JPS6312278A - 新規アルコ−ルデヒドロゲナ−ゼ複合体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は４，５−ジヒドロ−４，５−ジオキソ−１Ｈ−
ピロロ（２，３−ｆ）キノリン−２，７，９−トリカル
ボン酸（以下ＰＱＱと略す）を含有し、炭素数２以上の
アルコール、ホルムアルデヒドおよびアセトアルデヒド
を広範囲のｐｌ＋で酸化することができる安定性の著し
く高い新規なアルコールデヒドロゲナーゼ複合体および
その製造方法に関する。

〔従来技術とその問題点〕

アルコールは人類と長い接触の歴史を”持つ物質であり
、本物質の定量法としては多くの方法がある。ガスクロ
マトグラフや酵素を用いる方法も実用化されてきたが、
近年バイオエレクトロニクスの進歩により酵素センサー
なるものも研究され始め、エタノールの定量にもアルコ
ールデヒドロゲナーゼを固定化したセンサーを用いる方
法が提案されている。しかし、これまでのものは安定性
に乏しく、この点が酵素センサー実用化の最も太きな問
題として残されてきた。

一方、従来広く知られている動物、植物、酵母由来のア
ルコールデヒドロゲナーゼはニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ）あるいはニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素としてい
るが、（イ）反応のｐＨがアルカリ側であること、（０
）反応が可逆的であり、共存するアルデヒドによって測
定に大きな誤差が生じること、（ハ）比較的高価なＮＡ
Ｄ。

ＮＡＤＰを使用することなどの点で、強い酸性を示す酢
酸発酵過程でのエタノール定量や酸性域で強い緩衝能を
有する醸造食品中や清酒発酵中のエタノール定量の際に
は不適当であった。

近年、酸性域でのみ活性を示し、反応がアルコールの酸
化方法にのみに偏った新しいアルコールデヒドロゲナー
ゼが酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌およびＧｌ
ｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属細菌）より得られているもの
の（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、４２．２
０４５〜２０５６（１９７８）；　同婬、　２０６３〜
２０６９（１９７８）　；同弧、　２３３１〜２３４０
（１９７８））　、強い酸性域での酵素の安定性に問題
がある。上記の既に知られている酢酸菌のアルコールデ
ヒドロゲナーゼをｐＨ３、温度４℃、４日放置すると、
残存活性は０−１０％まで低下する。したがって、通常
ｐＨ３前後の非常に低いｐＨで行なわれる酢酸発酵での
アルコール連続長期定量には使用できない。

本発明者らは上述のアルコールデヒドロゲナーゼが実際
の食酢醸造には用いられていない酢酸菌から得られてい
る事実に着目し、高濃度の酢酸存在下でも高い酢酸発酵
能を示す酢酸菌であるならば、従来の酵素よりもはるか
に耐酸性に優れたアルコールデヒドロゲナーゼを生産す
るものと予想した。そこで、広範囲のｐＨ域でアルコー
ルに作用し、かつ安定性の高いアルコールデヒドロゲナ
ーゼの探索を目的として、比較的高濃度の酢酸存在下で
も良好な生育を示し、しかも高い酢酸発酵能（アルコー
ル酸化能）を有する酢酸菌のアルコールデヒドロゲナー
ゼについて検討した。その結果、アセトバクター・アル
トアセチゲネス（Ａｃｅ　ｔｏｂａｃ　ｔｅｒａｌｔｏ
ａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ）　Ｍｌ（−２４（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−４９１）やアセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ）（ＩＦＯ３２８８）
に代表されるアセトバクター属に属する一群の酢酸菌が
広いｐｌ＋領域で変わらぬ活性を示し、さらにｐＨ３を
含む高範囲のｐｉｔ域で活性を安定に保持する新規なア
ルコールデヒドロゲナーゼを生成する事実を見出した。

本発明はこれらの知見に基いて完成されたものである。

〔問題を解決するための手段〕

本発明は、以下の性質を有する新規アルコールデヒドロ
ゲナーゼ複合体、 ＋１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測
定した分子量が約７２，０００および約４４，０００の
蛋白質を含む酵素複合体であり、 （２）４，５−ジヒドロ−４，５−ジオキソ−１Ｈ−ピ
ロロ（２，３−ｆ）キノリン−２，７，９−トリカルボ
ン酸を含有し、 （３）炭素数２以上のアルコール、ホルムアルデヒド、
アセトアルデヒドのそれぞれを基質として酸化し、 （４）界面活性剤により細胞質膜より可溶化される を提供し、さらにアセトバクター属に属し、上記酵素複
合体を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物か
ら該複合体を採取することを特徴とする上記酵素複合体
の製造法を提供するものである。

