CN117204209A - 一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及番薯插条种植技术领域，具体为一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法，包括以下步骤：获取Diaporthe ueckerae孢子悬浮液，稀释至1×106个/mL，作为接种液；获取番薯插条，切口处直径为0.5‑0.7mm，切口上端1cm处保留一个节，扦插在150ml霍格兰营养液中缓苗6h；缓苗完成后将番薯插条扦插在150ml Diaporthe ueckerae孢子接种液中6h进行浸润接种；将接种完成后的番薯插条扦插至NaCl含量为3g/kg的土壤中。通过将Diaporthe ueckerae菌种接种到番薯插条上，可以有效的提高番薯插条的耐盐性，使番薯插条的生长环境不受盐碱地的抑制，且Diaporthe ueckerae菌种的内生真菌获取简单，成本较低，接种过程也简单，因此不会大幅增加番薯插条的种植成本，可以满足盐碱地区对耐盐性番薯插条的需求。
Description
技术领域
本发明涉及番薯插条种植技术领域，具体为一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法。
背景技术
番薯又名甘薯和地瓜，为旋花科番薯属多年生藤蔓草本植物，番薯的块根肥大、产量高，是全球主要的粮食作物之一，一些改良的块茎退化型番薯品种，因其茎叶发达，嫩脆爽滑，且富含多种蛋白质、维生素和矿质元素，使得番薯叶也成为了深受人们青睐的一种绿叶蔬菜，番薯的藤蔓极易产生须根，基于此特性，番薯主要通过藤蔓插条进行扦插繁殖，番薯藤蔓的再生能力极强，其嫩茎和嫩叶在生长期内可以反复多次采摘食用，因此，番薯叶的年产量较高，可以给菜农带来较大的经济收益。
然而，番薯插条对盐胁迫的耐受性不强，当土壤盐分含量高于2g/kg时，番薯藤蔓插条的生根能力和存活率显著降低，这极大的限制了番薯在广阔盐碱地区的栽培和种植，为了使番薯插条适应盐碱化土壤、扩大番薯的种植规模，就必需提高番薯插条的耐盐性，选育耐盐性番薯品种是提高番薯插条耐盐性的方法之一，然而，该方法的技术性强、投入大、耗时长，使得番薯耐盐性品种的选育技术进展较为缓慢，因此急需一种新的技术来提高番薯插条的耐盐性，虽然大量研究表明内生真菌能够提高植物的耐盐性，然而目前为止仍未有文献记载报道有能够提高番薯插条耐盐性的内真真菌。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法，包括以下步骤：
获取Diaporthe ueckerae孢子悬浮液，稀释至1×106个/ml，作为接种液；
获取番薯插条，切口处直径为0.5-0.7mm，切口上端1cm处保留一个节，扦插在150ml霍格兰营养液中缓苗6h；
缓苗完成后将番薯插条扦插在150ml Diaporthe ueckerae孢子接种液中6h进行浸润接种；
将接种完成后的番薯插条扦插至NaCl含量为3g/kg的土壤中。
优选的，Diaporthe ueckerae菌株通过五爪金龙植株获取，获取方法为：
从五爪金龙植株上采集健康的花瓣，用自来水清洗干净，将花瓣置于超净工作台中并浸泡于75％酒精中0.5min，然后在5％NaCl中浸泡8min，再次取出后将花瓣在75％酒精中浸泡0.5min，从超净工作台中取出用无菌水分浸洗3次后置于滤纸上晾干，将花瓣剪成小块接种至NaCl含量为3g/L的无菌PDA培养基上，培养皿置于26℃恒温箱中暗培养7d后，将花瓣小块边缘长出的菌丝转移至不含NaCl的无菌PDA上，置于26℃恒温箱中暗培养7d后，得到菌落形态的菌株。
优选的，获取菌株后对菌株进行扩繁培养，培养步骤为：
从菌株的菌落上取直径为0.5cm的菌饼转接至不含NaCl的无菌PDA培养基上进行培养，每个PDA培养基上转接1个菌落小块，培养皿用封口膜密封，置于26℃恒温箱中暗培养7d。
优选的，Diaporthe ueckerae孢子悬浮液获取方法为：
将菌落形态的菌株从PDA培养基转接至不含NaCl的无菌PDB培养基中，然后置于26℃、无光照的培养箱内培养48h，然后PDB培养基经过三层无菌纱布过滤菌丝以得到Diaporthe ueckerae孢子悬浮液。
