CN112514738A - 一种优质桑黄菌种生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食药用菌生产技术领域，尤其是一种优质桑黄菌种生产方法，包括母种培养、原种培养、栽培中培养；所述母种培养基，按重量份计，其原料组成为：桑树木屑80‑120份、土豆80‑120份、葡萄糖15‑25份、琼脂粉8‑12份、800‑1200份水；所述原种培养基、栽培种培养基，按重量百分比计，其原料组成为：桑树木屑72.5‑82.5％、麦麸15‑25％、石灰1％、石膏1％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾0.3％；培养基的水分为60‑70％。本发明培育的桑黄菌种，质量稳定，生长速度快；接种到桑树木屑栽培料中大约45天左右开始形成原基，缩短了栽培周期，并且在桑木屑进行开展了菌种生产，为桑树种植提供了菌种的适应性培养方法；而且操作过程简单易行，便于控制，适于大规模培育桑黄菌种。

Description

一种优质桑黄菌种生产方法

技术领域

本发明属于食药用菌生产技术领域，尤其是一种优质桑黄菌种生产方法。

背景技术

桑黄，在我国中南地区通常生长于桑属(MorusL)植物上，且其子实体为黄褐色，故名桑黄。它是近几年开发的一种多年生的珍贵药用真菌，是我国最具有发展前景的药用真菌之一；是多孔菌科，木层孔菌属(Phellinus)和桑黄属(Inontus)的真菌的统称。

桑黄子实体入药，味微苦，常用于治疗血淋、脱肛、泻血、带下、闭经、脾虚泄泻、症瘕积聚、癖饮等症状。近代研究表明桑黄的水提物对小白鼠S-180的抑制率为96.7％，对艾氏腹水癌的抑制率为87％；而桑黄中的多糖是抗癌作用的主要成分。由于桑黄具有显著的抗癌效果，目前对桑黄的研究已成为国际药用真菌领域的热点。

桑黄种类繁多，目前国内外对桑黄的研究主要集中在裂蹄针层孔菌[Phellinuslinteus(Berk.et.Curt)Teng]、火木层孔菌[Phellinus igniarius(L.et.Fr)Quel]和鲍氏层孔菌(Phellinus baumii Pilat)。桑黄Inonotus sanghuang Sheng H.Wu,T.hatt&Y.C.Dai，为我国台湾学者吴声华于2012年在国内发现并命名的新种，寄生于桑树上，其子实体菌盖多数叠生在一起，马蹄形或不规则形，幼时柠檬黄至金黄色，老时土黄色或黄棕色，是近年来桑黄研究的新星。由于桑黄菌(Inonotus sanghuang)发现较晚，对于该桑黄菌种的培育研究较少。

申请号为201710201117.X的中国专利公开了一种桑黄菌株及其应用，具体公开了桑黄栽培种的培育：先将桑树桑黄GY-S01菌株接种到母种培养基中培养得到母种，再将母种接种到原种培养基上培养得到原种，然后将原种接种到栽培培养中进行栽培种的培育。所述1000ml母种培养基的基料组成为：一份桑树木屑液、10g大豆蛋白胨、5g酵母膏、20g琼脂糖、10mg维生素B1、余量为水。所述原种培养基的原料组成为：80份质量份小麦粒、19质量份桑树木屑、1质量份石膏粉；所述原种培养基的含水率为50-55％。所述栽培培养基的组成为：70质量份桑树木屑、25质量份麦麸皮、4质量份豆粕、1质量份石膏粉和水；所述栽培培养基的水分含量为60-65％。该桑黄菌株出黄快。

