NO158948B - Fremgangsmaate for fremstilling av enzymet kolesterase. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av enzymet kolesterase ved dyrking av en mikroorganisme i et flytende næringsmedium, inneholdende en kolesterolester eller en vegetabilsk olje ved en pH i området mellom 6

og 8 og en temperatur i området mellom 20 og 37°C, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at man som mikroorganisme anvender en stamme av slekten Achromobacter delicatulus med betegnelsen NRRL. B.-12115.

Disse trekkene fremgår av patentkravet.

Oppfinnelsen vedrører således en fremgangsmåte for fremstilling av enzymet kolesterase (E.C.3.1.1.13). Enzymet er egnet for hydrolyse av kolesterolestere av fettsyrer. Kolesterol som er en viktig bestanddel i den menneskelige organisme, er en viktig forbindelse i sammensetningen av cellemembranene i alle vev og ved fremstilling av en rekke hormoner.

Det er vel kjent at bestemmelsen av totalt kolesterolinnhold i blodet er av stor betydning i klinisk diagnose og da kolesterol hovedsakelig er til stede i serum i en form forestret med fettsyrer, er enzymet kolesterase nødvendig for dets frigiv-else og etterfølgende bestemmelse. Bare et fåtall publika-sjoner beskriver enzymatiske prosesser for hydrolysering av kolesterolester under anvendelse av enzymer fra mikroorganis-mer av slektene Fusarium, Nocordia, Pseudomonas, Saccharomyces og Streptomyces ettersom enzymet oppnås fra animalsk vev.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremstilles enzymet kolesterase fra en ny mikroorganisme som hører til slekten Achromobacter.

En viktig fordel ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at enzymet som fremstilles av denne mikroorganisme under de dyrkingsbetingelser som er gitt i det etterfølgende, er ekso-cellulært, og det er derfor ikke nødvendig å ekstrahere enzymet, men bare konsentrere det.

I tillegg har den nevnte mikroorganisme i egenskap av en bakterie en duplikasjonstid som er mindre enn for visse sopparter og Actinomycetes, og dette utgjør en betraktelig praktisk fordel.

Denne mikroorganisme som er isolert fra vegetabilsk avfall ved bredden av Tiber, er blitt klassifisert som Achromobacter delicatulus SM-1307 og er inngitt ved Northern Regional Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria (Jll) under betegnelsen NRRL. B-12115.

Dens dyrknings-, morfologiske og fysiologiske egenskaper er gitt i det følgende.

Å- DYRKINGSEGENSKAPER

1) Fast medium.

a) På nærings-agar: kolonier med diameter 2 mm etter 24 timers inkubasjon ved 30°C, med hele kanter som gjerne

vil krølle seg etter 7 døgns aldring. Konvekse, gråhvite kolonier med en fuktig, fløteaktig konsistens, som er svakt glinsende. Ingen spredning på agariserte media.

b) På agar-gelatin: klare, myke, gelatinøse kolonier.

2) Flytende medium:

a) På saltbuljong pluss gjærekstrakt: fløteturbiditet med liten sedimentering. b) På peptonisert vann: god turbiditet etter 24 timer ved 30°C. Sediment og overflatefilm ikke synlig.

B- MORFOLOGISKE EGENSKAPER

1) Gram-negativ stav med gjennomsnittlig lengde 2^um.

2) Positiv mobilitet (hengende dråpe-obervasjon).

3) Peritrichous cilia. Densifisering ved polene ikke iakttatt.

C- FYSIOLOGISKE EGENSKAPER

1) Optimal veksttemperatur mellom 25 og 30°C. Vokser godt ved 20°C. Ingen vekst ved 42°C.

2) Angriper ikke agar.

3) Danner ikke syre eller gass fra glukose.

4) Utnytter ikke urea.

5) Har ikke cytomkrom-C oksydase.

6) Reduserer nitrater til nitritter.