优选的，使用血球计数板对孢子悬浮液的孢子浓度进行计数。
优选的，番薯插条扦插在NaCl含量为3g/kg的土壤中的深度为6cm。
优选的，番薯插条扦插完成后浇入100ml去离子水。
本发明具如下有益效果：
通过将Diaporthe ueckerae菌种接种到番薯插条上，可以有效的提高番薯插条的耐盐性，使番薯插条的生长环境不受盐碱地的抑制，且Diaporthe ueckerae菌种的内生真菌获取简单，成本较低，接种过程也简单，因此不会大幅增加番薯的种植成本，可以满足盐碱地区对耐盐性番薯插条的需求，扩大番薯的种植规模。
附图说明
图1是本发明所提供的Diaporthe ueckerae菌落的示意图。
图2是本发明所提供的Diaporthe ueckerae是否具有嗜盐性试验的统计图。
图3是本发明所提供的番薯插条在盐胁迫环境下的生长结果图。
图4是本发明所提供的番薯插条在盐胁迫环境下的存活数据图。
图5是本发明所提供的Diaporthe ueckerae对番薯插条是否致病的试验结果图。
具体实施例
以下对本发明的原理和步骤进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在一个具体实施例中，如图1-5所示，一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法，包括以下步骤：
获取Diaporthe ueckerae孢子悬浮液，稀释至1×106个/mL，作为接种液；
获取番薯插条，切口处直径为0.5-0.7mm，切口上端1cm处保留一个节，扦插在150ml霍格兰营养液中缓苗6h；
缓苗完成后将番薯插条扦插在150ml Diaporthe ueckerae孢子接种液中6h进行浸润接种；
将接种完成后的番薯插条扦插至NaCl含量为3g/kg的土壤中。
在本实施例中，Diaporthe ueckerae菌株通过五爪金龙植株获取，五爪金龙作为入侵植物，其获取方式简单，成本低，且为内生真菌的天然宿主植物，无需另外人工培养，较为划算，Diaporthe ueckerae菌株获取方法为：
从五爪金龙植株上采集健康的花瓣，用自来水清洗干净，将花瓣置于超净工作台中并浸泡于75％酒精中0.5min，然后在5％NaClO中浸泡8min，再次取出后将花瓣在75％酒精中浸泡0.5min，从超净工作台中取出花瓣用无菌水分浸洗3次后置于滤纸上晾干，将花瓣剪成0.5cm×0.5cm的小块接种至NaCl含量为3g/L的无菌PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上，PDA培养基的调配比例为200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂，0.1g硫酸链霉素，1000mL去离子水，每个PDA培养基上接种3个花瓣小块，共接种3个PDA培养基，然后将培养皿盖住，并用封口膜密封，将装有无菌PDA培养基的培养皿置于26℃恒温箱中暗培养7d后，观察PDA培养基上花瓣小块边缘菌丝的发生情况，在本实施例中，3个PDA培养基上有一个花瓣小块边缘长出菌丝。将边缘长出菌丝的花瓣小块转移至不含NaCl的无菌PDA上，置于26℃恒温箱中暗培养7d后，得到菌落形态的菌株，如图1所示。
为验证菌种的准确性，将菌株进行ITS测序验证，所用引物为ITS1f/ITS4r(ITS1f5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′,ITS4r 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，测得的ITS序列为5’-GGGGTAGTCTCGTTGGTGACCAGCGGAGGGATCATTGCTGGAACGCG