CN103243029A - 一种生防真菌绿木霉及其代谢产物的应用 - Google Patents

Abstract

一种生防真菌绿木霉SS161及其代谢产物的应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一种生防真菌绿木霉（Trichodermavirens）SS161，保藏号为CGMCCNo.7224。该菌株从水稻育秧盘中腐烂的稻草上分离得到，该菌株对多种病原真菌都表现出强烈的拮抗作用，其发酵产物对水稻有促生作用，其发酵产物中含有抑菌物。该菌株的分离为微生物源农药的研制和开发提供了优秀的出发菌株。

Description

一种生防真菌绿木霉及其代谢产物的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种生防真菌绿木霉SS161及其代谢产物的应用。 

背景技术

病害是农作物产量和质量重要影响因素，病害的防控是农业生产的关键环节之一。作为农作物病害防控的急先锋，化学杀菌剂具有经济、高效、方便、迅速等优点，一直是作物综合治理体系中不可缺少的部分，尤其在病害大流行或品种抗病性丧失期间更是主要依仗的防治手段。但是化学杀菌剂的毒性强、高残留、成本高和易产生抗药性等先天缺陷引发的环境及安全等问题，在生产上逐渐突显。与化学农药相比，微生物源农药具有选择性强、不易产生抗药性、低残留、高活性和生产原料来源丰富、成本低廉（发酵原料多为工农业生产有机废料）等优点，适应农药发展的趋势，符合现代农业可持续发展的要求，有望替代化学杀菌剂成为作物病害药剂防控的第一选择。 

木霉菌（Trichoderma spp.）广泛分布于土壤中，是一类重要的生防真菌，在作物土传、种传病害防治上潜力巨大。木霉菌因其在酶、抗生素及生防等方面的重要的经济生产价值而得到世界广泛的研究和关注。自从1932年木霉菌的菌寄生现象被发现以来（Weindling等，1932），关于木霉菌生防特性的研究越来越多。据报道，该属真菌至少对18个属20余种病原真菌和多种病原细菌有拮抗作用，已在世界范围内被成功用于植物病害防治（陈捷等，2011）。迄今为止，已有百余种木霉制剂问世，年销售额高达2.5亿美元，施用区域已及五大洲60多个国家和地区（陈捷等，2011， Lorito et al., 2010）。木霉已经广泛用于蔬菜、花卉、草坪、运动草皮、中药材、果园等经济作物及花生、大豆、棉花等旱作大田作物的土传病害防治上（Ding等，2003；孙虎等，2011；Harman等，2010）。 

腐霉（Pythium）、绵霉（Achlya）、疫霉（Phytophthora）、镰刀菌（Fusarium）和丝核菌（Rhizoctonia）等是常见水稻土传、种传病害病原菌， 而木霉是土壤容留病原菌的天然拮抗因子，土传病害发病较重的土壤中更易分离到拮抗能力强的生防木霉。本发明所描述菌株SS161即从水稻秧苗立枯病严重发生育秧盘中腐烂稻草上分离得到，对上述病原菌有显著的拮抗效果。 

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种生防真菌绿木霉SS161及其代谢产物的应用的技术方案。该菌株从水稻育秧盘中腐烂的稻草上分离得到，该菌株对多种病原真菌都表现出强烈的拮抗作用，其发酵产物对水稻有促生作用，其发酵产物中含有抑菌物。该菌株的分离为微生物源农药的研制和开发提供了优秀的出发菌株。 

所述的一种生防真菌绿木霉（Trichoderma virens）SS161，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日：2013年1月28日，保藏号：CGMCC No.7224。 

所述的一种生防真菌绿木霉SS161在防治水稻恶苗病、水稻立枯病、水稻纹枯病、水稻稻瘟病和水稻立枯病中的应用。 

所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治土传种传病害中的应用，所述的土传种传病指对腐霉（Pythium）、绵霉（Achlya）、疫霉（Phytophthora）、镰刀菌（Fusarium）和丝核菌（Rhizoctonia）属真菌引起的土传种传病害，所述的代谢产物为孢子、孢子粉或孢子悬浮液。 

所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治土传种传病害中的应用，其特征在于所述的代谢产物通过以下方法制得：绿木霉SS161接种固体PSA平板，28^oC培养7-15天，用无菌水洗下孢子，过滤去除菌丝，即为孢子悬浮液，孢子悬浮液冻干即为绿木霉SS161 孢子粉。 

