CN104946543A - 一种植物根际木霉菌分离方法 - Google Patents

一种植物根际木霉菌分离方法 Download PDF

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刘志华
范海娟
张荣沭
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Abstract

一种植物根际木霉菌分离方法，它涉及一种木霉菌分离方法。它要解决现有木霉菌分离存在分离速度慢、效率低，被分离的木霉菌多样性差的问题。方法：一、样品采集及处理；二、制备样品原液及其稀释液；三、样品原液及其稀释液，利用灭过菌的涂布涂在孟加拉红固体培养基表面，培养后获得木霉菌落；四、观察并挑取木霉菌落，分别转接到PDA斜面培养基中，培养后获得木霉菌纯培养物，即完成植物根际木霉菌的分离。本发明可在所有植物根系及根际土壤中分离出多种木霉菌，木霉菌落可在24～48h内被获得，单次分离20株以上，保证多样性鉴定的需求，免去单孢分离的步骤。

Description

一种植物根际木霉菌分离方法
技术领域
本发明涉及一种木霉菌分离方法。
背景技术
木霉菌作为生物防治菌的优势在于对多种植物病原菌具有广谱的抗菌特性，比如可以防治可可黑荚病，葡萄孢疫病及西红柿和黄瓜枯萎病等多种真菌病害；不仅可以防治农作物及林木生长期病害还可防治采摘后的蔬菜水果及园艺花卉的材料储存期病害；同时还能刺激种子萌发、根的伸长、植物生长并且提早开花结实；改善土壤微生物群落结构及pH值，降低土壤盐碱度。兼具杀真菌生物农药与促生长生物肥料及土壤改良剂等多种功效。因此，从我国的农田生态系统(粮食、蔬菜和果树)和非农田生态系统(森林、草原和沙漠)中大规模采集木霉菌株，并明确不同生态系统的优势种及木霉菌多样性，筛选出生物防治，高效产抗生素，和具有耐受极端环境因子的木霉菌株具有重要的理论意义和应用价值。
但是，现有木霉菌的分离方法，普遍存在分离速度慢、效率低，优势木霉种得到分离，而低丰度木霉种往往被漏掉，因此，不能满足木霉菌多样性分析的需求，极大的制约了木霉菌资源收集进度，限制了木霉菌的应用。
发明内容
本发明目的是为了解决现有木霉菌分离存在分离速度慢、效率低，被分离的木霉菌多样性差的问题，从而提供一种植物根际木霉菌分离方法。
植物根际木霉菌分离方法，按以下步骤实现：
一、样品采集及处理：
采集：任意时间采集自然环境中的木本植物、草本植物、花卉、蔬菜或中草药的根系或根际土壤样品；
处理：浅根系的矮小植物：戴上灭菌的手套，除去根系上附着的土壤，利用灭菌的剪刀剪取100～200g根，装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得根系样品；深根系的大型植物：取10～20cm深处100～200g根际土壤装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得土壤样品；
二、超净工作台中，取30g根系样品或土壤样品放入装有100mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，封上瓶盖，在140r/min的摇床中摇动10min，获得样品原液，然后制备5倍、25倍、50倍和75倍的稀释液；
三、样品原液及其稀释液分别吸取200μL，利用灭过菌的涂布涂在孟加拉红固体培养基表面，各涂布10皿，共计50皿，置于25℃的培养箱中培养24～48h，获得木霉菌落；
四、在超净工作台中，观察获得的木霉菌落，每种样品至少挑取20个木霉菌落，分别转接到PDA斜面培养基中，置于25℃的培养箱中培养5d，分离出木霉菌，获得纯培养物，即完成植物根际木霉菌分离；
其中步骤四中孟加拉红固体培养基是装有20mL孟加拉红固体培养基的9cm培养皿。
本发明中植物根际木霉菌分离方法的优点：
广谱：可在所有植物根系及根际土壤中分离出多种木霉菌，而现有的方法只能从植物根际分离到丰度较高木霉菌。
快速：木霉菌落可在24～48h内被获得；而现有方法至少需要五天的时间。
高效：单次分离20株以上，保证多样性鉴定的需求，而现有方法只能分离5～10株。
简单：本发明在24～48h内获得木霉菌落，任何其它真菌都没开始产孢，保证分离出的是单一的木霉菌株，免去单孢分离的步骤。
附图说明
图1为实施例中木霉属的形态图；
图2为实施例中木霉属的形态图；
图3为实施例中木霉属的形态图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式植物根际木霉菌分离方法，按以下步骤实现：
一、样品采集及处理：
采集：任意时间采集自然环境中的木本植物、草本植物、花卉、蔬菜或中草药的根系或根际土壤样品；
处理：浅根系的矮小植物：戴上灭菌的手套，除去根系上附着的土壤，利用灭菌的剪刀剪取100～200g根，装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得根系样品；深根系的大型植物：取10～20cm深处100～200g根际土壤装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得土壤样品；
二、超净工作台中，取30g根系样品或土壤样品放入装有100mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，封上瓶盖，在140r/min的摇床中摇动10min，获得样品原液，然后制备5倍、25倍、50倍和75倍的稀释液；
三、样品原液及其稀释液分别吸取200μL，利用灭过菌的涂布涂在孟加拉红固体培养基表面，各涂布10皿，共计50皿，置于25℃的培养箱中培养24～48h，获得木霉菌落；