又如申请号为CN201310558787.9公开的一种桑黄原生态仿野生栽培方法，该方法包括如下步骤：(1)从野生桑黄子实体上分离的菌株经纯化后接种到母种培养基中培养获得桑黄母种；(2)桑黄母种接种到原种培养基上培养获得桑黄原种；(3)将桑黄原种接种到栽培袋内的木钉培养基中培养获得木钉栽培种；(4)将长满桑黄菌丝体的木钉栽培种接种到桑树活体上进行自然培养。木钉培养基按重量配比的配方为：桑枝段45-55％、桑木屑15-20％、麸皮12-18％、玉米粉12-18％、糖0.8-1.2％、碳酸钙0.8-1.2％，上述配方组分总量计100％，另加硫酸铵0.5％；所述桑枝段直径0.7-1厘米，长3-4厘米，一端尖。母种培养基的配方为：桑黄浸汁100ml、马铃薯250g、葡萄糖20g、琼脂18g～23g、硫酸铵1.5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g，加水至1000ml。

上述专利公开了桑黄菌(Inonotus sanghuang)菌种的培养方法，在培育出桑黄菌菌种方面确得了一定成效，但是普遍存在菌种生长速度慢及质量稳定性不够的缺陷，一个重要原因是菌种在培养基中难以均匀分布，其对培养基中的营养吸收也不均匀，局部会被培养基催熟，使其老化，甚至死亡，这明显降低了桑黄菌种的生产效率及产品质量，影响桑黄的药用价值。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种优质桑黄菌种生产方法，尤其是桑黄Inonotus sanghuang Sheng H.Wu,T.hatt&Y.C.Dai菌种的生产方法，具体是通过以下技术方案实现的：

一种优质桑黄菌种生产方法，包括以下步骤：

(1)母种培养：将桑黄菌菌株接种到对照培养基上活化，待菌落直径达到3～5cm时，再在平板上用打孔器打下直径为5mm的菌饼，接种到母种培养基上，25～26℃恒温避光培养，制得母种；

(2)原种培养：将母种结合到原种培养基上，26℃避光培养，制得原种；

(3)栽培种培养：将原种接种到栽培种培养基上，26℃避光培养，制得优质菌种。

优选地，所述对照培养基，按重量份计，其原料组成为：土豆150-250份，葡萄糖15-25份、琼脂粉8-12份、800-1200份水。

优选地，所述母种培养基，按重量份计，其原料组成为桑树木屑80-120份、土豆80-120份、葡萄糖15-25份、琼脂粉8-12份、800-1200份水。

更优选地，所述母种培养基，按重量份计，其原料组成为桑树木屑100份、土豆100份、葡萄糖20份、琼脂粉10份、1000份水。

优选地，所述母种培养基的制备方法为：先将木屑、土豆用沸水煮30min后，6层纱布过滤2次，添加其他配料混匀并用蒸馏水定容；分装到规格为20*200的试管中，在121度、0.1Mpa下灭菌30min，取出排放成试管斜面培养基，冷却后即得母种培养基。

优选地，所述原种培养基、栽培种培养基，按重量百分比计，其原料组成为：桑树木屑72.5-82.5％、麦15-25％、石灰1％、石膏1％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾0.3％；培养基的水分为60-70％，pH自然。

更优选地，所述原种培养基、栽培种培养基，按重量百分比计，其原料组成为：桑树木屑77.5％，麦麸20％，石灰1％，石膏1％，葡萄糖1％，硫酸镁0.2％，磷酸二氢钾0.3％；培养基的水分为60％，pH自然。

需要说明的是，上述原种培养基、栽培种培养基的制备为：按上述配方将原料混合均匀后，分装到规格为14×28的聚丙烯折角菌袋中，在121度、0.1Mpa下灭菌120min，冷却后，即得原种培养基、栽培种培养基。

需要说明的是，所述黄原种培养基、栽培种培养基中，桑树木屑是将桑树废弃物、桑树枝丫及淘汰的桑树木材粉碎过13mm筛，风干后制成。

需要说明的是，上述桑黄菌株是从野生桑树上寄生的桑黄子实体分离所得，经过ITS分析为Inonotus sanghuang Sheng H.Wu,T.hatt&Y.C.Dai菌株。

