CN117535201B - 贝莱斯芽孢杆菌hm-6及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HM‑6，保藏编号为CGMCC No.28606，其具有较高的定殖能力，可有效防控甘薯茎线虫病及甘薯蔓割病，对蛴螬具有高效杀虫能力，有效减轻甘薯重茬危害，适宜规模化生产及使用。

Description

贝莱斯芽孢杆菌HM-6及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌HM-6及其应用。
背景技术
甘薯是一种一年生的蔓生草本植物根状茎，因其营养丰富，具有抗癌、抗栓、增强免疫力、补气血等保健功能，已成为保障国家粮食安全的理想选择作物。随着人们对甘薯的需求增多，甘薯种植面积逐步增大，甘薯连作也越发普遍。甘薯连作是专业化生产比较明显的地区或生产单位广泛应用的一种种植方式。多年的连续重茬种植，甘薯重茬障碍越发严重，使得种植甘薯的土壤的地力下降，土传病虫害增多，甘薯产量和品质下降，严重影响着种植者的经济收益。
甘薯茎线虫病在我国以山东、河北两省发病较严重，是一种毁灭性病害，近年来随着甘薯种植重茬次数的增加，甘薯茎线虫病在局部地区危害越来越重，造成严重减产，能够造成甘薯减产20～50%，在发病严重地区减产达到80%以上。
甘薯蔓割病又称为枯萎病、蔓枯病等，我国主要分布于浙江、福建、四川、广东、台湾、山东、河北、辽宁、河南、江苏诸省，危害极大，近年来河北省种植区有逐渐加重趋势。该病的病原为尖孢镰刀菌甘薯专化型，是典型的镰刀菌导管病。病菌由土壤通过秧苗基部或根部的伤口，或由带菌种薯通过导管侵入秧苗，在导管组织内繁殖，致使患病植株发生枯萎、死亡，表现为地上部叶片自上而下变黄脱落，茎维管束变褐色，最后茎部开裂，整株枯死。
蛴螬是鞘翅目金龟甲总科幼虫的统称，是世界上公认的重要地下害虫，可为害多种植物，是近几年为害最重、给农业生产造成巨大损失的一大类群。蛴螬终年生活在土壤中，主要为害麦类、玉米、 薯类、豆类、花生等大田作物。取食萌发的种子和嫩根、咬断麦苗根茎、直接咬食花生嫩果或甘薯、甜菜的块茎和块根，不仅造成减产，而且伤口容易引起病菌的侵染。据调查统计，植物地下部分受害中86%是由蛴螬为害造成的。
近些年来，在我国北方一些薯区，甘薯茎线虫病及甘薯蔓割病两种病害常常混合发生，蛴螬危害加重，造成甘薯连作障碍日益严重。利用有益微生物抑制土壤中病原菌、防控土传病虫害、减轻连作障碍的生物技术由于其具有安全、环保、经济效益高且长效的优点，已成为当今研究的一大热点。
在我国北方薯区，由甘薯茎线虫病及甘薯蔓割病混合发生造成的甘薯连作障碍。现有技术中，缺乏能够有效拮抗甘薯茎线虫又兼能够有效拮抗尖孢镰刀菌甘薯专化型的生防菌及菌剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌HM-6，能够有效拮抗甘薯茎线虫又兼能够有效拮抗尖孢镰刀菌甘薯专化型，并可对蛴螬具有高效杀虫能力，可以有效减轻甘薯连作障碍的危害，适宜规模化生产及使用。
本发明采用如下技术方案：
一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HM-6，于2023年10月11日保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.28606。
所述贝莱斯芽孢杆菌HM-6，可拮抗甘薯茎线虫。
所述贝莱斯芽孢杆菌HM-6，其可拮抗尖孢镰刀菌甘薯专化型。
所述贝莱斯芽孢杆菌HM-6，其能够防治蛴螬。
一种如上述贝莱斯芽孢杆菌HM-6在防控甘薯茎线虫病或甘薯蔓割病中的应用。
一种上述贝莱斯芽孢杆菌HM-6在防治蛴螬中的应用。
一种包含上述贝莱斯芽孢杆菌HM-6的微生物菌剂。
微生物菌剂中，其还包括硅藻土、沸石、蛭石、活性炭或生物炭。
具体的，微生物菌剂的制备方法为：
（1）活化菌株：挑取一环菌株HM-6菌落，接种在装有10mL LB液体培养基的试管中，160rpm、37℃恒温振荡培养14h进行活化；
（2）种子液的制备：取活化后的菌液4mL接种于装有200mL LB液体培养基的1000mL三角瓶中，160rpm、37℃恒温振荡培养24h，得到种子液；
