CN112889578A - 一种干巴菌菌种及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种干巴菌菌种的制备方法，其包括，将干巴菌育种菌块干燥，确保干巴菌子实体双核菌丝灭活，但干巴菌孢子具有萌发繁殖活性；用第一氨基酸液体浸泡软化干燥后的干巴菌育种菌块；将浸泡软化后的干巴菌育种菌块接种至树脂‑氨基酸复合培养基中培养，获得干巴菌单核菌丝；添加诱导培养液，接入干巴菌单核菌丝培养，诱导融合为干巴菌双核菌丝，获得具有发育成干巴菌子实体能力的干巴菌菌种。本发明通过诱导干巴菌菌丝核配融合，最后获得具有发育成干巴菌子实体能力的菌种，为干巴菌资源和其他野生菌资源的开发提供了借鉴。

Description

一种干巴菌菌种及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于菌种培养技术领域，涉及一种干巴菌菌种，具体涉及一种干巴菌菌种及其制备方法与应用。

背景技术

干巴菌是一种珍稀野生食用菌。这种菌没有菌盖和菌褶，簇生如牛牙状，故俗称为牛牙齿菌。刚出土时呈黄褐色，老熟时变成黑褐色而且有一股酷似腌牛肉干(俗称干巴)的浓郁香味，故此菌得名干巴菌。野生干巴菌的产量有限，探索其人工或半人工栽培方法自然成为人们关注的问题。

傅四清等人探究了不同培养基、温度和pH值对干巴菌菌丝的生长影响，得出干巴菌菌丝在马铃薯培养基中生长最好，最适温度为24～26℃，最适pH值为6～7(干巴菌菌丝生长条件的研究，1997)。陈毅坚等人开展了干巴菌半人工栽培培养基的试验研究和培养技术探索(中国食用菌，2006，25(1)：33～35)。杨丽源等人通过组织分离、单孢分离和多孢分离方法探究了干巴菌的分离方法，通过对比试验获知，用组织分离法得到的菌落长势优于单孢分离和多孢分离，饱子分离法却不大适合于干巴菌(干巴菌分离方法的研究，1998)。

专利CN104381023A提供了一种干巴菌菌种分离培养方法，将采集的干巴菌子实体进行表面灭菌处理，切取干巴菌子实体置入干巴菌组织分离培养基中培养，再接种至干巴菌固体培养基培养得到能够发育成子实体的干巴菌菌种。专利CN103828601A公开了一种干巴菌菌种的分离方法，通过比较组织分离法、孢子分离法和空气传导分离法得出，组织分离法无法将酵母菌和其它真菌分开，此方法没有获得纯干巴菌菌丝体；孢子分离法虽然获得了大量的干巴菌担孢子，但担孢子在PDA培养上，经3个月培养不萌发；使用空气传导分离法有效地避开了干巴菌中的酵母菌、细菌和其它真菌等微生物，可以获得纯干巴菌菌丝体，是分离干巴菌菌种的一种简便、易操作的成功方法。专利CN102939857A公开为了一种野生干巴菌扩繁方法，包括选择有干巴菌的生长环境、通过挖沟、挖塘、铲草、牛犁、牛踏等造成菌丝自然侵染、采集子实体、纯化培养菌种、人工菌丝侵染扩繁，有利于野生干巴菌的人工规模化生态栽培。

通过分析有关干巴菌菌种分离培养的相关文献可知，(1)通过常规的真菌PDA培养基难以分离获得具有发育成干巴菌子实体能力的干巴菌菌种；(2)本领域研究人员倾向于采用组织分离法获取干巴菌菌种，但难以通过组织分离的方法获得干巴菌子实体上的双核菌丝；(3)由于干巴菌菌丝中存在顶体，且菌丝中生物酶含量较高，对外加刺激的应急明显，不容易通过组织分离方法获得，或者组织分离获得了单倍体和双倍体混杂菌丝，不利于子实体的形成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干巴菌菌种的制备方法，以解决上述技术问题。为了解决上述问题，本发明采取的技术思路为：通过杀灭干巴菌菌体的双核菌丝和污染菌，使得干巴菌中的子囊孢子被留存下来，再通过刺激和培养干巴菌孢子萌发获得单核菌丝，该单核菌丝为纯单核菌丝，不具有发育成为子实体的能力；再通过添加特定的培养基培养，诱导单核菌丝融合成为双核菌丝，经过镜检筛分，最终获得具有发育成为子实体的双核菌丝。