所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治土传种传病害中的应用，其特征在于所述的代谢产物通过以下方法制得：绿木霉SS161接种液体PSB培养基，28^oC培养6-10天，滤去菌丝即为孢子悬浮液，孢子悬浮液冻干即为绿木霉SS161 孢子粉。 

所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治土传种传病害中的应用，其特征在于所述的代谢产物通过以下方法制得：营养液加入农用链霉素至终浓度为0.1%，带壳大麦或水稻谷粒在此营养液中浸8-12小时，装入两端开口的聚丙烯培养袋中，一端封口，121^oC，高压湿热灭菌15-20分钟，无菌操作台上自然冷却至室温，按照20-30:1的比例加入种子液，混匀；放置在培养室支架上，室温保持在29±1 ^oC，培养10-15天，期间不断翻动、混匀培养袋，将结块的大麦或谷粒，捏碎；培养结束后，将培养物倒出，捣碎，摊放无菌塑料薄膜上，在无菌室内，30-32 ^oC黑暗条件下阴干，带壳大麦或谷粒上布满分生孢子，机械破碎后得到孢子粉，用吐温含量在0.02-0.1%的无菌水洗下孢子，双层纱布过滤够即得到孢子悬浮液。 

上述的营养液含有：硝酸铵1.5g/L，磷酸氢二钾4.0g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钙0.8g/L，硫酸镁1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸铜0.03g/L，酵母粉40g/L，蔗糖50g/L； 

上述的种子液由绿木霉SS161接种液体PSB培养基培养三天后得到。

所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治植物真菌性病害中的应用，所述的植物真菌性病害指水稻恶苗病、水稻立枯病、水稻纹枯病、水稻稻瘟病和水稻立枯病，所述的代谢产物为活性代谢产物。 

所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治植物真菌性病害中的应用，其特征在于所述的代谢产物通过以下方法制得：代谢产物发酵培养基与种子液按照质量比20-30:1混合，在150转/分钟，28^oC下培养10-15天，培养液采用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪加热真空蒸发后获得膏状物即为活性代谢产物。 

所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物促进水稻发芽的应用，所述的代谢产物为孢子、孢子粉或孢子悬浮液。 

所述的一种生防真菌绿木霉SS161，其特征在于该菌株rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。 

所述的一种生防真菌绿木霉SS161，其特征在于该菌株转录延长因子的部分编码序列如SEQ ID NO：2所示。 

本发明为微生物农药的开发提供了一株生长速度快、产孢量大、纤维素降解能力强、适宜多种发酵基质、适合大规模发酵生产、抗杂菌污染、抗逆性强的生防菌株；本发明提供了该菌株孢子和孢子悬浮液的小量和大量制备方法，该方法可用来生产防治土传和种传病害的木霉孢子制剂；提供了利用绿木霉SS161获得活性代谢产物的方法，该代谢产物可以直接用于植物真菌性病害的防治。 

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。 

实施例1：生防真菌绿木霉（Trichoderma virens）SS161的分离鉴定 

取0.5-1克育秧盘中腐烂稻草（该稻草出自中国水稻研究所的试验田中），加入200ml无菌水，120转每分钟，28摄氏度震荡30min，静置10min后，取100微升上清液涂改良型马丁培养基平板（配方：KH₂PO₄ 1克，葡萄糖10克，MgSO₄·7H₂O 0.5克，蛋白胨5.0克，1/3000孟加拉红水溶液100ml，加1000ml水，自然pH值，临用时加链霉素溶液至终浓度0.003% ，添加18克琼脂，灭菌），28℃黑暗培养至菌落长出，单胞分离纯化后，利用对峙培养法测试各菌株对多种病原真菌的拮抗作用，其中菌株SS161的拮抗作用最强，进行下一步研究。

该菌株具有以下生物学特性： 

在PDA平板上生长迅速，24小时菌落直径可增长3cm，在PDA平板上的最适生长温度为30oC，气生菌丝卷毛装，白色至灰白色。菌落初无色，后由于分生孢子的产生逐渐变为绿色至墨绿色。菌落反面初无色，后逐渐变为暗黄色乃至黄褐色。菌丝透明，壁光滑，低龄培养物中即可见大量的厚垣孢子，大小为6.5-10.0×6.0-9.5μm。分生孢子梗半透明，多分枝，分枝多与孢子梗主轴呈直角。产孢细胞瓶形，内壁芽生瓶梗式产孢方式，瓶梗大小为6.5-9.5×3.0-4.5（最宽处）μm。分生孢子大量产生，墨绿色，呈椭球形，近圆形，大小为4.5-5.5×3.0-4.0μm。