7) Er inert i OX/F-testen.

8) Frembringer ikke indol fra tryptofan.

9) Negativ metyl-rødt.

10) Positiv katalyse.

11) Danner ikke syre eller gass fra laktose.

12) Likvifiserer gelatin.

13) Lakmus-melk: svak surgjøring etter 7 døgn.

For identifikasjonsformål, var de anvendte prosedyrer dem som er angitt i "Methods of detection and identification of bacteria" av B.M. Mitruka og M.J. Bonner, CRV Press Inc., 1976, og i "Bergey Manual of Determinative Bacteriology" syvende utgave.

Stammen som anvendes i henhold til oppfinnelsen kan dyrkes under aerobe betingelser i form av flytende kulturer under anvendelse av fermentorer med omrøring.

Et flytende dyrkingsmedium inneholder en kilde for assimiler-bart karbon, en nitrogenkilde og mineralsalter. Karbon-kildene som kan anvendes inkluderer aminosyrer, glukose, oleinsyre, linolsyre, kolesterolestere og natrium-acetat. Nitrogenkilder som kan anvendes inkluderer organiske og uorganiske nitrogenforbindelser som f.eks. kjøttekstrakt, gjærekstrakt, pepton, triptan, aminosyrer, hydrolysert kasein, soyamel, nitrater og salter av NH^+.

Et passende dyrkingsmdium har f.eks. følgende sammensetning.

pH-området for dyrkingen ligger mellom 6 og 8, foretrukket, mellom 6,8 og 7,2. Temperaturområdet er mellom 20°C og 37°C, foretrukket mellom 28°C og 32°C.

Enzymet fremstilles ved tilsetning av kolesteryl-oleat eller naturlig vegetabilske oljer til dyrkningsmediet før inokulering .

Induksjonstiden kan variere fra 24 til 72 timer, foretrukket fra 40 til 48 timer.

Dyrkingsbuljongen samlet under eller ved slutten av gjæringen kan anvendes som sådan.

Alternativt kan væsken fra den filtrerte eller sentrifugerte dyrkingsbuljong anvendes.

Endelig kan en ytterligere teknisk og økonomisk forbedring oppnås ved å immobilisere enzymet ved kombinasjon med makro-molekylære forbindelser til å danne kjemiske bindinger med grunnmassen, eller ioniske bindinger.

De etterfølgende eksempler illustrerer ytterligere den foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

En dyrkingsbuljong ble fremstilt med følgende sammensetning:

ved å tilsette de nevnte forbindelser til avionisert vann.

pH i buljongen ble innstilt til 7,0 med fortynnet HCL. Den således fremstilte blanding ble fordelt i 250 ml kolber ved tilsetning av 50 ml buljong til hver kolbe som så ble sterili-sert ved 116°C i 30 minutter.

Kolbene ble inokulert med 1 ml av en suspensjon av stammen Achromobacter delicatulus SM-1307 oppnådd ved at patina av en kultur av 20 ml av nærings-agar i 200 x 20 mm rør ble vasket med 10 ml fysiologisk løsning, idet kulturen var dyrket i 48 timer ved 30°C.

Gjæringskolbene ble inkubert under orbital omrøring (180 - 200 omdreininger pr. minutt) ved 30°C.

Dyrkingsbuljongene ble samlet 48 timer etter inokulering og testet med hensyn til enzymatisk aktivitet, idet 1 ml av dyrkingsbuljongen inneholdt 0,2 enzymenheter.