具体地，本发明给出一种干巴菌菌种的制备方法，其包括，

将干巴菌育种菌块干燥，确保干巴菌子实体双核菌丝灭活，但干巴菌孢子具有萌发繁殖活性；

用第一氨基酸液体浸泡软化干燥后的干巴菌育种菌块；

将浸泡软化后的干巴菌育种菌块接种至树脂-氨基酸复合培养基中培养，获得干巴菌单核菌丝；

添加诱导培养液，接入干巴菌单核菌丝培养，诱导融合为干巴菌双核菌丝，获得具有发育成干巴菌子实体能力的干巴菌菌种。

进一步地，本发明所述干巴菌菌种的制备方法，还包括所述干巴菌双核菌丝的分离与培养，即用树脂-氨基酸复合培养基倒平板划线分离所述干巴菌双核菌丝，将分离出的所述干巴菌双核菌丝分散于第二氨基酸液体，形成氨基酸含菌液，将氨基酸含菌液接入固体培养基培养。

作为本发明技术方案的优选实施例之一，所述第一氨基酸液体和第二氨基酸液体相同或不同，所述氨基酸选用谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸中的任一种或多种，所述氨基酸在所述第一氨基酸液体和第二氨基酸液体中的质量份数为1～15％。

本发明进一步明确了所述树脂-氨基酸复合培养基的组分，即每100质量份包含氨基酸2～8份、麦芽糖2～8份、树脂溶胶5～25份、磷酸二氢钾0.1～1.0份、琼脂0.1～2.5份、余量为水；所述氨基酸选用谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸中的任一种。

本发明进一步明确了所述树脂溶胶的制备方法为：将1～5g树脂热溶于乙醇，制备成乙醇树脂溶液；将乙醇树脂溶液逐滴加入60～80℃热水中，减压回收乙醇，即得所述树脂溶胶。优选地，所述树脂选用松树天然树脂中的任一种。需要说明的是，本发明并不限定松树的具体树种种类、适宜的种植区域及生长环境条件。比如，所述松树天然树脂可以是云南松、华山松的树干、枝条、木条、松针、松球含有的天然树脂中的任一种。本发明并不限定这种天然树脂的制备方法和添加的方式，比如，包括以化学提取或以与原材料添加的方式加入。

作为本发明技术方案的优选实施例之一，所述固体培养基的组分，每100质量份松针粉碎物配伍谷氨酸1～20份、天冬氨酸1～15份、麦芽糖0.5～7份、磷酸二氢钾0.2～2份、硫酸锌0.1～0.5份、硫酸镁0.2～1份。