（3）发酵液的制备：将制备好的种子液接种于装有3.8L的LB液体培养基的6L小发酵罐中，160rpm、37℃恒温振荡培养48h，制得HM-6发酵液；
（4）将发酵液与硅藻土、沸石、蛭石、活性炭或生物炭按5~15∶1质量比混合均匀，经冷冻干燥机喷雾得到贝莱斯芽孢杆菌粉剂。
微生物菌剂中，所述贝莱斯芽孢杆菌HM-6的活菌数不低于1010CFU/g。
微生物菌剂中，所述贝莱斯芽孢杆菌HM-6为菌体、芽孢、发酵液和/或胞外代谢产物。
本发明的有益效果在于：本发明的贝莱斯芽孢杆菌HM-6具有较高的定殖能力，该菌株能够有效拮抗甘薯茎线虫又兼能有效拮抗尖孢镰刀菌甘薯专化型，还能够兼防治蛴螬，利用含有贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌体、芽孢、发酵液和/或胞外代谢产物的微生物菌剂可防控甘薯重茬障碍，有效防控甘薯茎线虫病及甘薯蔓割病，其对蛴螬具有高效杀虫能力，有效减轻甘薯重茬危害，适宜规模化生产及使用。本发明的贝莱斯芽孢杆菌HM-6与对照相比，对甘薯茎线虫病的防治效果达71.11%、对甘薯蔓割病的防治效果达76.56%，对蛴螬防控效果高达97%，实现亩增产27.8%。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌HM-6在固体LB培养基上培养24h的菌落形态。
图2为贝莱斯芽孢杆菌HM-6革兰氏染色后光学显微镜下的形态。
图3为贝莱斯芽孢杆菌HM-6基于16S rDNA构建的系统发育树。
图4为贝莱斯芽孢杆菌HM-6发酵液对甘薯茎线虫的毒杀效果。
图5为贝莱斯芽孢杆菌HM-6与甘薯蔓割病病原菌的对峙试验（PDA培养基，右侧图为对照，左侧图示对峙结果）。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。
实施例1 菌株的分离、纯化与筛选
在中国河北省卢龙县卢龙镇已重茬4年的甘薯地块，选择不发病的甘薯秧，从其根际采集土壤样品，共计6份，每份各取100g。将采集的6份土壤均匀混合。
取混合后的10g土壤样品加入100mL蒸馏水中搅拌均匀，静置1min后，取其上层清液1mL，加入到装有9ml无菌水的试管中，得到1×10-1稀释液，梯度稀释，依次稀释至1×10-4、1×10-5、1×10-6浓度，从1×10-4、1×10-5、1×10-6浓度的稀释液取0.1μL涂布在LB平板上，涂抹均匀，置于30℃恒温培养箱中培养2~4d，定时观察菌落的生长情况。待长出菌落后，在LB培养基上进行3次纯化，最终挑选出5个菌株，并分别编号为1号、2号、3号、4号、5号，保存于4℃冰箱，备用。
制备PDA培养基：新鲜马铃薯（去皮）200g，煮沸20min，过滤加葡萄糖20g，琼脂粉20g，加蒸馏水定容至1000mL，115℃灭菌20min。
对峙试验：将前述已分别编号的5个菌株分别接种于PDA培养基平板两侧，再将5mm的尖孢镰刀菌甘薯专化型的菌饼接种于培养基中间，以只接种病原菌的 PDA平板为对照，每个处理3个重复，置于28℃培养箱内96h，待对照长满整个平板时，观察5个菌株对病原菌的拮抗效果并检测抑菌半径（mm）。
从表1所示的抑制效果来看，编号4号的菌株对尖孢镰刀菌甘薯专化型抑制作用最强，抑菌半径为15mm，命名为菌株HM-6。
表1 5个菌株与尖孢镰刀菌甘薯专化型对峙试验测定结果
。
图5是贝莱斯芽孢杆菌HM-6与尖孢镰刀菌甘薯专化型对峙试验效果图，
右侧图为对照，左侧图示对峙结果。
菌株HM-6对甘薯茎线虫幼虫致死率测定试验：将菌株HM-6制备成有效活菌数为106cfu/ml的菌悬液；取出提前制备的含量为1000条/mL的甘薯茎线虫二龄幼虫（J2）悬浮液，然后将0.5mL的菌悬液和0.1mL J2悬浮液混匀于24孔板中，放置于28℃恒温培养箱中，24h后统计J2死亡条数（如图4），计算幼虫死亡率。
J2死亡率（%）＝（Ca－Ta）÷Ca×100。其中，Ca代表对照中未死亡的线虫数量，Ta代表处理中未死亡的线虫数量，试验重复5次，取平均值，结果如表2所示。
线虫校正死亡率%=（处理线虫死亡率－对照线虫死亡率）/（1－对照线虫死亡率）×100。
表2 菌株HM-6菌悬液对甘薯茎线虫幼虫致死率测定
。
实施例2菌株HM-6的鉴定
（1）微生物学特性