本发明为了解决了桑黄菌种对培养基吸收不均匀的问题，对培养母种、原种的培养基配方进行了研究：

1、母种培养基配方研究：

1.1试验材料：

Inonotus sanghuang Sheng H.Wu,T.hatt&Y.C.Dai菌株。

1.2培养基：

对照培养基(ck)：土豆150-250g，葡萄糖15-25g、琼脂粉8-12g、水800-1200ml；

培养基1：杂木屑150-200g，葡萄糖15-25g，琼脂粉8-12gg，水800-1200mlml；

培养基2：桑树木屑150-200g，葡萄糖15-25gg，琼脂粉10g，水800-1200mlml；

培养基3：杂木屑80-120g、土豆80-120g、葡萄糖15-25g、琼脂粉8-12g、水800-1200ml；

培养基4：桑树木屑80-120g、土豆80-120g、葡萄糖15-25g、琼脂粉8-12g、水800-1200ml。

培养基5：杂木屑100g，土豆100g，葡萄糖20g，琼脂粉10g，水1000ml。

培养基6：申请号为201710201117.X的专利公开的母种培养基：一份桑树木屑液、10g大豆蛋白胨、5g酵母膏、20g琼脂糖、10mg维生素B1、余量为水；每一份桑树木屑滤液的制备方法如下：100g桑树木屑加入1000ml水，煮沸，过滤并收集滤液。

培养基7：申请号为CN201310558787.9的专利公开的母种培养基：黄浸汁100ml、马铃薯250g、葡萄糖20g、琼脂18g～23g、硫酸铵1.5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g，加水至1000ml。

上述培养基中，桑树木屑为收集桑树枝丫或废弃的桑木用切片粉碎机粉碎后直接使用，颗粒大小与购买的杂木屑一致。

按照上述配方，先将木屑、土豆用沸水煮30min后，6层纱布过滤2次，添加其他配料混匀并用蒸馏水定容。121℃、0.1MPa条件下灭菌30min，冷却到60℃左右时，分别分装到预先灭菌的90平板中，每个平板倒入量为15mL，平放冷凝备用。

1.3接种与培养：

先将供试桑黄菌种接到对照(ck)培养基平板上进行活化，待菌落直径达到3～5cm时，再在平板上用打孔器打下直径为5mm的菌饼，分别接种至不同的母种培养基平板上，以ck为对照。25～26℃恒温培养，每6h观察1次菌丝的萌发情况，1周后观察菌丝的生长特性，并用十字交叉法测定菌落直径，计算菌丝生长速度。菌丝生长速度(mm/d)＝(菌落直径-菌饼直径)/培养时间/2，设3个重复。桑黄菌丝在不同培养基上的生长特性如附图1、表1所示，桑黄菌丝在不同培养基中的萌发时间及生长速度如表2所示。

表1 桑黄菌丝不同培养基中的生长特性

从表1和图1中可知，在3、4、5号培养基上，菌丝生长稠密、边缘整齐、菌丝粗壮、菌落淡黄色；在1号培养基上，菌丝生长较稀、边缘较整齐、菌丝较细弱、菌落淡黄色；在2号培养基上，菌丝生长稠密、边缘整齐、菌丝较粗壮、菌落中间淡黄边缘白色；在ck培养基6号培养基、7号培养基上，菌丝生长较稠、边缘整齐、菌丝较粗壮、菌落淡黄色。从菌丝生长特性方面来看，桑黄菌丝在3、4、5号培养中生长最好。

表2 桑黄菌丝在不同培养基中的萌发时间及生长速度

由表2可知，4号培养基的标准误差小，说明变异小、均一性高。结合菌丝生长特性、菌丝生长速度、菌丝生长均一性综合分析可知，桑黄菌丝在4号培养基中萌发快，菌丝稠密、边缘整齐、粗壮、菌落淡黄色，且生长速度快、均一性高，为桑黄母种培养的最佳选择。