本发明进一步对所述干巴菌菌种的制备方法做出详实阐述，其具体包括，

将干巴菌育种菌块烘干，确保干巴菌子实体双核菌丝灭活，但干巴菌孢子具有萌发繁殖活性，实现干巴菌菌体细胞与孢子的分离；

对干巴菌育种菌块表面进行火焰灭菌，将灭菌后的巴菌育种菌块切成较小的菌块；

用第一氨基酸液体浸泡菌块，使得菌块软化，干巴菌孢子吸水和氨基酸；

将浸泡软化后的菌块接种至树脂-氨基酸复合培养基，斜面培养，镜检，获得干巴菌单核菌丝；

向灭菌后的诱导培养液接入干巴菌单核菌丝，培养一周，镜检，用树脂-氨基酸复合培养基倒平板划线分离诱导的干巴菌双核菌丝；

将分离出的干巴菌双核菌丝分散于第二氨基酸液体，形成氨基酸含菌液，将氨基酸含菌液接入固体培养基培养。

再者，本发明基于上述的制备方法，给出一种干巴菌菌种。这种干巴菌菌种采用本发明所述方法制备。

还有，本发明请求保护所述干巴菌菌种的应用，具体为所述干巴菌菌种在人工栽培干巴菌中的应用。

与现有技术相比，本发明所述干巴菌菌种及其制备方法与应用，具有以下有益效果或者优点。

(1)本发明开发了适宜干巴菌生长发育的特定培养基

关于干巴菌的培养基，现有技术多采用常规的真菌PDA培养基，或对其进行变通或改进制成功效近似的培养基培养干巴菌，虽然能使得干巴菌菌丝存活，但不具备形成子实体的能力，或者干巴菌子实体发育能力或长势较弱，不适合干巴菌的大规模人工栽培。本专利发明人通过详实、深入的研究发现，由于干巴菌在生态地位上属于固氮菌和分解菌，对硝态氮源的直接利用能力较弱，而对谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的利用效率相对较高。进一步的研究结果揭示，在漫长的真菌植物协同进化中，谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸是干巴菌所需氮源的运载体和干巴菌生长代谢的氨基酸原料。这也是干巴菌菌丝难以在人工条件下快速生长发育的原因。

本发明给出了一种树脂-氨基酸复合培养基，其组分包含氨基酸、麦芽糖、树脂溶胶、磷酸二氢钾、琼脂份和水；所述氨基酸选用谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸中的任一种，树脂溶胶由松树天然树脂为原料制备。特定氨基酸的选用，为干巴菌生长代谢提供了代谢原料和氨的运载体。此外，还提供了诱导培养液和固体培养基，松树天然树脂中的酚类物质可作为诱导干巴菌单核菌丝融合的外源刺激。

(2)本发明消除了本领域研发人员普遍存在的技术偏见

通过考察有关干巴菌菌种培养的文献发现，本领域研发人员普遍认为采用组织分离法获取干巴菌菌种是一种行之有效的手段，但由于干巴菌子实体中的其它真菌及杂菌难以彻底去除，致使难以获得纯的干巴菌菌种，不利于干巴菌的人工栽培和扩繁。另外，本领域研发人员还认为饱子分离法不适合于干巴菌菌种的培养。

本发明消除了本领域研发人员普遍存在的上述技术偏见，与现有技术不同的是，本发明采用特定的处理方式并配合适宜的培养基，通过干巴菌孢子萌发获得纯的单核菌丝，经诱导融合获得纯双核菌丝，为干巴菌子实体的发育创造了条件。

(3)本发明为干巴菌人工栽培创造了条件

基于现有研究成果和本领域研究人员的认知，目前还难以实现大规模的干巴菌人工或半人工栽培。本发明提供了干巴菌菌种的制备方法，并给出了干巴菌的单核菌丝和双核菌丝转化的技术关键，采用本发明所述方法可以获得能产生干巴菌子实体的双核菌丝，为干巴菌资源和其他野生菌资源的开发提供了借鉴。

附图说明

图1为在培养皿中26℃培养3天的干巴菌菌落。

图2为在试管中26℃培养3天的干巴菌菌落。

图3为在试管中26℃培养15天的干巴菌菌落。

具体实施方式

下面，结合附图对本发明的技术方案进行说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明内容所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本实施例提供了一种干巴菌菌种的制备方法，具体步骤为：

(1)10月1日-10月15日挑选干净、无杂质、完整的干巴菌育种菌块，将干巴菌育种菌块在25℃-35℃下烘干，杀灭干巴菌子实体双核菌丝，确保干巴菌子实体双核菌丝灭活，但干巴菌孢子具有萌发繁殖活性，实现干巴菌菌体细胞与孢子的分离；

在本步骤中，干巴菌育种材料的选择，优选为适宜干巴菌生长的时间期，本步骤选用10月1日-10月15日生长的干巴菌仅为一种优选的方式，并不表示这个时间期之外的干巴菌并不适用本发明。