菌株HM-6于LB平板上，在30℃下培养3天后，如图1所示，该菌株的单菌落呈乳白色，表面粗糙且边缘不规则。光学显微镜下，该菌体呈杆状，大小为0.5μm ×（1.5～3.5μm），芽孢呈椭圆形，中生，末端膨大为孢子囊；革兰氏染色呈现为阳性，如图2。
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对该菌株进行形态学鉴定，初步判断菌株HM-6属于芽孢杆菌。
（2）生理生化特性
对菌株HM-6的生理和生化特性进行鉴定实验，结果如表3所示。
表3 菌株HM-6生理生化特征
。
（3）分子生物学特性
提取菌株HM-6的基因组DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，将扩增产物回收并进行测序，获得含有1443 bp的DNA序列如SEQ ID No.1所示。将测序结果输入GeneBank数据库进行BLAST比对分析，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平上鉴定结果该菌属于贝莱斯芽孢杆菌，构建系统发育树结果如图3所示。进行同源比对，发现HM-6与贝莱斯芽孢杆菌的一致性达到99%。根据菌株形态学，测序分析和生理生化结果鉴定HM-6为贝莱斯芽孢杆菌。
将贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HM-6于2023年10月11日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC No.28606。
实施例3 盆栽试验测试贝莱斯芽孢杆菌HM-6定殖能力
选择已用于实际生产且表现较好的5种细菌菌株XJ-16、HG3-X4、HG4-X1、HG1-Z1、HG4-Z2进行对比，通过盆栽试验测试来评价贝莱斯芽孢杆菌HM-6定殖能力。
（1）盆栽试验用土取自本申请人试验基地，为潮褐土，风干后高温灭菌制成无菌土。
（2）将细菌菌株XJ-16、HG3-X4、HG4-X1、HG1-Z1、HG4-Z2以及HM-6分别接种于LB液体培养基中，温度30℃、转速160r/min，培养48h，获得发酵液，再将发酵液配制成含菌量1.0×109CFU/mL的菌悬液。
（3）将无菌土与固体发酵培养基按4∶1的比例均匀混合，装于直径为10cm，高为11cm的花盆中，使混合物的总体积达到150 cm3。
（4）浇施200mL配制好的菌悬液，将花盆放入装有水的托盘，通过盆底孔上吸至表土湿润，去除托盘中的水，将花盆摆在温室内，温度在20~28℃，15d后从6cm处的土壤取样1g检测所含有效活菌数，每个菌株5次重复。期间每隔4d浇一次水。
固体发酵培养基：麸皮∶谷壳∶3%葡萄糖水＝7∶3∶3，尿素2.16%，磷酸二氢钾2.77%，混合均匀后装袋，121℃高压湿热灭菌60 min，间歇式灭菌2次。
检测各菌株在每克土中的定殖数量、统计定殖率。
定殖率（%）=定殖数量÷接种数量×100。
表4 菌株的定殖率检测结果
。
由表4可见，贝莱斯芽孢杆菌HM-6具有优秀的定殖能力。
实施例4 贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌剂防控甘薯蔓割病菌的盆栽试验
贝莱斯芽孢杆菌HM-6孢子悬浮液制备：将分离获得的菌株HM-6接种于LB液体培养基中，28℃下200 r/min振荡培养48h后，4000 r/min离心2min取上清，配制成OD600为0.20和0.40的孢子悬浮液，待用。
病原菌孢子悬浮液制备：取甘薯蔓割病病原菌（尖孢镰刀菌甘薯专化型）接种到PDA液体培养基中，28℃下200r/min培养48h，离心收集菌体并用灭菌生理盐水配制成菌悬液（1×108CFU/mL），待用。
土壤基质制备：将蛭石、田间土和细沙按质量比1∶1∶1混匀，置于鼓风干燥箱中120℃下 60 min灭菌2次，制备成混合土壤，每500 g混合土壤加入20 mL甘薯蔓割病病原菌悬浮液并混匀，备用。