CTTCGGCGCACCCAGAAACCCTTTGTGAACTTATACCTATTTGTTGCCTCGGCGTAGGCCGGCCTTTTGTGACAAAGGCCCCCTGGAAACAGGGAGCAGCCCGCCGGCGGCCAACTAAACTCTTGTTTCTATAGTGAATCTCTGAGTAAAAACATAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCTGGCTTGGTGATGGGGCACTGCCTTCTAGCGAGGGCAGGCCCTGAAATCTAGTGGCGAGCTCGCTAGGACCCCGAGCGTAGTAGTTATATCTCGTTCTGGAAGGCCCTGGCGGTGCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAAAATTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAACTGGGAAGGAAAC-3’。将该序列与已知菌种序列进行相似度比对，结果显示该序列与Diaporthe ueckerae的相似度为100％，从而确定该内生菌株的菌种为Diaporthe ueckerae。
在本实施例中，获取菌株后对菌株进行扩繁培养，以便形成更多处理组和对比组，培养步骤为：
从菌株的菌落上取直径为0.5cm的菌饼转接至不含NaCl的无菌PDA培养基上进行培养，每个PDA培养基上转接1个菌落小块，总共转接20个PDA培养基，培养皿用封口膜密封，置于26℃恒温箱中暗培养7d，扩繁得到20个Diaporthe ueckerae菌落。
在本实施例中，还对Diaporthe ueckerae菌种是否具有嗜盐性进行了测试试验，具体试验过程及试验结果为：
以NaCl设置盐分梯度，分别配置NaCl浓度为0g/L、3g/L和5g/L的PDB培养基，所述PDB培养基的调配比例为马铃薯200g，葡萄糖20g，1000mL去离子水，所述PDB培养基在高温高压灭菌锅中以温度121℃、时间20min灭菌，室温下冷却后盛装于250ml的锥形瓶中，每个锥形瓶盛装100ml，每个盐浓度PDB培养基的锥形瓶三个，共九个锥形瓶。在超净工作台内，从Diaporthe ueckerae的菌落边缘用无菌打孔器取直径为5mm的菌饼，分别接种于九个所述锥形瓶内的PDB培养基中，将所述锥形瓶用封口膜密封后，置于恒温振荡器上以转速250rpm，温度26℃对内生真菌Diaporthe ueckerae进行振荡培养，使培养基与氧气充分接触，提高溶解氧的供应量，使每个NaCl浓度条件下各设3个生物学重复，使试验更严谨。60h后，用四层纱布过滤真菌培养液并收集菌丝球，用纯净水冲洗菌丝球，去除表面发酵液，放置于已知质量的培养皿上，放入恒温鼓风干燥箱中，80℃烘干至恒重，冷却后用分析天平称重，用称得的恒重质量减去已知培养皿的质量即为菌株的生物量，并计算3个生物学重复的平均值。通过进行方差分析，并采用LSD法对盐浓度为0g/L、3g/L和5g/L条件下菌株生物量的差异显著性进行检测。如图2所示，图2中数值为平均值±标准误，不同字母表示差异显著(P＜0.005)，从图2可以看出，Diaporthe ueckerae菌种在NaCl浓度为3g/L和5g/L的PDB培养基中生物量显著高于其在NaCl浓度为0g/L的PDB培养基中的生物量，且在NaCl浓度为5g/L的PDB培养基中生物量最高，这一结果表明Diaporthe ueckerae菌种具有嗜盐性。
在本实施例中，制备Diaporthe ueckerae孢子悬浮液是通过在超净工作台内，将已培养7d的Diaporthe ueckerae菌落从PDA培养基转接至不含NaCl的无菌PDB培养基中，然后置于26℃、无光照的培养箱内培养48h。真菌培养液经过三层无菌纱布过滤以清除菌丝，所得滤液即为Diaporthe ueckerae孢子悬浮液。以血球计数板对该悬浮液的孢子浓度进行计数，并用无菌PDB将孢子浓度稀释至1×106个/ml，得到Diaporthe ueckerae孢子接种液，每份Diaporthe ueckerae接种液150ml，共十份。
在本实施例中，获取番薯插条时，在田间采集了20株番薯插条，用剪刀剪取健康番薯植株茎的上端部分作为插条，保留心叶和1个叶片，插条长度约为13-15cm，插条下端切口处直径约为0.5-0.7mm，切口上端1cm处保留1个节，使插条保持相似的活性。将修理好的插条扦插在150ml霍格兰营养液中缓苗6h。