次に、本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ複合体の性
質を示す。

■）作用 本酵素は炭素数２以上のアルコールに作用して相当する
アルデヒドに酸化する。また、ホルムアルデヒド、アセ
トアルデヒドにも作用し、相当するカルボン酸に酸化す
る。

２）基質特異性 本酵素の基質特異性の例を第１表に示す。本酵素は直鎖
の１級アルコール、すなわちエタノール。

ｎ−プロパツール、ｎ−ブタノールなどを良好な基質と
して作用する。また、ホルムアルデヒド。

アセトアルデヒド、グリセルアルデヒドも酸化すること
ができる。しかし、メタノール、３−ブタノール、プロ
ピオンアルデヒド、ベンズアルテヒドなどのアルコール
、アルデヒド類には作用せず、各種糖類および有機酸に
も作用しない。

第１表 第１表（続き） ３）至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨはエタノールを基質とした場合、第１
図に示すように、ｐＨ５，５付近にある。

４）安定ｐＨ範囲 第２図に示すように、本酵素はｐＨ３，０から８．０で
５℃、１５時間放置後、はとんどすべての活性を有して
いる。５℃、１００時間放置後ではｐＨ３，０で約１５
％失活し、５℃、２４０時間放置後ではｐＨ３，０で約
５０％失活するものの、ｐＨ４，０以上ではほとんど失
活せず、きわめて安定な酵素である。なお、第２図の安
定ｐＨ曲線は各ｐＨに放置後の残存活性をｐＨ６，０で
測定したものである。

既知の酵素の例としてはアセトバクター・アセ５ｕｂｏ
ｘｙｄａｎｓ）ＩＰＯ１２５２Ｂから得られたアルコー
ルデヒドロゲナーゼを挙げることができるが（Ａｇｒｉ
ｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　、　４２．２０４５〜２０
５６（１９７８）；　同４２．２０６３〜２０６９　（
１９７８）　；　同婬、　２３３１〜２３４０（１９７
８））　、これらのアルコールデヒドロゲナーゼはｐＨ
３，４°ｃ、４日（約１００時間）放置するとほとんど
失活し、残存活性は０〜１０％まで低下する。以上の点
から、本酵素は従来の酢酸菌のアルコールデヒドロゲナ
ーゼよりも明らかに耐酸性に優れている。

５）作用適温の範囲 第３図に示すように、作用温度範囲は１０〜５０℃であ
り、特に４０°Ｃに最適温度を有する。

６）ｐＨ，温度による失活の条件 第４図に示すように、ｐＨ６，０で各温度１０分間処理
すると、４０℃までは失活せず、５０℃で約８０％失活
する。

７）阻害、活性化および安定化 １ｍＭ４度の水銀、銅、カドミウムなどの重金属イオン
により阻害される。

一方、アジ化ナトリウム、亜ヒ酸ナトリウム。

エチレンジアミン四酢酸によっては阻害されない。

８）分子量 ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００存在下、セファクリ
ルＳ−３００によるゲル濾過法から推定されるアルコー
ルデヒドロゲナーゼ複合体の分子量は約３４０．０００
である。

９）サブユニット 本酵素はディスクゲル電気泳動により単一バンドとなる
。本酵素はドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略
称する。）処理によって２成分に分けられる。５ＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動法で分子量標準蛋白質とし
てホスホリラーゼｂ（分子量９４，０００）、アルブミ
ン（分子量６７　、０００）　。

オブアルブミン（分子ｆｆｉ　４３，０００）、カルボ
ニンクアンヒドラーゼ（分子量３０，０００）、　　ト
リプシンインヒビター（分子量２０．１００）およびα
−ラクトアルブミン（分子量１４，４００）を含むファ
ルマシア製のキヤリプレーションキフトを用いた場合に
、本酵素の２成分の分子量は約７２．０００および約４
４．０００であった。また、本酵素はチトクロームに特
有な吸収スペクトルを示すことからチトクロームを構成
成分として含んでいることも明らかである。