四、在超净工作台中，观察获得的木霉菌落，每种样品至少挑取20个木霉菌落，分别转接到PDA斜面培养基中，置于25℃的培养箱中培养5d，分离出木霉菌，获得纯培养物，即完成植物根际木霉菌分离；
其中步骤四中孟加拉红固体培养基是装有20mL孟加拉红固体培养基的9cm培养皿。
本实施方式步骤一中任意时间均采集：是指任意时间均可采集并分离木霉菌，但是每年的八月中旬至十月中旬为最佳采集时间，此时间内木霉菌生长最为活跃，能分离出较多种类及数量的木霉菌，保证多样性分析的需求，其它时间虽然被分离的木霉菌多样性较差，数量少，但较易分离到抗性木霉菌株。
本实施方式步骤一中样品采集：当植物类型单一时，可以确保被分离的木霉菌来自特定植物，与此同时，来自不同植物根系的木霉菌种类不同，因此可以保证被分离木霉菌的多样性。
本实施方式步骤一中样品采集：对于特殊立地环境，植物分布较为稀疏，可直接从植物根际分离，不会受到来自其它植物根系木霉菌的污染，此情况下虽然分离的木霉菌种类较少，但可以分离到抗逆性较强的菌株。
本实施方式步骤一中样品采集：对于植物多样性较丰富的环境，必须采集至少20种植物的部分植物根系及根际土壤，少于20种植物的必须采集全部植物根系及根际土壤，以确保多样性。
本实施方式步骤一中样品采集：同种植物在不同环境中，其根系的木霉菌种类有所不同，因此应采集来自不同环境的同种植物的根系及根际土壤，保证被分离木霉菌的多样性。
本实施方式步骤一中样品采集，需选取健康植株，并且应尽量采集不同立地环境植株或不同植物的根及根际土壤，从而确保被分离木霉菌的多样性。
本实施方式步骤一中采集样品是将浅根系的矮小植物整株挖出剪取根系，深根系的大型植物则挖取根际土壤。
本实施方式步骤一中除去根系上附着的土壤，目的是保证分离的是此种植物根际微生物，而不是相近植物的根际微生物；步骤一中所用工具都要无菌，避免杂菌带入样品，使分离的木霉菌来源不清。
本实施方式步骤二中摇床中摇动，目的是保证根际木霉菌能够溶到灭菌蒸馏水中。本实施方式步骤四中观察获得的木霉菌落：木霉孢子的分生孢子较小，单个分生孢子的直径为(2.5～4.5)×(2～4)μm；单一分生孢子产生的菌落薄，菌丝很细，伏在培养基表面，不易被看到，因此必须在光线充足的地方仔细观察培养皿才能看见木霉菌落。
本实施方式步骤四中培养5天，通过观察产孢情况及有无杂菌污染，将木霉菌分离出来，分离的木霉菌是纯培养，免去了二次分离的步骤。
本实施方式中完成植物根际木霉菌分离后进行木霉菌的形态学及ITS鉴定：
木霉属的初步形态学鉴定：用解剖针挑取孢子，放于载玻片上，用显微镜仔细观察菌丝，分生孢子梗及分生孢子形态，并与木霉属真菌进行对比，若相符则需进行木霉属的鉴定。木霉属形态：菌丝透明有隔，分枝丰茂，分生孢子梗垂直对称分歧，对生或互生分枝，分枝上可再分枝，分枝顶端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或单生，由小梗生出分生孢子，分生孢子单生或簇生，圆形或卵圆形，绿色或黄绿色。
木霉种的ITS鉴定：利用PD液体培养基接种分离木霉菌的孢子，25℃，200rpm，摇瓶培养3d，收集菌丝体，利用CTAB方法，提取木霉菌基因组DNA，利用基因组DNA为模板，利用ITS1和ITS4为引物进行ITS序列扩增。ITS序列插入T载体，转化大肠杆菌获得转化子，选择10个转化子进行测序，保证分离的木霉为纯培养，避免与其它木霉菌交叉污染。测序后，利用国际真菌分类委员会木霉菌和肉座菌分会提供的在线鉴定软件进行分类鉴定http://www.isth.info/(两个在线分析软件为TrichOKEY和TrichoBLAST)，若10个测序结果均为同种木霉，则可初步鉴定木霉种类。
其中ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
采用本实施方式从玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、马铃薯(Solanumtuberosum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、香菜(Coriandrum sativum)、油菜(Brassicacampestris)、灰绿藜(Chenopodium glaucum)、青蒿(Artemisia carvifolia)、车前(Plantagoasiatica)、白屈菜(Chelidonium majus)、玉簪(Hosta plantaginea)、丁香(Syringa oblata)和串红(Salvia splendens)的根围分离出木霉菌，并且一种植物的根系及土壤中分离的木霉菌不止一种，其多样性非常丰富，经鉴定包括绿色木霉、深绿木霉、拟康宁木霉、长枝木霉、棘孢木霉、哈茨木霉、拟哈茨木霉、绒毛木霉和里氏木霉。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中的根系样品或土壤样品，若近期进行分离，则于4℃保存，若近期不进行分离，则于-20℃下保存。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一中剪刀剪取150g根。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤一中取15cm深处150g根际土壤装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得土壤样品。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤二中制备稀释液：取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL样品原液，吸打混匀即为5倍稀释液；取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL 5倍稀释液，吸打混匀即为25倍稀释液；取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL 25倍稀释液，吸打混匀即为75倍稀释液。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三中培养24～48h，这期间每隔4h在光线明亮的地方仔细观察一次木霉菌落，当发现木霉菌落时，立即将其转接到PDA斜面培养基中。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