在本实施例中，在进行接种时，为与未接种Diaporthe ueckerae孢子的番薯插条生长情况形成对比，因此将10株番薯插条扦插在150ml Diaporthe ueckerae孢子接种液中进行浸润接种，作为处理组，将剩下10株番薯插条扦插在150ml的霍格兰营养液中，作为对照组。处理组和对照组中，插条浸入霍格兰营养液或Diaporthe ueckerae接种液的深度均为6cm，接种时间6h，得到番薯插条的接种插条和非接种插条各10株。
在本实施例中，准备土壤时，为实验在各个浓度的盐含量下番薯插条的生长状态，先从非盐碱的田间采集土壤并风干，将风干的土壤分成两份，分别加入NaCl，将两份土壤的NaCl含量调配为3g/kg和5g/kg的盐碱土作为番薯插条的培养基质。
在本实施例中，扦插前将3g/kg和5g/kg的盐碱土分别填充到12×12cm的塑料花盆中，土壤填充厚度为10cm。再将上述接种的10根番薯插条扦插至NaCl含量为3g/kg和5g/kg的两种培养基质中，每种培养基质各扦插5株，每个花盆内扦插1株。同理，为形成对比，将未接种的10根番薯插条扦插至NaCl含量为3g/kg和5g/kg的两种培养基质中，每种培养基质各扦插5株，每个花盆内扦插1株。所有插条插入培养基质的深度约为6cm，最后，向每个花盆中浇入100ml去离子水，再将所有插条置于室温和正常光照条件下进行培养。因此，3g/kg和5g/kg的NaCl胁迫条件下，番薯插条的接种处理和非接种处理均含有5个生物学重复。
在本实施例中，培养5d后，收获上述盐胁迫条件下所有接种处理的插条和非接种处理的插条，并用自来水清洗干净，生长结果如图3所示，图3中，(a)为3g/kg NaCl浓度土壤下接种处理的番薯插条生长情况、(b)为5g/kg NaCl浓度土壤下接种处理的番薯插条生长情况、(c)为3g/kg NaCl浓度土壤下非接种处理的番薯插条生长情况、(d)为5g/kg NaCl浓度土壤下非接种处理的番薯插条生长情况。3g/kg NaCl浓度胁迫条件下，非接种处理的番薯插条的茎发生了腐烂且叶片枯黄，接种处理的番薯插条的茎未发生腐烂且叶片鲜绿。5g/kg NaCl胁迫条件下，非接种处理的番薯插条的茎严重腐烂且叶片严重枯萎，接种处理的番薯插条的叶片虽然枯萎，但其茎未发生腐烂，且仍有须根发生，由此可见，接种处理的番薯插条受到的盐害程度明显低于非接种处理的番薯插条。
在本实施例中，用数据记录生长结果的详细情况，以便进行更为严谨的比较，测定接种处理的番薯插条和非接种处理的番薯插条的须根数、新叶数、茎腐烂长度比，并计算5个生物学重复的平均值。通过进行方差分析，并采用独立样本检验分别对3g/L和5g/L NaCl浓度条件下番薯插条的接种插条和非接种插条须根数、绿叶数和茎腐烂长度比的差异显著性进行检测(P﹤0.05)，结果如图4所示，图4中，E+代表接种处理的番薯插条、E-代表非接种处理的番薯插条，可以看出3g/kg NaCl浓度土壤胁迫条件下，E+插条的绿叶数、须根数显著高于E-插条，茎腐烂长度比显著低于E-插条。5g/kg NaCl胁迫条件下，E+插条的绿叶数与E-插条没有显著差异，但其须根数显著高于E-插条，茎腐烂长度比显著低于E-插条。因此可得出结论，内生真菌Diaporthe ueckerae的接种能够提高番薯插条的耐盐性。
与5g/kg NaCl浓度土壤的胁迫条件下生长的E+插条相比，3g/kg NaCl胁迫条件下生长的E+插条不会发生任何盐害症状。因此，内生真菌Diaporthe ueckerae接种的番薯插条适合在土壤盐含量约为3g/kg的盐碱地区进行种植和栽培。
关于内生真菌Diaporthe ueckerae是否会对番薯插条致病，是否会影响后续生长的问题进行试验验证，具体验证方式为：