上述したように、本発明の酵素は分子量約７２，０００
および約４４　、０００の２種類のサブユニットから構
成されているため、本酵素は複合酵素と見なされる。し
たがって、本酵素はアルコールデヒドロゲナーゼ複合体
と呼ぶのがふされしい。

既知の酵素の例としてはアセトバクター・アセチＩＦ０
３２８４およびグルコノバクタ−・サブオキシダンスＩ
ＦＯ１２５２８から得られたアルコールデヒドロゲナー
ゼを挙げることができるが（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　　、　４２．２０４５〜２０５６（１９７
８）　；　同４２．２０６３〜２０６９（１９７８）　
；同４２．２３３１〜２３４０（１９７８））　、前者
ノアルコールデヒドロゲナーゼは分子量６３，０００．
４４，０００゜２９．０００および１３，５００の４種
のサブユニットから構成されており、後者のアルコール
デヒドロゲナーゼは分子量８５，０００．４９，０００
および１４，４００の３種のサブユニットから構成され
ている。以上の点から、本酵素は従来の酢酸菌のアルコ
ールデヒドロゲナーゼとは明らかに異なる新規な酵素で
ある。

１０）色 本酵素溶液は赤色を呈する。

１１）可視部吸収スペクトル 本酵素の可視部吸収スペクトルを第５図に示す。

還元型のチトクローム成分は５５３ｎｍ、　　５２２ｎ
ｍ。

４１７ｎｍに、酸化型のチトクローム成分は４０９ｎｍ
にそれぞれ吸収極大を示す。

１２）熱水抽出画分の螢光スペクトル 本酵素の熱水抽出物の螢光スペクトルを第６図に示す。

本スペクトルおよびバイオアッセイにより、熱水抽出物
に４．５−ジヒドロ−４，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロロ
［２，３−ｆ）キノリン−２゜７．９−１リカルボン酸
（ＰＱＱ）が含まれていることが示された。

１３）Ｋｍ値 本酵素の反応速度定数Ｋｍはエタノールを基質とした場
合、約１．２ｘｌＯ−’Ｍであった。

１４）電子受容体 フェナジンメソサルフエイト（ＰＭＳ）、２．６−シク
ロロフエノールインドフエノール（Ｄ　ＣＩ　Ｐ）。

ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（Ｎ　Ｂ　Ｔ）
。

フェリシアン化カリウムなどが本酵素の電子受容体とな
りうるが、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、分子状酸素は電子受容体
と成りえない。

以上の性質から、本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ
複合体は、今までに知られているいずれのアルコールデ
ヒドロゲナーゼとも異なる新規な酵素である。

１５）精製方法 精製方法は製造方法に記載した。

次に、本酵素の製造方法について説明する。

本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ複合体の製造に使
用する細菌は、本酵素を生産するものであればいずれで
もよく、例えばアセトバクター（Ａｃｅ　ｔｏｂａｃ　
ｔｅｒ）属細菌を挙げることができる。具体例としてア
セトバクター・アルトアセチゲネス（Ａｃｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ　ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ）Ｍｌｌ−２４
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４９１）＋アセトバクター・キシリ
ナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　２）上国明）（ＩＦｏ
　３２８８）などを挙げることができる。

本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ複合体の製造に際
して使用する培地は前記の細菌が生育して、本酵素を生
産するものであればどのようなものでもよい。炭素源と
しては、たとえばグルコース、グリセロール、フラクト
ース、マンニトール。

酢酸等を使用することができ、窒素源としては、例えば
酵母エキス、カゼイン加水分解物、コーンステイープリ
カー、ペプトンなどの天然物やアンモニウム塩などが使
用できる。必要に応じて無機塩や各種の有機物、ビタミ
ン類、核酸関連化合物等を添加することができる。好ま
しくは培地にさらにエタノールを添加して酢酸発酵を行
わせしめれば、酵素の含量が増大し、容易に大量の酵素
を得ることができる。