本实施方式中由于木霉菌丝极细长，菌落很薄，不易被观察到，与此同时木霉菌生长极快，易与其它菌落生长到一起，而将木霉菌污染，因此在24～48h之间需每隔4h在光线明亮的地方仔细观察一次木霉菌落，以免被其它菌落覆盖，产生污染，进而影响分离效率。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤三中置于25℃的培养箱中培养36h。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤三中孟加拉红固体培养基由5g蛋白胨、10g葡萄糖、1g磷酸二氢钾、0.5g MgSO4·7H2O、100mL 1/3000孟加拉红溶液、0.1g氯霉素、15～20g琼脂和1000mL蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
本实施方式中加入氯霉素目的是为了抑制土壤中细菌的生长。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例：
植物根际木霉菌分离方法，按以下步骤实现：
一、样品采集及处理：
采集：2014年9月份，黑龙江省哈尔滨市南岗区，采集灰绿藜(Chenopodium glaucum)的根系及根际土壤；
处理：浅根系的矮小植物：戴上灭菌的手套，除去根系上附着的土壤，然后利用灭菌的剪刀剪取150g根，装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得根系样品；
二、超净工作台中，取30g根系样品或土壤样品放入装有100mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，封上瓶盖，在140r/min的摇床中摇动10min，获得样品原液，然后制备5倍、25倍、50倍和75倍的稀释液；
三、样品原液及其稀释液分别吸取200μL，利用灭过菌的涂布涂在孟加拉红固体培养基表面，各涂布10皿，共计50皿，置于25℃的培养箱中培养36h，获得木霉菌落；
四、在超净工作台中，观察获得的木霉菌落，每种样品至少挑取20个木霉菌落，分别转接到PDA斜面培养基中，置于25℃的培养箱中培养5d，分离出木霉菌，获得纯培养物，即完成植物根际木霉菌分离；
其中步骤四中孟加拉红固体培养基是装有20mL孟加拉红固体培养基的9cm培养皿。
本实施例步骤一中采集样品是将浅根系的矮小植物整株挖出剪取根系，深根系的大型植物则挖取根际土壤。
本实施例步骤一中除去根系上附着的土壤，目的是保证分离的是此种植物根际微生物，而不是相近植物的根际微生物；步骤一中所用工具都要无菌，避免杂菌带入样品，使分离的木霉菌来源不清。
本实施例步骤二中摇床中摇动，目的是保证根际木霉菌能够溶到灭菌蒸馏水中。
本实施例步骤二中稀释：取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL样品原液，吸打混匀即为5倍稀释液；取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL 5倍稀释液，吸打混匀即为25倍稀释液；取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL 25倍稀释液，吸打混匀即为75倍稀释液。
本实施例步骤三中孟加拉红固体培养基由5g蛋白胨、10g葡萄糖、1g磷酸二氢钾、0.5g MgSO4·7H2O、100mL 1/3000孟加拉红溶液、0.1g氯霉素、15～20g琼脂和1000mL蒸馏水组成。
本实施例步骤四中观察获得的木霉菌落：木霉孢子的分生孢子较小，单个分生孢子的直径为(2.5～4.5)×(2～4)μm；单一分生孢子萌发产生的菌落薄，菌丝伏在培养基表面，不易被看到。
木霉属的初步形态学鉴定：用解剖针挑取孢子，放于载玻片上，用显微镜仔细观察菌丝，分生孢子梗及分生孢子形态特征，并与木霉属真菌进行对比，实验结果：分离获得的20个菌株与木霉属形态特征相符，见图1，2，和3。
木霉种的ITS鉴定：利用PD液体培养基分别接种20个被分离的木霉菌株的孢子，25℃，200rpm，摇瓶培养3d，分别收集菌丝体，利用CTAB方法，提取木霉菌基因组DNA，利用基因组DNA为模板，利用ITS1和ITS4为引物进行ITS序列扩增。将20个木霉菌株的ITS序列插入T载体，转化大肠杆菌获得转化子，每个菌株分别选择10个转化子进行测序，保证分离的木霉为纯培养，避免与其它木霉菌交叉污染。序列测序后，利用国际真菌分类委员会木霉菌和肉座菌分会提供的在线鉴定软件进行分类鉴定http://www.isth.info/，每个木霉菌株的10个测序结果均为同种木霉。
结果：经鉴定灰绿藜根围分离的20株木霉菌中哈茨木霉8株、深绿木霉5株、绿色木霉3株，棘孢木霉3株，拟康宁木霉1株，哈茨木霉是灰绿藜根围优势木霉种。

