CN105028204A - 脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法 - Google Patents

Abstract

<b>本发明涉及抗早疫病材料筛选方法技术领域，是一种脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法；按下述步骤进行：第一步，病原菌的分离；第二步，病原菌的纯化；第三步，孢子囊悬浊液的制备；第四步，接种。本发明脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法较传统筛选方法误差小、筛选时间短和筛选成本低；同时</b><b>本发明</b><b>脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法</b><b>弥补了新疆地区在马铃薯早疫病研究及防治方面的空白，建立了一套适合新疆地区马铃薯抗早疫病试管苗的筛选方法，大大提高了早疫病鉴定的及时性、有效性及准确性，在快速鉴定及防治疫病方面具有重要意义。</b>

Description

脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法

技术领域

本发明涉及抗早疫病材料筛选方法技术领域，是一种脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法。

背景技术

马铃薯是茄科茄属的一年生草本块茎植物，是重要的粮食、蔬菜兼用作物。由茄链格孢菌侵染引起的马铃薯早疫病是马铃薯生产中严重的病害，在马铃薯各产区均有发生，并逐年加重趋势。尤其在发展中国家被认为是仅次于马铃薯晚疫病的第二大马铃薯病害。生产上对马铃薯晚疫病、病毒病的抗病性评价较多，而对早疫病研究较少。且现有早疫病的评价方法存在偏差大、检测时间长和成本高，不适宜脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的评价。

发明内容

本发明提供了一种脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有早疫病的评价方法存在偏差大、检测时间长和成本高，不适宜脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的评价的问题。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，按下述步骤进行：第一步，病原菌的分离，采集不同地区大田内的马铃薯早疫病病叶，将马铃薯早疫病病叶采集后经自来水冲洗1次至3次，冲洗后放入乙醇水溶液中浸泡20s至30s，浸泡后再放入升汞水溶液中浸泡10s至20s，用无菌水冲洗3遍至5遍，后用灭菌解剖刀取出病健交界的叶片，将病健交界的叶片背面朝上置于PDA平板培养基上，每皿放入3片至4片叶片，置于25℃的培养箱中黑暗培养3d至5d，培养后将叶片上的病原菌分离得到病原菌；

第二步，病原菌的纯化，将分离后的病原菌置于25℃的培养箱中黑暗培养2d至3d，挑选直径为1cm至2cm的菌落镜检，确认目标菌落A，在目标菌落A的边缘挑取一小块带有菌丝的培养基再移接于PDA培养基上进行纯化，直至菌落生长整齐一致无杂菌出现为止，即得到纯化后的病原菌；

第三步，孢子囊悬浊液的制备，在无菌条件下，将纯化后的病原菌接种至PDA平板培养基上常温保存，在光照下培养14d后生成孢子囊，在无菌条件下向PDA平板培养基上注入无菌蒸馏水冲洗过滤，过滤后收集孢子囊悬浊液，镜检并稀释到6个孢子囊/100倍视野后得到孢子囊悬浊液；

第四步，接种，待不同品种的马铃薯脱毒试管苗长至7叶至8叶期时，挑选不同品种的马铃薯脱毒试管苗，每个品种分为处理组与对照组两组，处理组随机挑选60株至100株马铃薯脱毒试管苗，对照组随机挑选60株至100株马铃薯脱毒试管苗，处理组在无菌环境下用移液枪吸取10ul孢子囊悬浊液接种在脱毒试管苗底部距培养基1cm至2cm的根茎处，对照组以接种10ul无菌水作为对照；接种后处理组和对照组马铃薯脱毒试管苗均置于光照为2000lx至3000lx、温度为20℃至25℃的条件下观察培养；待接种15d至20d后，当接种后的马铃薯脱毒试管苗均表现为抗病时为具有抗早疫病的脱毒马铃薯试管苗。

下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：

上述PDA培养基按下述方法得到：称取200g新鲜马铃薯，洗净去皮切片，加去离子水1000mL煮沸15min，纱布过滤后加去离子水补足至1000mL，再加12g葡萄糖和10g至12g琼脂粉，煮沸待琼脂粉完全熔化后得到PDA培养基。