Enzymatisk aktivitet ble bestemt på følgende måte:

- 1 ml dyrkingsbuljong passende fortynnet i en 0,1 M fosfatbuffer ved pH 6,7 ble tilsatt 5 ml av en løsning av kolesteryl-oleat inneholdende 0,3^umol/ml i en 0,1 M fosfatbuffer ved pH 6,7 inneholdende 0,5% "Triton X-100". Reaksjonen ble gjennomført ved 37°C i 10 minutter i et

omrørt vannbad og ble stoppet ved at prøver som var tatt ut fra reaksjonsblandingen ble kokt i 3 minutter. Konsentra-sjonen av kolesterolet fremstilt ved hydrolyse av kolesteryl-oleatet ble bestemt ved hjelp av den koloritmetriske metode

hvor fri kolesterol oksyderes ved hjelp av kolesterol-oksydase til kolest-4-en-3-on med samtidig dannelse av hydrogenperoksyd som reagerer oksydativt med 4-aminoantipyrin og fenol i nærvær av peroksydase til å utvikle en farget forbindelse som har sin maksimale absorpsjon ved 500 nm.

Den optiske densitet av de fargede prøver ble målt i et "DB-GT" Beckmann gitter-spektrofotometer hvori kyvetten hadde en optisk veilengde på 0,1 dm ved en bølgelengde på 500 nm.

Hvis en enhet defineres som den mengde enzym som frembringer l^umol kolesterol pr. minutt under de angitt testbetingelser beregnes antallet enzymenheter pr. ml dyrkingsbuljong ved hjelp av den følgende formel:

hvori: E10 = 0Ptisk densitet av prøven tatt ut etter 10 minutter. Eq = optisk densitet av prøven tatt ut ved 0 minutter. 5,45 = optisk densitet av en kolesteroloppløsning med konsen-trasjon l^umol/ml.

D = enzymfortynning.

Eksempel 2

En dyrkingsbuljong ble fremstilt med følgende sammensetning:

ved å tilsette de nevnte forbindelser til avionisert vann og innstille til pH 6,7 med saltsyre.

Kulturer av stammen Achromobacter delicatulus SM-1307 i oven-nevnte buljong, fremstilt som i eksempel 1, ble inkubert under orbital omrøring (180 omdreininger pr. minutt) ved 30°C.

Dyrkingsbuljongene ble samlet 72 timer etter inokulering og testet med hensyn til kolesteraseaktivitet. 1 ml av dyrk-ningsbuljongen inneholdt 0,4 enzymenheter.

Eksempel 3.

En dyrkingsbuljong ble fremstilt med sammensetning som i eksempel 2.

Kulturer av stammen Achromobacter delicatulus SM-1307 i oven-nevnte buljong, fremstilt som i eksempel 1, ble inkubert under orbital omrøring (180 omdreininger pr. minutt) ved 30°C. Dyrkingsbuljongene ble samlet 72 timer etter inokulering, sentrifugert og kolesterasen i det overliggende væskelag ble anvendt for bestemmelse av totalt kolesterol tilstede i en prøve av humant blodserum.

For dette formål ble følgende reagens fremstilt:

0,1 M natriumfosfatbuffer pH 7,0 1000 ml

Kolesterolet ble bestemt på følgende måte:

- 50^ul humant serum og 0,25 ml dyrkingsbuljong ble tilsatt 2,5 ml reagens.

Reaksjonen foregikk direkte i glasskyvetter som hadde en

optisk veilengde på 1 cm og utviklingen av den fargede forbindelse ble fulgt direkte i et "DB-GT" Beckmann gitter-spektrofotometer ved en bølgelengde på 500 nm inntil en fullstendig omdannelse av kolesterolet tilstede i serumet.

Under disse betingelser ble det oppnådd en endelig optisk densitet på 0,500 tilsvarende 164 mg totalt kolesterol pr.

100 ml av den humane serumprøve som ble testet.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av enzymet kolesterase ved dyrking av en mikroorganisme i et flytende næringsmedium, inneholdende en kolesterolester eller en vegetabilsk olje, ved en pH i området mellom 6 og 8 og en temperatur i området mellom 20 og 37°C;

karakterisert ved at man som mikroorganisme anvender en stamme av slekten Achromobacter delicatulus med betegnelsen NRRL. B.-12115.