2、原种培养基配方研究：

2.1试验材料：

桑黄(I.sanghuang)母种。桑树废弃物为桑树枝丫及淘汰的桑树木材，粉碎过13mm筛，风干后备用；麦麸、石灰、石膏等购于当地直接使用。

2.2培养基：

以桑树木屑为主料，麦麸为辅料，石灰、石膏、葡萄糖等作为添加剂，设计8个配方进行原种培养基试验；其中配方6为申请号为201710201117.X的专利公开的原种培养基：80质量份小麦粒、19质量份桑树木屑、1质量份石膏粉和水；所述原种培养基的水分含量为50-55％。培养基7为申请号为CN201310558787.9的专利公开的原种培养基：桑木屑77％、麸皮15％、玉米粉15％、硫酸铵0.5％、糖1％、碳酸钙1％，另加0.5％的硫酸铵。原种培养基配方具体如下表3所示。

表3 原种培养基配方(质量百分比/％)

配方编号	杂木屑	桑树木屑	麦麸	石灰	石膏	硫酸镁	磷酸二氢钾
								ck	77.5		20	1	1	0.2	0.3
1		57.5	40	1	1	0.2	0.3
								2		67.5	30	1	1	0.2	0.3
3		77.5	20	1	1	0.2	0.3
								4		87.5	10	1	1	0.2	0.3
5		97.5	0	1	1	0.2	0.3
								3-1		72.5	25	1	1	0.2	0.3
3-2		82.5	15	1	1	0.2	0.3
								6	—	—	—	—	—	—	—
7	—	—	—	—	—	—	—

按上述培养基配方混合制成培养基。

2.3接种与培养：

培养基配制好后，挑取活化后的母种块接入配制好的原种培养基中，置24℃，避光培养。每隔12h观察1次菌丝的萌发情况，当菌丝萌发后每24h测量菌丝生长速度，最后观察并描述其菌落特征。桑黄菌丝在不同原种基中的生长情况如附图3、表4所示，桑黄在原种培养基的生长速度如附图2所示。

表4 桑黄菌丝在不同原种基中的生长情况

从表4、附图2、附图3可知，桑树木屑的培养基中生长的菌丝发黄，菌丝浓密，活力强；对照组培养基中的菌丝较稀疏、呈白色。麦麸含量高的培养基有利于菌丝的生长，在麦麸低于10％的培养基中桑黄菌丝长势较弱，缓慢。

本发明的有益效果在于：

1.本发明通过对母种培养基、原种培养基进行筛选试验，预制的培养基各营养成分均衡，为菌种生长提供保障，且其生长环境均一，有利于培育出质量稳定的桑黄菌种；解决了菌种在培养基中难以均匀分布及营养吸收不均匀的问题。

2.本发明在桑木屑进行开展了菌种生产，为桑树种植提供了菌种的适应性培养方法，便于菌种接种到桑树木材上快速适应生长并出菇。

3.本发明培育的桑黄菌种，质量稳定，生长速度快；接种到桑树木屑栽培料中大约45天左右开始形成原基，缩短了栽培周期；而且操作过程简单易行，便于控制，适于大规模培育桑黄菌种。

附图说明

图1为桑黄菌丝在不同母种培养基中的生长情况。

图2为桑黄菌丝在不同原种培养基中的生长速度的条形示意图。

图3为桑黄菌丝在不同原种培养基中的生长情况。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例1

一种优质桑黄菌种生产方法，包括以下步骤：

(1)母种培养：取从野生桑树上寄生的桑黄子实体分离所得Inonotus sanghuangSheng H.Wu,T.hatt&Y.C.Dai菌株，将菌株接种到对照培养基上活化，待菌落直径达到3～5cm时，再在平板上用打孔器打下直径为5mm的菌饼，接种到母种培养基上，25～26℃恒温避光培养7d，制得母种；

(2)原种培养：将母种结合到原种培养基上，每管母种接10袋左右，26℃避光培养20天，制得原种；

(3)栽培种培养：将原种接种到栽培种培养基上，每袋原种接栽培种50袋左右，26℃避光培养15天，制得优质菌种。

所述对照培养基，按重量份计，其原料组成为：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂粉10g、1000m水。

所述母种培养基，按重量份计，其原料组成为：桑树木屑100g、土豆100g、葡萄糖20g、琼脂粉10g、1000ml水。

所述母种培养基的制备方法为：先将木屑、土豆用沸水煮30min后，6层纱布过滤2次，添加其他配料混匀并用蒸馏水定容；分装到规格为20*200的试管中，121度、0.1Mpa下灭菌30min，取出排放成试管斜面培养基，冷却后即得母种培养基。