上述病健交界的叶片大小为0.5cm ² 至1cm ² 。

上述乙醇水溶液为体积百分比为75%的乙醇水溶液。

上述升汞水溶液为质量百分比为0.1%的升汞水溶液。

本发明脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法较传统筛选方法误差小、筛选时间短和筛选成本低；同时本发明脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法弥补了新疆地区在马铃薯早疫病研究及防治方面的空白，建立了一套适合新疆地区马铃薯抗早疫病试管苗的筛选方法，大大提高了早疫病鉴定的及时性、有效性及准确性，在快速鉴定及防治疫病方面具有重要意义。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。

实施例1，该脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，按下述步骤进行：第一步，病原菌的分离，采集不同地区大田内的马铃薯早疫病病叶，将马铃薯早疫病病叶采集后经自来水冲洗1次至3次，冲洗后放入乙醇水溶液中浸泡20s至30s，浸泡后再放入升汞水溶液中浸泡10s至20s，用无菌水冲洗3遍至5遍，后用灭菌解剖刀取出病健交界的叶片，将病健交界的叶片背面朝上置于PDA平板培养基上，每皿放入3片至4片叶片，置于25℃的培养箱中黑暗培养3d至5d，培养后将叶片上的病原菌分离得到病原菌；

第二步，病原菌的纯化，将分离后的病原菌置于25℃的培养箱中黑暗培养2d至3d，挑选直径为1cm至2cm的菌落镜检，确认目标菌落A，在目标菌落A的边缘挑取一小块带有菌丝的培养基再移接于PDA培养基上进行纯化，直至菌落生长整齐一致无杂菌出现为止，即得到纯化后的病原菌；

第三步，孢子囊悬浊液的制备，在无菌条件下，将纯化后的病原菌接种至PDA平板培养基上常温保存，在光照下培养14d后生成孢子囊，在无菌条件下向PDA平板培养基上注入无菌蒸馏水冲洗过滤，过滤后收集孢子囊悬浊液，镜检并稀释到6个孢子囊/100倍视野后得到孢子囊悬浊液；

第四步，接种，待不同品种的马铃薯脱毒试管苗长至7叶至8叶期时，挑选不同品种的马铃薯脱毒试管苗，每个品种分为处理组与对照组两组，处理组随机挑选60株至100株马铃薯脱毒试管苗，对照组随机挑选60株至100株马铃薯脱毒试管苗，处理组在无菌环境下用移液枪吸取10ul孢子囊悬浊液接种在脱毒试管苗底部距培养基1cm至2cm的根茎处，对照组以接种10ul无菌水作为对照；接种后处理组和对照组马铃薯脱毒试管苗均置于光照为2000lx至3000lx、温度为20℃至25℃的条件下观察培养；待接种15d至20d后，当接种后的马铃薯脱毒试管苗均表现为抗病时为具有抗早疫病的脱毒马铃薯试管苗。接种时不接触马铃薯脱毒试管苗的底部培养基。第一步中，采集不同地区大田内的马铃薯早疫病病叶时，可将采集到的马铃薯早疫病病叶装于密封袋中，做好标记并放入冰盒中，回到实验室后立即将马铃薯早疫病病叶放入4℃冷藏冰箱中低温保险，以确保样品中早疫病菌的活性。用自来水冲洗20-30分钟后，再用无菌水冲洗3遍至5遍后放置在干净的滤纸上吸去多余水分，后用灭菌解剖刀取出病健交界的叶片。

第一步中，对得到的病原菌进行鉴定，将分离后的病原菌置于PDA培养基上在18℃条件下恒温培养，观察并记录各菌株的菌落形状、色泽、和生长速度；在显微镜下观测菌丝的形态，并观察是否具有孢子囊及其形态、大小，并进行照相；参考《真菌鉴定手册》，对所得菌株进行形态学鉴定，确保得到接种所需菌株。

第四步中，也可通过以下方法进行接种，选择不同品种苗龄为25d至30d的脱毒试管苗，扦插至营养钵中，每个品种扦插10个营养钵，每个营养钵内扦插3株至4株脱毒试管苗，按照不同品种依次编号，每个品种分为处理组与对照组，待脱毒试管苗长至20cm至22cm时进行接种，在脱毒试管苗底端距离基质4cm至8cm处，处理组用灭菌解剖刀横向切开表皮组织，切口呈“一字型”，用无菌注射器向切口内缓缓注入孢子囊悬浊液（注意：此操作未使用注射针头），而对照组操作步骤处理组相同，但接种注射时使用液体为蒸馏水，接种完毕后将营养钵置于防虫网室内观察培养。