病原菌接种：选新鲜脱毒甘薯苗，将甘薯茎基部新鲜切口浸入不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌HM-6孢子悬浮液（OD600分别为0、0.20 和0.40，其中OD600为0的处理作为对照）中，15 min后取出晾干，然后浸入甘薯蔓割病病原菌悬浮液接种15 min，取出晾干后，再次分别浸入不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌HM-6孢子悬浮液中15 min，根据贝莱斯芽孢杆菌HM-6孢子悬浮液OD600分别记为CK、处理1和处理2，随后取出扦插于盆中，每盆栽1株重复20次。
接种后的薯苗置于温度为28~30℃、湿度为 80％以上的温室内，光周期10L∶14D下，保持土壤水分20%左右。当对照植株多数枯死时，剖茎检查所有薯苗维管束变褐程度，结合观察地上部生长情况。试验结果见表5。
表5 贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌剂防控甘薯蔓割病的盆栽试验结果
。
其中，甘薯蔓割病的分级标准为：
0（0.0）级：无病。
I（0.1）级：地上部生长正常，茎基部维管束变褐在3cm左右。
II（0.2）级：地上部基本正常，垄基部维管束变褐在1/4左右。
III（0.5）级：茎基部叶片变黄，茎基部维管束变褐在1/2以上。
IV（0.8）级：植株叶片多数变黄枯死，茎部维管束变褐扩展及顶芽。
V（1.0）级：全株枯死。
病情指数%=Σ（各级病株数×病级数）×100/（调查总株数×最高病级数）；
抗重茬病效果%=（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数。
盆栽实验表明，贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌剂防控甘薯蔓割病盆栽防病效果最好为76.56%，说明贝莱斯芽孢杆菌HM-6对甘薯蔓割病具有良好的生防潜力。
实施例5 微生物菌剂的制备
以硅藻土为载体制备贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌剂，其具体步骤为：
（1）制备LB液体培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g置于1000mL烧杯中，加900mL蒸馏水加热溶解，调pH为7.2~7.4，用蒸馏水定容至1L，121℃灭菌30分钟，备用。
（2）活化菌株：挑取一环菌株HM-6菌落，接种在装有10mL LB液体培养基的试管中，160rpm、37℃恒温振荡培养14h进行活化。
（3）种子液的制备：取活化后的菌液4mL接种于装有200mL LB液体培养基的1000mL三角瓶中，160rpm、37℃恒温振荡培养24h，得到种子液。
（4）发酵液的制备：将制备好的种子液接种于装有3.8L的LB液体培养基的6L小发酵罐中，160rpm、37℃恒温振荡培养48h，制得HM-6发酵液，有效活菌数为2.26×109CFU/mL。
（5）将发酵液与硅藻土按10∶1质量比混合均匀，经冷冻干燥机喷雾得到贝莱斯芽孢杆菌粉剂，经检测有效活菌数为4.12×1010cfu/g。
实施例6 贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌剂对蛴螬幼虫的杀虫效果
将实施例5制备的贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌剂分别调配成有效活菌数为1.0×1010cfu/g、1×109cfu/g、5×108cfu/g的悬浮液，与经高温杀虫处理不含有蛴螬的土壤均匀混合配置成药土，以清水配制药土作为对照。用碎花生作为食料，将容量10L的塑料桶作容器，每桶放置混合均匀药土10kg，并加入适量等量的食料拌匀。
采用药土法，取100只蛴螬均匀分散到10kg土壤，在相对湿度为50％~70％、温度为25℃~28℃的环境中保持72h后统计蛴螬的死亡率，每个处理重复3次，结果见表6。
其中有效活菌数为1.0×1010cfu/ g的处理，对蛴螬的致死率达到97%。
表 6 不同浓度微生物制剂24h对蛴螬的致死率统计结果
。
实施例7 贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌剂的田间应用试验
试验品种：红瑶。