该菌株rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。该菌株转录延长因子的部分编码序列如SEQ ID NO：2所示。 

综合菌株SS161培养特征、形态特征及rRNA基因和转录延长因子序列，该菌株被鉴定为绿木霉（Trichoderma virens），有性型为绿肉座菌（Hypocrea virens）。 

实施例2：绿木霉SS161菌种的活化培养 

取冻存的菌种接种于固体PDA培养基上，28℃培养至菌丝长满平板。用0.5cm打孔器，打取菌饼，供下述方案接种用。固体PDA培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

实施例3：绿木霉SS161 孢子粉和孢子悬浮液的制备方案一 

绿木霉SS161接种固体PSA平板，28℃培养7-15天，用无菌水洗下孢子，过滤去除菌丝，即为孢子悬浮液，孢子悬浮液冻干即为绿木霉SS161 孢子粉。该方案适合制备少量的孢子粉和孢子悬浮液供室内试验使用。固体PSA培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

实施例4：绿木霉SS161 孢子粉和孢子悬浮液的制备方案二 

绿木霉SS161接种液体PSB培养基，培养三天后得到种子液。28℃培养6-10天，滤去菌丝即为孢子悬浮液，孢子悬浮液冻干即为绿木霉SS161 孢子粉。该方案适合制备少量的孢子粉和孢子悬浮液供室内试验及小规模试验使用以及制备种子液供固体发酵用。固体PSB培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL。

实施例5：绿木霉SS161 孢子和孢子悬浮液的制备方案三 

营养液加入农用链霉素至终浓度为0.1%，带壳大麦或水稻谷粒在此营养液中浸8-12小时。装入两端开口的PP（聚丙烯）培养袋中，一端封口，121℃，高压湿热灭菌15-20分钟，无菌操作台上自然冷却至室温，按照质量比20-30:1的比例加入种子液（实施例4制得），混匀，放置在培养室支架上，室温保持在29±1℃，培养10-15天，期间不断翻动、混匀培养袋，将结块的大麦或谷粒，捏碎以利于产孢。培养结束后，将培养物倒出，捣碎，摊放无菌塑料薄膜上，在无菌室内，30-32℃黑暗条件下阴干。带壳大麦或谷粒上布满分生孢子可直接施与土壤中用于土传和种传病害防治。也可机械破碎做成孢子粉，用于处理土壤。用吐温含量在0.02-0.1%的无菌水洗下孢子，双层纱布过滤够即为分生孢子悬液。此方法适合制备大量的孢子和孢子悬浮液供田间试验使用。

营养液配方：硝酸铵1.5g/L，磷酸氢二钾4.0g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钙0.8g/L，硫酸镁1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸铜0.03g/L，酵母粉40g/L，蔗糖50g/L。 

实施例6：绿木霉SS161活性代谢产物的发酵与提取 

代谢产物发酵培养基按照质量比20-30:1的比例加入种子液（实施例4制得），150转/分钟，28℃培养10-15天。培养液采用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪加热真空蒸发后获得膏状物即为活性代谢产物。

试验例1：绿木霉SS161对多种病原真菌的拮抗作用 

本发明于2010年水稻育秧盘中从腐烂的稻草上，分离到绿木霉SS161，并利用对峙培养法测试其对多种病原真菌的拮抗作用。

将活化后的绿木霉SS161和其它病原真菌（见表1）分别接种PDA培养基，28℃培养培养至菌落直径达到左右4cm，用内径为0.5cm的打孔器在菌落外源切下菌饼，然后将菌饼（有菌丝的一面）移贴至一个新的8cm PDA平板上，菌饼放置在离平板边缘2cm处，沿平板直径一侧放绿木霉菌株SS161，另一侧一种放病原真菌，仅接种病原真菌的PDA平板作对照。对峙培养5-7天后，十字交叉法病原菌测菌落直径，按照以下公式计算绿木霉对该病原真菌的抑制率。 

表1 绿木霉SS161对多种病害病原真菌的拮抗作用 

结果表明：绿木霉SS161对多种病原真菌都有较好的拮抗效果，表现出较广的拮抗菌谱（表1）。

试验例2：绿木霉SS161孢子对旱育秧水稻立枯病的防治效果 

1绿木霉SS161孢子的制备：按照实施例5的方法制备得到。

2实验设计： 

处理一：绿木霉SS161处理育秧土至105个孢子每克土壤。

处理二：20%地菌灵600倍液处理育秧土。 

处理三：加入处理一等量不带孢子的大麦混匀。 

种子采用上一年保存的带菌种子，品种为秀水09，分别与处理后7天，14天，21天后播种，播种后温室加温育秧，秧苗长到2.5-3叶期调查发病率。防效按照下列公式计算： 

