CN115039588A - 马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法，属于农作物病虫害抗性鉴定技术领域，包括采集马铃薯黑痣病病样、分离黑痣病菌、马铃薯扦插苗的处理与病原菌接种、调查项目及判定标准。本发明马铃薯扦插苗为统一脱毒处理，使各品种不带任何病毒水平，统一接种病菌，更能反映各品种的真实抗性水平，该方法提高鉴定的准确性，有效提高鉴定效率，满足不同抗病需求。

Description

马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法

技术领域

本发明涉及农作物病虫害抗性鉴定技术领域，具体涉及马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法。

背景技术

马铃薯是茄科茄属的一年生草本块茎植物，是重要的粮食、蔬菜兼用作物。马铃薯是继玉米、小麦、水稻之后的世界第四大粮食作物，在保障国家粮食安全和促进农民持续增收等方面，起着重要的作用。马铃薯黑痣病是由立枯丝核菌侵染引起的病害，是马铃薯生产中严重的病害，在马铃薯各产区均有发生，并逐年加重趋势。选用抗病品种是防治马铃薯黑痣病最经济、最有效的措施，但需有效的抗性鉴定技术对种质资源进行准确评价，而对马铃薯扦插苗品种抗黑痣病的鉴定方法还尚未有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法，包括以下步骤：

采集马铃薯黑痣病病样，分离黑痣病菌，得到立枯丝核菌；

采用茎尖剥离脱毒技术获得脱毒后的马铃薯试管苗，在PDA培养基培养，剪去根部后直接扦插至灭菌基质中，马铃薯扦插苗长至7～8叶期时，在马铃薯扦插苗根茎处接种75～85μL的1×10⁵～1×10⁶个/mL立枯丝核菌菌悬液；

接种后每天调查一次黑痣病发生情况根据马铃薯扦插苗病株显症叶片数、病叶颜色、叶片是否脱落、卷枯计算病情指数，马铃薯扦插苗的黑痣病的抗性水平按照病情指数与抗病性关系评价标准确定：

免疫：病情指数＝0；

高抗：0＜病情指数≤10；

抗病：10＜病情指数≤30；

中抗：30＜病情指数≤50；

感病：病情指数>50。

优选地，分离黑痣病菌的方法包括以下步骤：

从马铃薯中选取带有黑痣病菌核的块茎，分别在乙醇溶液、升汞中浸泡，用灭菌水冲洗，用滤纸吸去表面水分，于PDA培养基中培养，待菌丝长满后，挑取菌丝在PDA培养基上纯化培养，镜检确立为立枯丝核菌后备用。

优选地，在PDA培养基中培养时间为18～22天。

优选地，所述基质包括蛭石、草炭和珍珠岩，其中蛭石：草炭：珍珠岩的质量比为(1.0～2.0):(0.5～1.5):(0.5～1.5)。

优选地，所述立枯丝核菌菌悬液制备，包括如下步骤：

在22～27℃下，将立枯丝核菌在PDA培养基中培养5～8天，然后在培养基上注入无菌蒸馏水后过滤，收集立枯丝核菌悬浊液。

优选地，所述病情指数的计算公式为：

病情指数＝[∑(病级数×该病级植株数)×100]/(病级最高值×调查株数)。

优选地，所述乙醇溶液的体积分数为70～80％。

优选地，所述浸泡的时间为25～35s。

优选地，在PDA培养基中培养的温度22～27℃，培养3～5天。

优选地，分级标准采用茎部病情分级及反应型划分标准：

0级：无任何症状；

1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；

2级：幼苗根茎部变黑达1～2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；

3级：幼苗根茎部变黑超过1～2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；

4级：幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；

5级：植株枯死。

本发明的有益效果如下：

本发明的马铃薯扦插苗的抗黑痣病鉴定方法，是一种适应新疆地区的马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法，本发明马铃薯扦插苗为统一脱毒处理，使各品种不带任何病毒水平，统一接种病菌，更能反映各品种的真实抗性水平，该方法提高鉴定的准确性，有效提高鉴定效率，满足不同抗病需求。

具体实施方式

本发明提供了一种马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法，包括以下步骤：

采集马铃薯黑痣病病样，分离黑痣病菌，得到立枯丝核菌；

采用茎尖剥离脱毒技术获得脱毒后的马铃薯试管苗，在PDA培养基培养，剪去根部后直接扦插至灭菌基质中，马铃薯扦插苗长至7～8叶期时，在马铃薯扦插苗根茎处接种75～85μL的1×10⁵～1×10⁶个/mL立枯丝核菌菌悬液；

接种后每天调查一次黑痣病发生情况根据马铃薯扦插苗病株显症叶片数、病叶颜色、叶片是否脱落、卷枯计算病情指数，马铃薯扦插苗的黑痣病的抗性水平按照病情指数与抗病性关系评价标准确定：