试验时间：2022年5月5日~2022年10月10日。
所有试验数据的调查统计工作在2022年10月10日前结束。
试验地点：河北省卢龙县卢龙镇连续种植甘薯6年的地块，地下害虫主要是蛴螬。
处理组：处理组有1个处理，按照每亩1kg施用量，将实施例5制得的贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌剂（有效活菌数为4.12×1010cfu/g）拌土44kg，在甘薯秧移栽定植前穴施，穴深10cm，其它栽培管理措施均按照当地甘薯生产技术规范执行。
对照组（CK）：应用淡紫拟青霉处理。淡紫拟青霉菌剂，由市场采购获得，有效活菌数1×1010cfu/g。具体做法是：每亩1kg淡紫拟青霉菌剂，拌土44kg，在甘薯秧移栽定植前穴施，穴深10cm，其余的栽培管理措施均按照卢龙当地甘薯生产技术规范执行。
本实施例的处理组和对照组均3次重复，所有处理随机排列，每个处理的小区面积66.6m2。
甘薯茎线虫病调查方法：2022年10月9日收获，采用5点取样法，每个处理选取5点，每个点调查10株。统计甘薯产量和茎线虫的发病情况。按照茎线虫病分级标准，记录发病块数和级别，与对照CK比较，计算病情指数和防治效果。见表7。
甘薯茎线虫病发病薯块分级标准为：0级：薯块无病斑。1级：薯块病区占全薯块1/4以下。2级：薯块病区占全薯块1/4～1/2。3级：薯块病区占全薯块1/2～3/4。4级：薯块病区占全薯块3/4以上。
计算方法：
发病率（%）＝∑（发病块数）/（调查总块数）×100。
病情指数（%）＝∑（各病级块数×各级代表值）/（调查总块数×最高级代表值）×100。
防治效果（%）＝（对照区病指－防治区病指）/对照区病指×100。
增产率（%）＝（防治区产量－对照区产量）/对照区产量×100。
表7 贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌剂防控甘薯茎线虫病结果
。
表7的结果清楚表明，应用贝莱斯芽孢杆菌HM-6制备的生防菌剂能有效降低甘薯茎线虫病的发病率和降低病情指数。其中处理组防治甘薯茎线虫病的防治效果为71 .11%，发病率极显著低于应用淡紫拟青霉菌剂的处理，甘薯产量明显增加。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HM-6，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.28606。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HM-6，其特征在于，其拮抗甘薯茎线虫。
3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HM-6，其特征在于，其拮抗尖孢镰刀菌甘薯专化型。
4.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HM-6，其特征在于，其能够防治蛴螬。
5.一种如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HM-6在防控甘薯茎线虫病或甘薯蔓割病中的应用。
6.一种如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HM-6在防治蛴螬中的应用。
7.一种包含权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HM-6的微生物菌剂。
8.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，其还包括硅藻土、沸石、蛭石、活性炭或生物炭。
9.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌HM-6的活菌数不低于1010CFU/g。
10.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌HM-6为菌体、芽孢和/或发酵液。
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