所述原种培养基，按重量百分比计，其原料组成为：桑树木屑77.5％、麦麸20％、石灰1％、石膏1％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾0.3％；原种培养基的水分为60％，pH自然。

所述栽培种培养基，按重量百分比计，其原料组成为：桑树木屑77.5％、麦麸20％、石灰1％、石膏1％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾0.3％；栽培种培养基的水分为60％，pH自然。

原种培养基、栽培种培养基的制备为：按上述配方将原料混合均匀后，分装到规格为14×28的聚丙烯折角菌袋中，在121度、0.1Mpa下灭菌120min，冷却后，即得原种培养基、栽培种培养基。

所述黄原种培养基、栽培种培养基中，桑树木屑是将桑树废弃物、桑树枝丫及淘汰的桑树木材粉碎过13mm筛，风干后制成。

将实施例1培育的优质桑黄菌种接种到桑树栽培料中，40天开始形成原基。

实施例2

一种优质桑黄菌种生产方法，包括以下步骤：

(1)母种培养：取从野生桑树上寄生的桑黄子实体分离所得Inonotus sanghuangSheng H.Wu,T.hatt&Y.C.Dai菌株，将菌株接种到对照培养基上活化，待菌落直径达到3～5cm时，再在平板上用打孔器打下直径为5mm的菌饼，接种到母种培养基上，25～26℃恒温避光培养8d，制得母种；

(2)原种培养：将母种结合到原种培养基上，每管母种接10袋左右，26℃避光培养22天，制得原种；

(3)栽培种培养：将原种接种到栽培种培养基上，每袋原种接栽培种50袋左右，26℃避光培养16天，制得优质菌种。

所述对照培养基，按重量份计，其原料组成为：土豆150g、葡萄糖25g、琼脂粉8g、800ml水。

所述母种培养基，按重量份计，其原料组成为桑树木屑80g、土豆120g、葡萄糖25g、琼脂粉8g、800ml水。

所述母种培养基的制备方法为：先将木屑、土豆用沸水煮30min后，6层纱布过滤2次，添加其他配料混匀并用蒸馏水定容；分装到规格为20*200的试管中，121度、0.1Mpa下灭菌30min，取出排放成试管斜面培养基，冷却后即得母种培养基。

所述原种培养基，按重量百分比计，其原料组成为：桑树木屑72.5％、麦麸25％、石灰1％、石膏1％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾0.3％；原种培养基的水分为70％，pH自然。

所述栽培种培养基，按重量百分比计，其原料组成为：桑树木屑72.5％、麦麸25％、石灰1％、石膏1％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾0.3％；栽培种培养基的水分为70％，pH自然。

原种培养基、栽培种培养基的制备为：按上述配方将原料混合均匀后，分装到规格为14×28的聚丙烯折角菌袋中，在121度、0.1Mpa下灭菌120min，冷却后，即得原种培养基、栽培种培养基。

所述黄原种培养基、栽培种培养基中，桑树木屑是将桑树废弃物、桑树枝丫及淘汰的桑树木材粉碎过13mm筛，风干后制成。

将实施例2培育的优质桑黄菌种接种到桑树栽培料中，43天开始形成原基。

实施例3

一种优质桑黄菌种生产方法，包括以下步骤：

(1)母种培养：取从野生桑树上寄生的桑黄子实体分离所得Inonotus sanghuangSheng H.Wu,T.hatt&Y.C.Dai菌株，将菌株接种到对照培养基上活化，待菌落直径达到3～5cm时，再在平板上用打孔器打下直径为5mm的菌饼，接种到母种培养基上，25～26℃恒温避光培养10d，制得母种；

