CN1060802C - 枯草杆菌生长培养基的建立及其发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种适合用枯草杆菌生产基因工程产物的半合成培养基的建立及其发酵方法。现有技术中由于有些受体菌表达水平低，或者会水解基因表达产物，致使产率低，价格高。也会由于培养基成份复杂，色素深，影响产品的质量。本发明筛选了一种适合枯草杆菌生长并高效生产基因工程产物的半合成培养基，应用本发明的发酵生产控制模式，有效地控制了产物被水解，提高了产品质量和产量。

Description

枯草杆菌生长培养基的建立及其发酵方法

本发明属微生物工程领域，是一种适合枯草杆菌生长及生产基因工程产物用培养基的制备方法及其发酵方法。

目前基因工程的受体茵常用的有大肠杆菌，枯草杆菌，酵母菌等。大肠杆菌由于会产生一些不溶性蛋白，体内不具备某些必要的转录转译后的修饰，而受到限制。酵母菌由于基因表达水平较低，甚至对某些蛋白会产生不适应的糖基化，这些都对基因产品生产不利。而枯草杆菌能在廉价培养基上生长，不产生内毒素，基因表达产物分泌于体外，它对外来基因具有充分表达的系统，而没有限制，生长速度快，对人、动物、植物、环境安全可靠，而受到重视。另外，该菌具有较强的蛋白水解酶而水解基因表达产物，所以，不少研究者应用化学、物理方法诱变，或者用其他手段使枯草杆菌的蛋白酶基因缺失，从而降低蛋白酶活性，保证基因表达产物不被水解。目前常用的枯草杆菌培养基色素深，直接影响产品的分离纯化，因而也影响产量，况且不同的枯草杆菌有不同的最适生长培养基，而生产不同的基因产物又往往使用不同的培养基，即使使用最适生长培养基，但未必是基因产物生产最佳培养基，表达量未必最高。因此筛选一个既适合菌体生长又有利于表达、分泌基因产物的生产用培养基，在其他条件相同的情况下，培养基的选用显得十分重要。所以在国际工业界、发酵行业、生产企业，培养基配方及以此培养基生产目的产物的工艺路线成为该领域追逐的目标。

本发明的目的是筛选一种适合枯草杆菌生长，并充分表达基因工程产物的培养基及其发酵方法。

本发明的一种适合枯草杆菌生长的半合成培养基，其制备方法是无机盐及磷酸缓冲液，无机盐和磷酸缓冲液的成份主要是：(g／L)Na₂HPO₄：4．0～7．0       Na₂SO₄： 0．05～0．20KH₂PO₄： 4．0～7．0       MgCl₂：  0．02～0．20NH₄Cl：  0．5～2．0       MnCl₂：  0．001～0．008

                      FeCl₂：  0．002～0．008

有机组成是：(g／L)葡萄糖：1～10

                  酵  母：2～10

                  蛋白胨：2～10

其余是水。

该培养基成份含有枯草杆菌生长的必要元素和有机含量，经摸索其成份和含量均比较合理，降低了培养基色素，再经下述灭菌处理后，能有效地作为枯草杆菌生长培养基。

培养基制备时在无机盐和磷酸缓冲液中加入酵母、蛋白胨后调节pH7．0～8．0，在0．04～0．05Mpa压力下灭菌15～30分钟后，再加入灭菌后的葡萄糖作为培养基使用。

本发明培养枯草杆菌的发酵方法如下：将枯草杆菌在LB培养基上活化培养，然后挑取单菌落扩大培养二次，其条件是：温度为32～40℃，转速为160～240r／分下培养10～18小时，然后以接种量5～10％进行发酵生产。发酵条件为：温度30～38℃，转速400～600转／分，空气流量1∶0．4～1∶1，未接种时溶氧90～98％，接种后溶氧量10～40％，pH为7．0～8．0，pH不宜太低，太低了菌不易生长。接种后在上述条件下维持0．5～1．5小时，然后升温35～40℃，在上述同样条件下维持3．0～4．0小时后添加补料液，补料添加方法是将有机物组分与浓缩的无机盐及磷酸缓冲液等体积混合，浓缩的目的是使发酵液体积不至于太大，添加量为发酵液体积的1～10％，继续发酵至5～7小时后，与前述同样条件再次添加补料液，添加量同前。跟踪基因产物达最高时结束发酵。