 

表2绿木霉SS161孢子对旱育秧水稻立枯病的防治效果

*：同列数据后不同小写字母表示0.05水平下差异显著。

3结果表明：绿木霉SS161孢子对旱育秧水稻立枯病有较高的防治效果，处理土壤7天和14天后播种，绿木霉SS161孢子和对照药剂20%地菌灵防效都达到了70%以上且差异达不到显著水平。而处理土壤21天后绿木霉SS161孢子的防效显著大于对照药剂20%地菌灵，说明绿木霉SS161孢子的持效期较对照药剂地菌灵长。而水稻立枯病是由腐霉（Pythium）、绵霉（Achlya）、疫霉（Phytophthora）、镰刀菌（Fusarium）和丝核菌（Rhizoctonia）属真菌引起的土传种传病害，因此绿木霉SS161孢子能够防治腐霉（Pythium）、绵霉（Achlya）、疫霉（Phytophthora）、镰刀菌（Fusarium）和丝核菌（Rhizoctonia）属真菌引起的土传种传病害。 

试验例2中试验材料改成通过实施例3制备得到的绿木霉SS161孢子粉和孢子悬浮液、实施例4制备得到的绿木霉SS161孢子粉和孢子悬浮液或实施例5制备得到的孢子悬浮液进行与试验例相同的条件的试验，其最后均能达到与试验例2相同的技术效果。 

试验例3：绿木霉SS161发酵液对水稻发芽的影响 

1绿木霉SS161发酵液的制备

绿木霉SS161接种液体PSB培养基， 28℃培养10天，滤去菌丝，然后再用0.45微米孔径硝酸纤维素过滤，滤过液为发酵液用于本实例。

2试验设计 

水稻种子选择品种秀水09，嘉禾218，lemont品种的大小一致，饱满的种子。

处理一：发酵液稀释200倍浸种48h 

处理二：发酵液稀释500倍浸种48h

对照：清水浸种48h

在150cm培养皿垫上多层吸水纸，每平皿放500粒种子，每处理中各个品种分别重复3次，48小时后统计发芽率，期间不断洒水保湿。

表3 绿木霉SS161发酵液对水稻种子发芽率的影响 

*：同列数据后不同小写字母表示0.05水平下差异显著。

结果表明：绿木霉SS161发酵液浸种对水稻种子的发芽有一定促进作用，500倍发酵液较200倍发酵液的促进作用更强一些。而且，发酵液处理的种子和对照相比秧苗长势旺盛、整齐、叶色嫩绿，根多而长，说明绿木霉SS161发酵液对水稻种子还有一定的促生作用。 

试验例4：绿木霉SS161活性代谢产物对水稻纹枯病的防治效果 

1试验条件 

试验地点在中国水稻研究所的试验田，供试作物为水稻（秀水09）。所有试验小区的培养条件均匀一致。

2试验设计 

试验共设5个处理，每个处理设3个重复，每个试验小区的面积约25平米。

（1）13%井冈霉素水剂100ml/亩（对照药剂） 

（2）活性代谢产物10g/亩

（3）活性代谢产物13g/亩

（4）活性代谢产物15g/亩

（5）空白对照50kg水/亩。

活性代谢产物通过实施例的方法制备得到。 

3施药与调查 

分蘖盛期纹枯病发病初期第一次打药，孕穗后期-抽穗扬花期打第二次药，手动喷雾器，每亩制剂用药量兑水50kg，均匀粗喷雾在水稻中下部茎秆、叶鞘。1次药后15天，2次药后14天调查纹枯病防效。每处理对角线法定5点，每点1尺2，调查各处理总株数、病株数、病情严重度，计算病株率、病情指数和防效。

4试验结果： 

*：不同小写字母表示0.05水平下差异显著。

在该试验中，活性代谢产物对水稻纹枯病表现较好的防治效果。从第一次施药后调查结果来看，活性代谢产物10g/亩防治效果就显著高于13%井冈霉素水剂100ml/亩（有效成分13g/亩），而井冈霉素长期以来都是我国水稻纹枯病防治的主力药剂。从第二次施药后调查结果来看，活性代谢产物13克/亩的剂量防治效果略优于13%井冈霉素水剂100ml/亩（有效成分13g/亩），但差异达不到显著水平，说明二者防效相当。试验结果表明，绿木霉SS161活性代谢产物对水稻纹枯病防治表现出理想的防治效果。 