关于干巴菌子实体的烘干方式，本实施例不做特别的限定，本步骤采用低温25℃-35℃烘干，并不表示其余干燥方式并不适用本发明。这一操作的目的是杀灭干巴菌子实体双核菌丝，但干巴菌孢子具有萌发能力。

(2)对干巴菌育种菌块表面进行火焰灭菌，将灭菌后的干巴菌育种菌块切成较小的菌块；

在本步骤中，火焰灭菌只是实现干巴菌育种菌块表面灭菌的诸多方式之一，其余杀菌方式同样适用于本发明。

(3)用质量份数为1～15％的氨基酸液体(溶液)浸泡菌块，使得菌块软化，干巴菌孢子吸水并获得氨基酸；

在本步骤中，所述氨基酸选用谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸中的任一种或多种。浸泡菌块的主要目的在于促使干巴菌孢子萌发，并为干巴菌孢子提供的特定的氨基酸营养物质。通过本专利发明人的研究获知，氨基酸营养物质的选定是干巴菌孢子萌发的关键因素之一。

(4)将浸泡软化后的菌块接种至树脂-氨基酸复合培养基中，斜面培养，镜检，获得干巴菌单核菌丝；

其中，所述的树脂-氨基酸基质的斜面试管培养基，每100质量份包含氨基酸2～8份、麦芽糖2～8份、树脂溶胶5～25份、磷酸二氢钾0.1～1.0份、琼脂0.1～2.5份、余量为水；所述氨基酸选用谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸中的任一种。在本实施例中，所述的树脂-氨基酸基质的斜面试管培养基，具体包含以下组分：天冬氨酸2g、麦芽糖5g、树脂溶胶5g、磷酸二氢钾0.1g、琼脂0.1g、水87.8g。

将上述组分充分混匀，移入试管中，加入少量棉塞堵住试管口(避免完全将试管口封堵)，灭菌后摆成45°斜面，即得到树脂-氨基酸基质的斜面试管培养基。

其中，所述树脂溶胶的制备方法为：将1g～5g松树天然树脂热溶于10mL50％的乙醇中，制备成乙醇树脂溶液；将乙醇树脂溶液逐滴加入60℃～80℃热水中，减压回收乙醇，即得所述树脂溶胶。

经DNA比对和ITS测序，采用本实施例所述方法获得干巴菌的单核菌丝。显微镜镜检观察到有多个菌丝，单核菌丝顶端多个隔膜且较中间菌丝粗大，分支较多，与双核菌丝相比为分支角度较小(一般在25°～60°之间)。显微镜镜检观察结果与现有文献相符，在此不做详细阐述。

(5)向灭菌后的诱导培养液接入干巴菌单核菌丝，培养一周得到双核菌丝菌落。其镜检结果可以看出，双核菌丝在平板中呈现黑色菌落，向四周蔓延，显微镜镜检有H型联合和锁状联合，分支接近90°，然后用树脂-氨基酸复合培养基倒平板划线分离诱导的干巴菌双核菌丝。显微镜镜检观察结果与现有文献相符，在此不做详细阐述。

所述诱导培养液的组分，每100质量份包含氨基酸0.1～15份、树脂溶胶5～15份、硫酸镁0.1～0.5份、余量为水；所述氨基酸选用谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸中的任一种。在本实施例中，所述的诱导培养液，具体包含以下组分：谷氨酸8g、树脂溶胶10g、硫酸镁0.3g。

所述树脂溶胶的制备方法为：将1～5g树脂热溶于乙醇，制备成乙醇树脂溶液；将乙醇树脂溶液逐滴加入60～80℃热水中，减压回收乙醇，即得所述树脂溶胶；所述树脂选用松树天然树脂。

(6)将分离出的干巴菌双核菌丝分散于质量份数为1～15％的氨基酸液体(溶液)中，形成氨基酸含菌液，将氨基酸含菌液接入固体培养基培养得到干巴菌。

在本步骤中，所述氨基酸选用谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸中的任一种或多种。

所述固体培养基的组分，每100质量份松针粉碎物配伍谷氨酸1～20份、天冬氨酸1～15份、麦芽糖0.5～7份、磷酸二氢钾0.2～2份、硫酸锌0.1～0.5份、硫酸镁0.2～1份。具体地，在本实施例中，所述的固体培养基，具体包含以下组分：松针100g、谷氨酸10g、天冬氨酸8g、麦芽糖5、磷酸二氢钾1.1g、硫酸锌0.3g、硫酸镁0.6g。