(2)原种培养：将母种结合到原种培养基上，每管母种接10袋左右，26℃避光培养20天，制得原种；

(3)栽培种培养：将原种接种到栽培种培养基上，每袋原种接栽培种50袋左右，26℃避光培养16天，制得优质菌种。

所述对照培养基，按重量份计，其原料组成为：土豆250g、葡萄糖15g、琼脂粉12g、1200ml水。

所述母种培养基，按重量份计，其原料组成为桑树木屑120g、土豆80g、葡萄糖15g、琼脂粉12g、1200ml水。

所述母种培养基的制备方法为：先将木屑、土豆用沸水煮30min后，6层纱布过滤2次，添加其他配料混匀并用蒸馏水定容；分装到规格为20*200的试管中，121度、0.1Mpa下灭菌30min，取出排放成试管斜面培养基，冷却后即得母种培养基。

所述原种培养基，按重量百分比计，其原料组成为：桑树木屑82.5％、麦15％、石灰1％、石膏1％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾0.3％；原种培养基的水分为65％，pH自然。

所述栽培种培养基，按重量百分比计，其原料组成为：桑树木屑82.5％、麦15％、石灰1％、石膏1％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾0.3％；栽培种培养基的水分为65％，pH自然。

原种培养基、栽培种培养基的制备为：按上述配方将原料混合均匀后，分装到规格为14×28的聚丙烯折角菌袋中，在121度、0.1Mpa下灭菌120min，冷却后，即得原种培养基、栽培种培养基。

所述黄原种培养基、栽培种培养基中，桑树木屑是将桑树废弃物、桑树枝丫及淘汰的桑树木材粉碎过13mm筛，风干后制成。

将实施例3培育的优质桑黄菌种接种到桑树栽培料中，45天开始形成原基。

在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。

Claims (8)

1.一种优质桑黄菌种生产方法，其特征在于，括以下步骤：

(1)母种培养：将桑黄菌菌株接种到对照培养基上活化，待菌落直径达到3～5cm时，再在平板上用打孔器打下直径为5mm的菌饼，接种到母种培养基上，25～26℃恒温避光培养，制得母种；

(2)原种培养：将母种结合到原种培养基上，26℃避光培养，制得原种；

(3)栽培种培养：将原种接种到栽培种培养基上，26℃避光培养，制得优质菌种。

2.如权利要求1所述的优质桑黄菌种生产方法，其特征在于所述对照培养基，按重量份计，其原料组成为：土豆150-250份，葡萄糖15-25份、琼脂粉8-12份、800-1200份水。

3.如权利要求1所述的优质桑黄菌种生产方法，其特征在于，所述母种培养基，按重量份计，其原料组成为：桑树木屑80-120份、土豆80-120份、葡萄糖15-25份、琼脂粉8-12份、800-1200份水。

4.如权利要求3所述的优质桑黄菌种生产方法，其特征在于，所述母种培养基，按重量份计，其原料组成为桑树木屑100份、土豆100份、葡萄糖20份、琼脂粉10份、1000份水。

5.如权利要求1所述的优质桑黄菌种生产方法，其特征在于，所述母种培养基的制备方法为：先将木屑、土豆用沸水煮30min后，6层纱布过滤2次，添加其他配料混匀并用蒸馏水定容；分装到规格为20*200的试管中，在121度、0.1Mpa下灭菌30min，取出排放成试管斜面培养基，冷却后即得母种培养基。

6.如权利要求1所述的优质桑黄菌种生产方法，其特征在于，所述原种培养基、栽培种培养基，按重量百分比计，其原料组成为：桑树木屑72.5-82.5％、麦麸15-25％、石灰1％、石膏1％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾0.3％；培养基的水分为60-70％，pH自然。

7.如权利要求6所述的优质桑黄菌种生产方法，其特征在于，所述原种培养基、栽培种培养基，按重量百分比计，其原料组成为：桑树木屑77.5％、麦麸20％、石灰1％、石膏1％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾0.3％；培养基的水分为60％，pH自然。

8.如权利要求1-7任一项所述的优质桑黄菌种生产方法，其特征在于，所述桑黄菌种为桑黄Inonotus sanghuangSheng H.Wu,T.hatt&Y.C.Dai菌种。

Images