Claims (8)

1.一种植物根际木霉分离方法，其特征在于它按以下步骤实现：
一、样品采集及处理：
采集：任意时间采集自然环境中的木本植物、草本植物、花卉、蔬菜或中草药的根系或根际土壤样品；
处理：浅根系的矮小植物：戴上灭菌的手套，除去根系上附着的土壤，利用灭菌的剪刀剪取100～200g根，装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得根系样品；深根系的大型植物：取10～20cm深处100～200g根际土壤装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得土壤样品；
二、超净工作台中，取30g根系样品或土壤样品放入装有100mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，封上瓶盖，在140r/min的摇床中摇动10min，获得样品原液，然后制备5倍、25倍、50倍和75倍的稀释液；
三、样品原液及其稀释液分别吸取200μL，利用灭过菌的涂布涂在孟加拉红固体培养基表面，各涂布10皿，共计50皿，置于25℃的培养箱中培养24～48h，获得木霉菌落；
四、在超净工作台中，观察获得的木霉菌落，每种样品至少挑取20个木霉菌落，分别转接到PDA斜面培养基中，置于25℃的培养箱中培养5d，分离出木霉菌，获得纯培养物，即完成植物根际木霉菌分离；
其中步骤四中孟加拉红固体培养基是装有20mL孟加拉红固体培养基的9cm培养皿。
2.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤一中的根系样品或土壤样品，若近期进行分离，则于4℃保存，若近期不进行分离，则于-20℃下保存。
3.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤一中剪刀剪取150g根。
4.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤一中取15cm深处150g根际土壤装入灭菌的聚丙烯塑料袋中，获得土壤样品。
5.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤二中制备稀释液：取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL样品原液，吸打混匀即为5倍稀释液；取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL 5倍稀释液，吸打混匀即为25倍稀释液；取灭菌的1.5mL离心管，加入800μL灭菌蒸馏水和200μL 25倍稀释液，吸打混匀即为75倍稀释液。
6.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤三中培养24～48h，这期间每隔4h在光线明亮的地方仔细观察一次木霉菌落，当发现木霉菌落时，立即将其转接到PDA斜面培养基中。
7.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤三中置于25℃的培养箱中培养36h。
8.根据权利要求1所述的一种植物根际木霉菌分离方法，其特征在于所述步骤三中孟加拉红固体培养基由5g蛋白胨、10g葡萄糖、1g磷酸二氢钾、0.5g MgSO4·7H2O、100mL1/3000孟加拉红溶液、0.1g氯霉素、15～20g琼脂和1000mL蒸馏水组成。
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肖淑芹 等: "沈阳地区土壤木霉菌分类鉴定", 《北方园艺》 *

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