培養に当っては固体培地を使用することもできるが、多
量の菌体を得るには液体培地を用いて通気攪拌培養また
は振とう培養を行うのが好ましい。

液体培養に当っては添加したエタノールが消費しつくさ
れないようにコントロールすること、酸素の供給を充分
に行うことが本酵素を効率よ（蓄積するのに効果的な場
合がある。培養においては、はじめから本培養を行うこ
ともできるが、大量培養を行う場合には、まず小規模な
前培養を行い、得られた培養物を本培地に接種するのが
好ましい。

培養温度、培養期間、培地の液性等は本発明の酵素の生
産量が最大になるように適当に選択、調節すればよいが
、通常は好気的条件下で２５〜３５℃において１〜３日
培養するのが好ましい。

本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ複合体は細菌菌体
内に蓄積されるため、本酵素の回収、精製のためにはま
ず菌体を集めて破砕する。本酵素は細胞質膜画分に局在
するため、適当濃度の界面活性剤、例えば非イオン性界
面活性剤を加えることにより可溶化する。可溶化された
本酵素は界面活性剤存在下でジエチルアミノエチル−セ
ファロース（以下、ＤＥＡＥ−セファロースと云う。）
などの各種イオン交換剤によるクロマトグラフィー、ハ
イドロキシアパタイト等の吸着クロマトグラフィーある
いはセファデックスなどを用いたゲル濾過法に代表され
る通常の酵素精製手段を単独もしくは適宜組合せて適用
し、任意に精製された本発明の酵素を得ることができる
。

次に、本発明の酵素の酵素活性測定方法について説明す
る。

本酵素の活性の測定は、前記の電子受容体のいずれを用
いても可能であるが、以下にそのうちの１例を示す。０
．１Ｍのフェリシアン化カリウム溶液０．１　ｍ　ｌ　
、　Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｐＨ６，０）　０．
７ｍｌおよび適当量の本酵素を加え、水で０．９ｎｌと
する。さらに、１Ｍエタノールン容ン夜を０．１ｍＮ加
えて反応を開始させ、３０℃で５〜１５分後、Ｆｅｒｒ
ｉｃｓｕｌｆａｔｅ−Ｄｕｐａｎｏｌ試薬（Ｗ、Ａ、Ｗ
ｏｏｄ他、　”　Ｍｅｔｈｏｄｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ″Ｖｏ１．　Ｖ、　２８７（１９６２）参照）０．
５＋ｎｊ！を加え反応を停止させた後、直ちに水を加え
て５Ｉ！ｌｌとする。３７℃、３０分放置後、６６０ｎ
ｍの吸光度を測定する。基質であるエタノールを加えな
いで上記と同様に反応せしめたサンプルとの吸光度の差
が酵素の活性を意味する。１μｍｏｌｅのエタノールを
１分間に酸化する酵素量を１単位とする。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１ グルコース３％、酵母エキス０．５％およびボリペプト
ン０．２％の液体培地を５００ｍｌ容の振とうフラスコ
にｌ　ＯＯ＋＋ｊ！ずつ分注し、オートクレーブ中で１
２０℃、１５分間殺菌した。冷却後、エタノールと酢酸
をエタノールは５％、酢酸は６％になるように添加した
。この培地にアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ
−２４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４９１）を５白金耳接種し、
往復振とう機上で３０℃にて４日間培養した。同じ組成
の培地２ＯＮを３０１のジャーファーメンタ−で作製し
、前記の培養液２）を接種して２０１／分で通気し、攪
拌しながら３０°Ｃにて２日間培養した。培養終了後、
培養液を５℃にて遠心分離することにより湿重量約２ｇ
の菌体を得た。

この菌体を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐ）１６
、Ｏ）に懸濁し、２０．０００　ｐｓｉでフレンチプＬ
／、２．を通し菌体を破砕した後、６８．ＯＯＯＸｇで
６０分間超遠心分離し、膜画分を沈澱として得た。この
沈澱を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０）
に懸濁した後、２０％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を最終
濃度が１．５％になるように加え、３時間攪拌した。こ
の液を再度６８，０ＯＯＸ　ｇで６０分間超遠心分離を
行い、本酵素が可溶化された上清を得た。この溶液を０
．１％ＴｒｉＬｏｎ　Ｘ−１００を含有する０、０１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロ
ースＣＬ−６Ｂを充てんしたカラムに注入し、本酵素を
吸着したのち０．ＯＩＭから０．１Ｍまでのリン酸カリ
ウム緩衝液で傾斜溶出した。０．０３Ｍ付近のリン酸カ
リウム緩衝液で溶出する活性画分を集め、０．１％Ｔｒ
ｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む０．０１Ｍリン酸カリウム
緩衝液に対して透析した。この透析液を０．１％Ｔｒｉ
ｔｏｎ　Ｘ−１００を含む０．０１Ｍリン酸カリウム緩
衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトを充てんした
カラムに注入、吸着させた。次いで、０、ＯＩＭから０
．１　Ｍまでのリン酸カリウム緩衝液で傾斜溶出した。