免疫：病情指数＝0；

高抗：0＜病情指数≤10；

抗病：10＜病情指数≤30；

中抗：30＜病情指数≤50；

感病：病情指数>50。

在本发明中，采集马铃薯黑痣病病样。采集马铃薯黑痣病病样，装于密封袋中，做好标记并放入冰盒中，回到实验室后立即放入4℃冷藏冰箱中保存，备用。

在本发明中，从马铃薯黑痣病病样中分离黑痣病菌，得到立枯丝核菌。所述分离黑痣病的方法优选地包括以下步骤：从马铃薯中选取带有黑痣病菌核的块茎，分别在乙醇溶液、升汞中浸泡，用灭菌水冲洗，用滤纸吸去表面水分，于PDA培养基中培养，待菌丝长满后，挑取菌丝在PDA培养基上纯化培养，镜检确立为立枯丝核菌后备用。在本发明中，从马铃薯中选取带有黑痣病菌核的块茎后，分别在乙醇溶液、升汞中浸泡，作为一优选的实施方式，带有黑痣病菌核的块茎在70～80％的乙醇溶液中浸泡25～35s，然后再在0.1％升汞中浸泡25～35s，从而达到杀菌消毒的目的。在本发明中，带有黑痣病菌核的块茎分别在乙醇溶液、升汞中浸泡后，用灭菌水冲洗，所述冲洗次数优选为2～4次，以洗去块茎表面污物、杂菌等。本发明中，用滤纸吸去病叶上的水，以达到清除杂菌目的。在本发明中，用滤纸吸去表面水分后，于PDA培养基中培养；作为一优选的实施方式，在PDA培养基中培养的温度22～27℃，培养3～5天，保证每个培养皿上放2～3块。在本发明中，待菌丝长满后，挑取菌丝在PDA培养基上纯化培养，镜检确立为立枯丝核菌后备用；作为一优选的实施方式，在PDA培养基中培养的温度22～27℃，培养3～5天，培养纯化的次数为3次，于4℃保存。

在本发明中，采用茎尖剥离脱毒技术获得脱毒后的马铃薯试管苗，在PDA培养基培养，剪去根部后直接扦插至灭菌基质中，马铃薯扦插苗长至7～8叶期。在PDA培养基中培养时间优选为18～22天，进一步优选为19～21天。所述基质优选地包括蛭石、草炭和珍珠岩，其中蛭石：草炭：珍珠岩的质量比优选为(1.0～2.0):(0.5～1.5):(0.5～1.5)。本发明马铃薯扦插苗为统一脱毒处理，使各品种不带任何病毒水平，统一接种病菌，更能反映各品种的真实抗性水平，使用脱毒后的扦插苗直接接种简单高效易操作。本发明对PDA培养基来源没有特殊限定，采用本领域公知的PDA培养基即可。

在本发明中，马铃薯扦插苗长至7～8叶期时，在马铃薯扦插苗根茎处接种75～85μL的1×10⁵～1×10⁶个/mL立枯丝核菌菌悬液。本发明采用盖膜保温保湿方式使马铃薯扦插苗长至7～8叶期时，所述温度优选为22～25℃，所述湿度优选为80～85％。所述所述立枯丝核菌菌悬液制备，优选地包括如下步骤：在22～27℃下，将立枯丝核菌在PDA培养基中培养5～8天，然后在培养基上注入无菌蒸馏水后过滤，收集立枯丝核菌悬浊液。在本发明中，将立枯丝核菌在PDA培养基中培养5～8天，能够保证孢子囊的产生。本发明采用上述方式更符合田间自然条件，避免田间自然条件对抗性鉴定结果的影响。

在本发明中，所述病情指数的计算公式优选为：病情指数＝[∑(病级数×该病级植株数)×100]/(病级最高值×调查株数)。作为一优选的实施方式，分级标准采用茎部病情分级及反应型划分标准：

0级：无任何症状；

1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；

2级：幼苗根茎部变黑达1～2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；

3级：幼苗根茎部变黑超过1～2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；

4级：幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；

5级：植株枯死。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法，步骤如下：

采集马铃薯黑痣病病样：将采集的马铃薯黑痣病病样装于密封袋中，做好标记并放入冰盒中，回到实验室后立即放入4℃冷藏冰箱中保存，待用。

黑痣病菌分离与鉴定：从马铃薯中选取带有黑痣病菌核的块茎，在75％乙醇溶液中浸泡30s，然后再在0.1％升汞中浸泡30s，用灭菌水冲洗3次，用滤纸吸去带有黑痣病菌核的块茎表面上的水，每皿3块，在PDA培养基上25℃培养4天，挑取菌丝，置于PDA培养基上，25℃纯化培养4天，重复上述纯化培养3次，镜检，即得立枯丝核菌；