实施例2，作为上述实施例的优化，PDA培养基按下述方法得到：称取200g新鲜马铃薯，洗净去皮切片，加去离子水1000mL煮沸15min，纱布过滤后加去离子水补足至1000mL，再加12g葡萄糖和10g至12g琼脂粉，煮沸待琼脂粉完全熔化后得到PDA培养基。煮沸待琼脂粉完全熔化后分装；分装后的PDA培养基应在1h内灭菌，采用高压蒸汽湿热灭菌，在0.1MPa蒸汽压下，温度达121℃，维持20min。

　　分装方法：A．三角瓶（锥形瓶）分装；采用250mL容积的三角瓶分装，每瓶分装约200mL培养基，瓶口覆透气灭菌封口膜，以棉线扎紧。

　　B．试管分装；试管分装制作斜面培养基，主要用于菌种的转接和保存。取20mL的干净试管，加入培养基约5mL（1/4试管高度），试管口用脱脂棉制作的棉花塞塞口，7根试管为一组，管口部分用报纸包裹，棉线扎紧。灭菌后应趁热取出，斜放在桌面制成斜面。

注意：试管分装时尽量避免培养基粘粘在管口部分，否则培养基可能粘住棉花塞，影响后续试验操作。

C．平板培养基分装；将培养皿洗净、干燥，使各培养皿盖方向一致，用牛皮纸包好，或放入特制铁罐内，注明皿盖的方向。高压灭菌或干燥灭菌后备用。取刚灭菌后尚未凝固的培养基置于无菌箱或超净工作台内，略打开灭菌过的培养皿盖(露一小缝)，倒入15ml至20mlPDA培养基(厚度为0.5cm)，封盖、冷凝，倒置备用。

实施例3，作为上述实施例的优化，病健交界的叶片大小为0.5cm ² 至1cm ² 。

实施例4，作为上述实施例的优化，乙醇水溶液为体积百分比为75%的乙醇水溶液。

实施例5，作为上述实施例的优化，升汞水溶液为质量百分比为0.1%的升汞水溶液。

本发明上述实施例接种后的马铃薯脱毒试管苗的验证试验：

调查分级标准

根据实际调查疫病发生情况，并计算病情指数和发病率，并记载病株显症叶片数、病叶颜色、叶片是否脱落、卷枯等，分级标准参照中华人民共和国农业部1999-01-25批准的标准。

1.采用茎部病情分级及反应型划分标准见表1所示。

2.采用病情指数（DI）判断品种是否具有抗病性。

病情指数(DI)=[∑(病级数×该病级植株数)×100]/(病级最高值×调查株数)

病情指数与抗病性的关系：免疫（I）：DI=0；高抗（HR）：0＜DI≤10；抗病（R）：10＜DI≤30；中抗（MR）：30＜DI≤50；感病（S）：DI>50。

3.结果分析

接种后不同品种的马铃薯脱毒试管苗对马铃薯早疫病的抗性表现不一；所有接种无菌水的对照组（CK）在接种点处无任何变化，马铃薯脱毒试管苗生长正常；各试验品种的马铃薯脱毒试管苗对早疫病的抗病程度见表2所示；从表2可以看出，在接种第5天后，台湾红、紫花白、大西洋、费乌瑞它4个品种的马铃薯脱毒试管苗表现为中抗（MR），下寨65品种的马铃薯脱毒试管苗表现为感病（S），夏波蒂品种的马铃薯脱毒试管苗表现为抗病（R）；在接种第11天后，紫花白和大西洋品种的马铃薯脱毒试管苗表现为中抗（MR），台湾红、下寨65和费乌瑞它品种的马铃薯脱毒试管苗表现为感病（S），夏波蒂品种的马铃薯脱毒试管苗表现为抗病（R）；在接种第15天后除了夏波蒂品种的马铃薯脱毒试管苗表现为抗病（R），其余品种品种的马铃薯脱毒试管苗均表现为感病（S）；由此可见，夏波蒂品种的马铃薯脱毒试管苗对抗早疫病方面明显优于其他品种，具有较强的抗性，适宜在新疆地区大面积推广种植。

本发明筛选所用时间平均为45天，筛选出来的马铃薯脱毒试管苗与大田试验结果基本相符，而传统筛选方法所用时间平均为5-6个月，且本发明较传统筛选方法的成本平均节约了80%；说明本发明脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法较传统筛选方法误差小、筛选时间短和筛选成本低；同时本发明脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法弥补了新疆地区在马铃薯早疫病研究及防治方面的空白，建立了一套适合新疆地区马铃薯抗早疫病试管苗的筛选方法，大大提高了早疫病鉴定的及时性、有效性及准确性，在快速鉴定及防治疫病方面具有重要意义。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