０．０５Ｍ付近のリン酸カリウム緩衝液で溶出する活性
画分を集めて濃縮し、本酵素の精製標品２ｍｇを収率２
２％で得た。なお、木精製酵素標品の力価は２００単位
／■蛋白質であった。また、本酵素は前記性質を有して
いた。

実施例２ 実施例１においてアセトバクター・アルトアセチゲネス
ＭＨ−２４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４９１）の代りにアセト
バクター・キシリナム（ＩＦｏ　３２８８）を用いたこ
とおよび培地の酢酸濃度を０．１％としたこと以外は同
様にして行い、本発明の酵素の精製標品０．７■を収率
７％で得た。本精製酵素標品の力価は１９０単位／■蛋
白質であった。また、本酵素は前記性質を有していた。

〔発明の効果〕

本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ複合体は広いｐＨ
域で高い活性を示し、さらにｐＨ３を含む高範囲のｐ）
ｌ域で活性を安定に保持できるため、臨床診断用試薬と
して従来のアルコールデヒドロゲナーゼよりも優れてい
る。また、本発明の酵素は安定性の高いものが強く要求
される酵素センサーにも従来のアルコールデヒドロゲナ
ーゼよりも優位に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は反応ｐＨと本発明酵素の相対活性との関係を示
すグラフであり、第２図は本発明酵素のｐＨ安定性を示
すグラフであり、第３図は反応温度と本発明酵素の相対
活性との関係を示すグラフであり、第４図は本発明酵素
の温度安定性を示すグラフであり、第５図は本発明酵素
の可視部吸収スペクトルを示す図であり、第６図は本発
明酵素の熱水抽出物の螢光スペクトルを示す図である。 第１図 ｐＨ ｐＨ 第３図 ＡＳ　　（’Ｃ） 第４図 ｓｓｔ’ｃノ 第５図 ：Ｊ　　長　／／７ｍノ 第６図 ｊ皮　　　１し　（ｎｍ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の性質を有する新規アルコールデヒドロゲナー
   ゼ複合体。 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測
   定した分子量が約７２，０００および約４４，０００の
   蛋白質を含む酵素複合体であり、（２）４，５−ジヒド
   ロ−４，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロロ〔２，３−ｆ〕キ
   ノリン−２，７，９−トリカルボン酸を含有し、 （３）炭素数２以上のアルコール、ホルムアルデヒド、
   アセトアルデヒドのそれぞれを基質として酸化し、 （４）界面活性剤により細胞質膜より可溶化される。 ２、アセトバクター属に属し、以下の性質を有する新規
   アルコールデヒドロゲナーゼ複合体、（１）ＳＤＳ−ポ
   リアクリルアミド電気泳動法により測定した分子量が約
   ７２，０００および約４４，０００の蛋白質を含む酵素
   複合体であり、（２）４，５−ジヒドロ−４，５−ジオ
   キソ−１Ｈ−ピロロ〔２，３−ｆ〕キノリン−２，７，
   ９−トリカルボン酸を含有し、 （３）炭素数２以上のアルコール、ホルムアルデヒド、
   アセトアルデヒドのそれぞれを基質として酸化し、 （４）界面活性剤により細胞質膜より可溶化される を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から該
   複合体を採取することを特徴とする新規アルコールデヒ
   ドロゲナーゼ複合体の製造法。 ３、アセトバクター属に属する新規アルコールデヒドロ
   ゲナーゼ複合体生産菌がアセトバクター・アルトアセチ
   ゲネスＭＨ−２４（ＦＥＲＭＢＰ−４９１）またはアセ
   トバクター・キシリナム（ＩＦＯ３２８８）である特許
   請求の範囲第２項記載の方法。