马铃薯扦插苗的处理与病原菌接种：采用茎尖剥离脱毒技术获得脱毒后的马铃薯试管苗，在PDA培养基培养20天，剪去根部后直接扦插至灭菌基质中，采用盖膜在24℃下，82％湿度下，待马铃薯扦插苗长至7～8叶期时，在马铃薯扦插苗根茎处接种80μL的5×10⁵个/mL立枯丝核菌菌悬液。

其中，基质将质量比为1.5:1:1的蛭石：草炭：珍珠岩，混合得到；其中，所述立枯丝核菌菌悬液制备方法：在25℃下，将立枯丝核菌在PDA培养基中培养6天，然后在培养基上注入无菌蒸馏水后过滤，收集立枯丝核菌悬浊液；

接种后每天调查一次黑痣病发生情况根据马铃薯扦插苗病株显症叶片数、病叶颜色、叶片是否脱落、卷枯计算病情指数，马铃薯扦插苗的黑痣病的抗性水平按照病情指数与抗病性关系评价标准确定：

免疫：病情指数＝0；

高抗：0＜病情指数≤10；

抗病：10＜病情指数≤30；

中抗：30＜病情指数≤50；

感病：病情指数>50；

其中，病情指数＝[∑(病级数×该病级植株数)×100]/(病级最高值×调查株数)；

分级标准采用茎部病情分级及反应型划分标准：

0级：无任何症状；

1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；

2级：幼苗根茎部变黑达1～2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；

3级：幼苗根茎部变黑超过1～2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；

4级：幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；

5级：植株枯死。

实施例2

一种马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法，步骤如下：

采集马铃薯黑痣病病样：将采集的马铃薯黑痣病病样装于密封袋中，做好标记并放入冰盒中，回到实验室后立即放入4℃冷藏冰箱中保存，待用。

黑痣病菌分离与鉴定：从马铃薯中选取带有黑痣病菌核的块茎，在70％乙醇溶液中浸泡35s，然后再在0.1％升汞中浸泡25s，用灭菌水冲洗2次，用滤纸吸去带有黑痣病菌核的块茎表面上的水，每皿2块，22℃培养5天，挑取菌丝，置于PDA培养基上，22℃纯化培养5天，重复上述纯化培养3次，镜检，即得立枯丝核菌；

马铃薯扦插苗的处理与病原菌接种：采用茎尖剥离脱毒技术获得脱毒后的马铃薯试管苗，在PDA培养基培养18天，剪去根部后直接扦插至灭菌基质中，采用盖膜在22℃下，80％湿度下，马铃薯扦插苗长至7～8叶期时，在马铃薯扦插苗根茎处接种75μL的1×10⁶个/mL立枯丝核菌菌悬液；

其中，基质将质量比为1.0:0.5:0.5的蛭石：草炭：珍珠岩，混合得到；其中，所述立枯丝核菌菌悬液制备方法：在22℃下，将立枯丝核菌在PDA培养基中培养5天，然后在培养基上注入无菌蒸馏水后过滤，收集立枯丝核菌悬浊液；

接种后每天调查一次黑痣病发生情况，根据马铃薯扦插苗病株显症叶片数、病叶颜色、叶片是否脱落、卷枯计算病情指数，马铃薯扦插苗的黑痣病的抗性水平按照病情指数与抗病性关系评价标准确定：

免疫：病情指数＝0；

高抗：0＜病情指数≤10；

抗病：10＜病情指数≤30；

中抗：30＜病情指数≤50；

感病：病情指数>50；

其中，病情指数＝[∑(病级数×该病级植株数)×100]/(病级最高值×调查株数)；

分级标准采用茎部病情分级及反应型划分标准：

0级：无任何症状；

1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；

2级：幼苗根茎部变黑达1～2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；

3级：幼苗根茎部变黑超过1～2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；

4级：幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；

5级：植株枯死。

实施例3

一种马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法，步骤如下：

采集马铃薯黑痣病病样：将采集的马铃薯黑痣病病样装于密封袋中，做好标记并放入冰盒中，回到实验室后立即放入4℃冷藏冰箱中保存，待用。

黑痣病菌分离与鉴定：从马铃薯中选取带有黑痣病菌核的块茎，在80％乙醇溶液中浸泡25s，然后再在0.1％升汞中浸泡35s，用灭菌水冲洗4次，用滤纸吸去带有黑痣病菌核的块茎表面上的水，每皿3块，27℃培养3天，挑取菌丝，置于PDA培养基上，27℃纯化培养3天，重复上述纯化培养3次，镜检，即得立枯丝核菌；