采用本发明实施例，在固体培养基获得的干巴菌菌落参见图1-3。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种干巴菌菌种的制备方法，其特征在于，包括，

将干巴菌育种菌块干燥，确保干巴菌子实体双核菌丝灭活，但干巴菌孢子具有萌发繁殖活性；

用第一氨基酸液体浸泡软化干燥后的干巴菌育种菌块；

将浸泡软化后的干巴菌育种菌块接种至树脂-氨基酸复合培养基中培养，获得干巴菌单核菌丝；

添加诱导培养液，接入干巴菌单核菌丝培养，诱导融合为干巴菌双核菌丝，获得具有发育成干巴菌子实体能力的干巴菌菌种。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括所述干巴菌双核菌丝的分离与培养，即用树脂-氨基酸复合培养基倒平板划线分离所述干巴菌双核菌丝，将分离出的所述干巴菌双核菌丝分散于第二氨基酸液体，形成氨基酸含菌液，将氨基酸含菌液接入固体培养基培养。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一氨基酸液体和第二氨基酸液体相同或不同，所述氨基酸选用谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸中的任一种或多种，所述氨基酸在所述第一氨基酸液体和第二氨基酸液体中的质量份数为1～15％。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述树脂-氨基酸复合培养基的组分，每100质量份包含氨基酸2～8份、麦芽糖2～8份、树脂溶胶5～25份、磷酸二氢钾0.1～1.0份、琼脂0.1～2.5份、余量为水；所述氨基酸选用谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸中的任一种。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述树脂溶胶的制备方法为：将1～5g树脂热溶于乙醇，制备成乙醇树脂溶液；将乙醇树脂溶液逐滴加入60～80℃热水中，减压回收乙醇，即得所述树脂溶胶；所述树脂选用松树天然树脂。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述诱导培养液的组分，每100质量份包含氨基酸0.1～15份、树脂溶胶5～15份、硫酸镁0.1～0.5份、余量为水；

所述氨基酸选用谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸中的任一种；

所述树脂溶胶的制备方法为：将1～5g树脂热溶于乙醇，制备成乙醇树脂溶液；将乙醇树脂溶液逐滴加入60～80℃热水中，减压回收乙醇，即得所述树脂溶胶；所述树脂选用松树天然树脂。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述固体培养基的组分，每100质量份松针粉碎物配伍谷氨酸1～20份、天冬氨酸1～15份、麦芽糖0.5～7份、磷酸二氢钾0.2～2份、硫酸锌0.1～0.5份、硫酸镁0.2～1份。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括，

将干巴菌育种菌块烘干，确保干巴菌子实体双核菌丝灭活，但干巴菌孢子具有萌发繁殖活性，实现干巴菌菌体细胞与孢子的分离；

对干巴菌育种菌块表面进行火焰灭菌，将灭菌后的巴菌育种菌块切成较小的菌块；

用第一氨基酸液体浸泡菌块，使得菌块软化，干巴菌孢子吸水和氨基酸；

将浸泡软化后的菌块接种至树脂-氨基酸复合培养基，斜面培养，镜检，获得干巴菌单核菌丝；

向灭菌后的诱导培养液接入干巴菌单核菌丝，培养一周，镜检，用树脂-氨基酸复合培养基倒平板划线分离诱导的干巴菌双核菌丝；

将分离出的干巴菌双核菌丝分散于第二氨基酸液体，形成氨基酸含菌液，将氨基酸含菌液接入固体培养基培养。

9.一种干巴菌菌种，其采用权利要求1至8中任一项所述方法制备。

10.权利要求9所述干巴菌菌种在人工栽培干巴菌中的应用。

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