马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18 g～23g、硫酸铵1.5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g；母种培养基的配制方法如下：按配方称取所需原料，桑枝屑和新鲜麸皮加500-600ml水混合煮汁，用纱布过滤，取滤液；马铃薯去皮挖芽眼、切片，马铃薯片煮后用纱布过滤，取其滤液加入琼脂、葡萄糖，加热至琼脂溶化，与前面制得的桑枝屑和新鲜麸皮滤液混合，并补足水至1000ml，调pH5～6.5。