马铃薯扦插苗的处理与病原菌接种：采用茎尖剥离脱毒技术获得脱毒后的马铃薯试管苗，在PDA培养基培养22天，剪去根部后直接扦插至灭菌基质中，采用盖膜在25℃下，85％湿度下，马铃薯扦插苗长至7～8叶期时，在马铃薯扦插苗根茎处接种85μL的1×10⁵个/mL立枯丝核菌菌悬液；

其中，基质将质量比为2.0:1.5:1.5的蛭石：草炭：珍珠岩，混合得到；其中，所述立枯丝核菌菌悬液制备方法：在27℃下，将立枯丝核菌在PDA培养基中培养8天，然后在培养基上注入无菌蒸馏水后过滤，收集立枯丝核菌悬浊液；

接种后每天调查一次黑痣病发生情况，根据马铃薯扦插苗病株显症叶片数、病叶颜色、叶片是否脱落、卷枯计算病情指数，马铃薯扦插苗的黑痣病的抗性水平按照病情指数与抗病性关系评价标准确定：

免疫：病情指数＝0；

高抗：0＜病情指数≤10；

抗病：10＜病情指数≤30；

中抗：30＜病情指数≤50；

感病：病情指数>50；

其中，病情指数＝[∑(病级数×该病级植株数)×100]/(病级最高值×调查株数)。

分级标准采用茎部病情分级及反应型划分标准：

0级：无任何症状；

1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；

2级：幼苗根茎部变黑达1～2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；

3级：幼苗根茎部变黑超过1～2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；

4级：幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；

5级：植株枯死。

试验例1

按照实施例1的方式，分别对R5、BL1、T9、T10、A1、T5马铃薯扦插苗品种的抗黑痣病的抗病程度进行鉴定，接种立枯丝核菌悬浊液4天、8天和12天后各品种对黑痣病的抗病程度的结果见表1。

表1不同品种对黑痣病的抗病程度

通过每天调查发现，接种第2天各品种对马铃薯黑痣病的抗性表现不一，所有接种无菌水的对照在接种点处无任何变化，扦插苗生长正常。

由表1结果表明，在接种第4天后，R5、T10、A1、T5表现为中抗(MR)，T9表现为感病(S)，BL1表现为抗病(R)。在接种第8天后，T5、T10表现为中抗(MR)，A1、T9、R5表现为感病(S)，BL1表现为抗病(R)。在接种第12天除了BL1表现为抗病(R)，其余品种均表现为感病(S)。由此可见，BL1明显优于其他品种，具有较强的抗性。本发明的鉴定方法，12天内即可判定抗黑痣病品种。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种马铃薯扦插苗抗黑痣病鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

采集马铃薯黑痣病病样，分离黑痣病菌，得到立枯丝核菌；

采用茎尖剥离脱毒技术获得脱毒后的马铃薯试管苗，在PDA培养基培养，剪去根部后直接扦插至灭菌基质中，马铃薯扦插苗长至7～8叶期时，在马铃薯扦插苗根茎处接种75～85μL的1×10⁵～1×10⁶个/mL立枯丝核菌菌悬液；

接种后每天调查一次黑痣病发生情况根据马铃薯扦插苗病株显症叶片数、病叶颜色、叶片是否脱落、卷枯计算病情指数，马铃薯扦插苗的黑痣病的抗性水平按照病情指数与抗病性关系评价标准确定：

免疫：病情指数＝0；

高抗：0＜病情指数≤10；

抗病：10＜病情指数≤30；

中抗：30＜病情指数≤50；

感病：病情指数>50。

2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，分离黑痣病菌的方法包括以下步骤：

从马铃薯中选取带有黑痣病菌核的块茎，分别在乙醇溶液、升汞中浸泡，用灭菌水冲洗，用滤纸吸去表面水分，于PDA培养基中培养，待菌丝长满后，挑取菌丝在PDA培养基上纯化培养，镜检确立为立枯丝核菌后备用。

3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，在PDA培养基中培养时间为18～22天。

4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述基质包括蛭石、草炭和珍珠岩，其中蛭石：草炭：珍珠岩的质量比为(1.0～2.0):(0.5～1.5):(0.5～1.5)。

5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述立枯丝核菌菌悬液制备，包括如下步骤：

在22～27℃下，将立枯丝核菌在PDA培养基中培养5～8天，然后在培养基上注入无菌蒸馏水后过滤，收集立枯丝核菌悬浊液。

6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述病情指数的计算公式为：

病情指数＝[∑(病级数×该病级植株数)×100]/(病级最高值×调查株数)。

7.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述乙醇溶液的体积分数为70～80％。

8.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述浸泡的时间为25～35s。

9.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，在PDA培养基中培养的温度22～27℃，培养3～5天。

10.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，分级标准采用茎部病情分级及反应型划分标准：

0级：无任何症状；

1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；

2级：幼苗根茎部变黑达1～2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；

3级：幼苗根茎部变黑超过1～2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；

4级：幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；

5级：植株枯死。