试验例4中，绿木霉SS161活性代谢产物对水稻恶苗病、水稻纹枯病、水稻稻瘟病进行防治试验，都取得较好的防治效果，具体试验方法如试验例4所述，不在此赘述。 

 <110>  中国水稻研究所

 

<120>  一种生防真菌绿木霉SS161及其代谢产物的应用

 

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<213>  生防真菌绿木霉SS161

 

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<213>  生防真菌绿木霉SS161

 

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Claims (10)

1.一种生防真菌绿木霉（Trichoderma virens）SS161，保藏号为CGMCC No.7224。

2.如权利要求1所述的一种生防真菌绿木霉SS161在防治水稻恶苗病、水稻立枯病、水稻纹枯病、水稻稻瘟病和水稻立枯病中的应用。

3.如权利要求1所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治土传种传病害中的应用，所述的土传种传病指对腐霉（Pythium）、绵霉（Achlya）、疫霉（Phytophthora）、镰刀菌（Fusarium）和丝核菌（Rhizoctonia）属真菌引起的土传种传病害，所述的代谢产物为孢子、孢子粉或孢子悬浮液。

4.如权利要求3所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治土传种传病害中的应用，其特征在于所述的代谢产物通过以下方法制得：绿木霉SS161接种固体PSA平板，28^oC培养7-15天，用无菌水洗下孢子，过滤去除菌丝，即为孢子悬浮液，孢子悬浮液冻干即为绿木霉SS161 孢子粉。

5.如权利要求3所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治土传种传病害中的应用，其特征在于所述的代谢产物通过以下方法制得：绿木霉SS161接种液体PSB培养基，28^oC培养6-10天，滤去菌丝即为孢子悬浮液，孢子悬浮液冻干即为绿木霉SS161 孢子粉。

6.如权利要求3所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治土传种传病害中的应用，其特征在于所述的代谢产物通过以下方法制得：营养液加入农用链霉素至终浓度为0.1%，带壳大麦或水稻谷粒在此营养液中浸8-12小时，装入两端开口的聚丙烯培养袋中，一端封口，121^oC，高压湿热灭菌15-20分钟，无菌操作台上自然冷却至室温，按照质量比20-30:1的比例加入种子液，混匀；放置在培养室支架上，室温保持在29±1 ^oC，培养10-15天，期间不断翻动、混匀培养袋，将结块的大麦或谷粒，捏碎；培养结束后，将培养物倒出，捣碎，摊放无菌塑料薄膜上，在无菌室内，30-32 ^oC黑暗条件下阴干，带壳大麦或谷粒上布满分生孢子，机械破碎后得到孢子粉，用吐温含量在0.02-0.1%的无菌水洗下孢子，双层纱布过滤够即得到孢子悬浮液；

上述的营养液含有：硝酸铵1.5g/L，磷酸氢二钾4.0g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钙0.8g/L，硫酸镁1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸铜0.03g/L，酵母粉40g/L，蔗糖50g/L；

上述的种子液由绿木霉SS161接种液体PSB培养基培养三天后得到。

7.如权利要求1所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治植物真菌性病害中的应用，所述的植物真菌性病害指水稻恶苗病、水稻纹枯病、水稻稻瘟病和水稻立枯病，所述的代谢产物为活性代谢产物。

8.如权利要求1所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物在防治植物真菌性病害中的应用，其特征在于所述的代谢产物通过以下方法制得：代谢产物发酵培养基与种子液按照质量比20-30:1混合，在150转/分钟，28^oC下培养10-15天，培养液采用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，利用旋转蒸发仪加热真空蒸发后获得膏状物即为活性代谢产物；

上述的代谢产物发酵培养基配方：硝酸铵1g/L，磷酸氢二钾8.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钙0.8g/L，硫酸镁1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锌0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸铜0.03g/L，蔗糖60g/L。

9.如权利要求1所述的一种生防真菌绿木霉SS161产生的代谢产物促进水稻发芽的应用，所述的代谢产物为孢子、孢子粉或孢子悬浮液。

10.如权利要求1所述的一种生防真菌绿木霉SS161，其特征在于该菌株rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示，该菌株转录延长因子的部分编码序列如SEQ ID NO：2所示。