表1

发病等级	发病情况
		0级	无任何症状
1级	幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；
		2级	幼苗根茎部变黑达1～2 cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；
3级	幼苗根茎部变黑超过1～2 cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；
		4级	幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；
5级	植株枯死

表2

品种

第3天

第5天

第7天

第9天

第11天

第13天

第15天

第17天

台湾红

MR

MR

MR

S

S

S

S

S

紫花白

MR

MR

MR

MR

MR

S

S

S

下寨65

S

S

S

S

S

S

S

S

大西洋

R

MR

MR

S

S

S

S

S

夏波蒂

R

R

R

R

R

MR

MR

MR

费乌瑞它

MR

MR

MR

S

S

S

S

S

对照（CK）

I

I

I

I

I

I

I

I

Claims (9)

1.一种脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，病原菌的分离，采集不同地区大田内的马铃薯早疫病病叶，将马铃薯早疫病病叶采集后经自来水冲洗1次至3次，冲洗后放入乙醇水溶液中浸泡20s至30s，浸泡后再放入升汞水溶液中浸泡10s至20s，用无菌水冲洗3遍至5遍，后用灭菌解剖刀取出病健交界的叶片，将病健交界的叶片背面朝上置于PDA平板培养基上，每皿放入3片至4片叶片，置于25℃的培养箱中黑暗培养3d至5d，培养后将叶片上的病原菌分离得到病原菌；

第二步，病原菌的纯化，将分离后的病原菌置于25℃的培养箱中黑暗培养2d至3d，挑选直径为1cm至2cm的菌落镜检，确认目标菌落A，在目标菌落A的边缘挑取一小块带有菌丝的培养基再移接于PDA培养基上进行纯化，直至菌落生长整齐一致无杂菌出现为止，即得到纯化后的病原菌；

第三步，孢子囊悬浊液的制备，在无菌条件下，将纯化后的病原菌接种至PDA平板培养基上常温保存，在光照下培养14d后生成孢子囊，在无菌条件下向PDA平板培养基上注入无菌蒸馏水冲洗过滤，过滤后收集孢子囊悬浊液，镜检并稀释到6个孢子囊/100倍视野后得到孢子囊悬浊液；

第四步，接种，待不同品种的马铃薯脱毒试管苗长至7叶至8叶期时，挑选不同品种的马铃薯脱毒试管苗，每个品种分为处理组与对照组两组，处理组随机挑选60株至100株马铃薯脱毒试管苗，对照组随机挑选60株至100株马铃薯脱毒试管苗，处理组在无菌环境下用移液枪吸取10ul孢子囊悬浊液接种在脱毒试管苗底部距培养基1cm至2cm的根茎处，对照组以接种10ul无菌水作为对照；接种后处理组和对照组马铃薯脱毒试管苗均置于光照为2000lx至3000lx、温度为20℃至25℃的条件下观察培养；待接种15d至20d后，当接种后的马铃薯脱毒试管苗均表现为抗病时为具有抗早疫病的脱毒马铃薯试管苗。

2.根据权利要求1所述的脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，其特征在于PDA培养基按下述方法得到：称取200g新鲜马铃薯，洗净去皮切片，加去离子水1000mL煮沸15min，纱布过滤后加去离子水补足至1000mL，再加12g葡萄糖和10g至12g琼脂粉，煮沸待琼脂粉完全熔化后得到PDA培养基。

3.根据权利要求1或2所述的脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，其特征在于病健交界的叶片大小为0.5cm²至1cm²。

4.根据权利要求1或2所述的脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，其特征在于乙醇水溶液为体积百分比为75%的乙醇水溶液。

5.根据权利要求3所述的脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，其特征在于乙醇水溶液为体积百分比为75%的乙醇水溶液。

6.根据权利要求1或2所述的脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，其特征在于升汞水溶液为质量百分比为0.1%的升汞水溶液。

7.根据权利要求3所述的脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，其特征在于升汞水溶液为质量百分比为0.1%的升汞水溶液。

8.根据权利要求4所述的脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，其特征在于升汞水溶液为质量百分比为0.1%的升汞水溶液。

9.根据权利要求5所述的脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，其特征在于升汞水溶液为质量百分比为0.1%的升汞水溶液。