在田间用剪刀剪取健康番薯植株茎的上端部分作为插条，插条上保留1个心叶和1个叶片，长度约为13-15cm，插条下端切口处直径约为0.5-0.7mm，切口上端1cm处保留1个节。将插条扦插在150ml霍格兰营养液中缓苗6h。对番薯插条的叶片上、下表面各喷施1mlDiaporthe ueckerae孢子接种液，作为接种处理组，另外，对剩下的番薯插条叶片上、下表面各喷施1ml无菌PDB，作为对照组。将处理组和对照组分开培养在各自的光照培养箱中，培养箱内温度均为25±1℃、相对湿度为85±2％，光暗周期为14h/10h,光照强度为200μmol·m-2·s-1。5d后，以无病害发生的对照组叶片为参照，检查处理组叶片的发生病害情况。如图5所示，图5中，(a)为处理组、(b)为对照组，可以看出，处理组与对照组一样，它们的叶片均保持健康状态，没有任何疾病症状发生，从而可以确定Diaporthe ueckerae菌种对番薯插条没有致病性，不会影响番薯插条的后续生长。
综上所述：通过将Diaporthe ueckerae菌种接种到番薯插条上，可以有效的提高番薯插条的耐盐性，使番薯插条的生长环境不受盐碱地的抑制，且Diaporthe ueckerae菌种的内生真菌获取简单，成本较低，接种过程也简单，因此不会大幅增加番薯的种植成本，可以满足盐碱地区对耐盐性番薯插条的需求，扩大番薯的种植规模。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上而顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
获取Diaporthe ueckerae孢子悬浮液，稀释至1×106个/ml，作为接种液；
获取番薯插条，切口处直径为0.5-0.7mm，切口上端1cm处保留一个节，扦插在150ml霍格兰营养液中缓苗6h；
缓苗完成后将番薯插条扦插在150ml Diaporthe ueckerae孢子接种液中6h进行浸润接种；
将接种完成后的番薯插条扦插至NaCl含量为3g/kg的土壤中。
2.根据权利要求1所述的一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法，其特征在于：Diaporthe ueckerae菌株通过五爪金龙植株获取，获取方法为：
从五爪金龙植株上采集健康的花瓣，用自来水清洗干净，将花瓣置于超净工作台中并浸泡于75％酒精中0.5min，然后在5％NaCl中浸泡8min，再次取出后将花瓣在75％酒精中浸泡0.5min，从超净工作台中取出用无菌水分浸洗3次后置于滤纸上晾干，将花瓣剪成小块接种至NaCl含量为3g/L的无菌PDA培养基上，培养皿置于26℃恒温箱中暗培养7d后，将花瓣小块边缘长出的菌丝转移至不含NaCl的无菌PDA上，置于26℃恒温箱中暗培养7d后，得到菌落形态的菌株。
3.根据权利要求2所述的一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法，其特征在于：获取菌株后对菌株进行扩繁培养，培养步骤为：
从菌株的菌落上取直径为0.5cm的菌饼转接至不含NaCl的无菌PDA培养基上进行培养，每个PDA培养基上转接1个菌落小块，培养皿用封口膜密封，置于26℃恒温箱中暗培养7d。
4.根据权利要求2所述的一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法，其特征在于：Diaporthe ueckerae孢子悬浮液获取方法为：
将菌落形态的菌株从PDA培养基转接至不含NaCl的无菌PDB培养基中，然后置于26℃、无光照的培养箱内培养48h，然后PDB培养基经过三层无菌纱布过滤菌丝以得到Diaportheueckerae孢子悬浮液。
5.根据权利要求4所述的一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法，其特征在于：使用血球计数板对孢子悬浮液的孢子浓度进行计数。
6.根据权利要求1所述的一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法，其特征在于：番薯插条扦插在NaCl含量为3g/kg的土壤中的深度为6cm。
7.根据权利要求1或6所述的一种利用嗜盐性内生真菌提高番薯插条耐盐性的方法，其特征在于：番薯插条扦插完成后浇入100ml去离子水。
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