补料的组分其无机盐及磷酸缓冲液与发酵培养基相同，而有机组成为：(g／L) 葡萄糖：4～7

        酵  母：2～5

       蛋白胨：200～400有机成分浓度较大，是为减少发酵液体积，补料的添加速度也很重要，一般控制在2～8mL／分，补料添加方法是将有机物组分与浓缩的无机盐及磷酸缓冲液等体积混合，如以一升发酵液体积计算，8ml 30％的葡萄糖和8ml浓缩的无机盐及磷酸缓冲液培养基，分别灭菌后混合即可。补料量通常为发酵液体积的1～10％，若溶氧量突然偏离设定值，可调节补料速度，此点在发酵后期尤其重要，不然溶氧不足会出现溶菌现象，影响发酵产量。

本发明建立的培养基和发酵控制模式，适合于基因在枯草杆菌中高效稳定地表达，用本发明方法发酵菌体，每毫升菌体浓度达OD₆₀₀≈15～24，以发酵生产的控制条件来控制蛋白酶的分泌，使基因表达产物不被水解，大大地提高了基因表达量。本发明用于发酵基因工程产物的发酵液色素低，有利于分离提纯酶制品，不仅提高了产品质量，而且提高了产品的产量，从而大大降低成本。

实施例：(以溶葡球菌酶为例)

本发明用于溶葡球菌酶发酵方法如下：将枯草杆菌(BR151)转化子在LB培养基上活化培养，然后挑取单菌落扩大培养二次，培养条件：温度为35℃，转速为160r／分下培养16小时，再以接种量4％扩大培养于发酵培养液中。发酵培养液中无机盐和磷酸缓冲液的成份主要是：(g／L)

Na₂HPO₄： 4．0       Na₂SO₄：  0．05

KH₂PO₄：  4．0        MgCl₂：  0．02

NH₄Cl：   1．0        MnCl₂：  0．001

                  FeCl₂：  0．002其中有机组成是：(g／L)葡萄糖：3

                  酵  母：3

                  蛋白胨：2其余是水。在无机盐和磷酸缓冲液中加入酵母、蛋白胨调pH7．0后，在0．04Mpa压力下灭菌20分钟，再加入灭菌的3g／L葡萄糖作为培养基。发酵条件为：温度32℃，转速450转／分，空气流量1∶0．6，溶氧30％，接种后在上述条件下维持1．5小时，然后升温35℃，上述同样条件下维持2小时后添加补料液，补料添加方法是将有机物组分与浓缩的无机盐及磷酸缓冲液等体积混合，添加量为发酵体积的2％，继续发酵6小时后，与前述同样条件下再次添加补料液，添加量同前，并随时跟踪酶活性，酶活性达最高并有下降趋势时结束发酵。

用本发明方法发酵溶葡球菌酶，每毫升菌体浓度达OD₆₀₀≈20，溶葡球菌酶产量约500mg／L。

Claims (6)

1．一种适合枯草杆菌生长的半合成培养基的制备方法，其特征在于发酵培养基的主要成份是无机盐及磷酸缓冲液，其组成是：(g／L)

Na₂HPO₄：4．0～7．0          Na₂SO₄： 0．05～0．20

KH₂PO₄： 4．0～7．0           MgCl₂： 0．02～0．20

NH₄Cl ： 0．5～2．0           MnCl₂： 0．001～0．008

                                  FeCl₂： 0．002～0．008

有机组成是：(g／L)葡萄糖：1～10

                  酵母：2～10

                  蛋自胨：2～10，其余是水，无机盐磷酸缓冲液中加入酵母、蛋白胨后，调节pH值为7．0～8．0，并须在0．04～0．05MPa下灭菌15～30分钟，加入灭菌后的葡萄糖作为培养基使用。

2．一种用枯草杆菌工程菌的发酵方法，特征在于：

1)将枯草杆菌在LB培养基上活化培养，然后挑取单菌落扩大培养二次，其条件是：培养时间10～18小时，温度32～40℃，转速160～240r／分，最后全部接入权利要求1所述的发酵培养基；

2)发酵过程是：接种后维持30～38℃，0．5～1．5小时，然后升温35～40℃，维持3．0～4．0小时后添加补料液，发酵至5～7小时后，与前述同样条件再次添加补料液，直至基因产物量最高时结束发酵；

3)发酵过程中其它控制条件：转速：400～600转／分，空气流量：1∶0．4～1∶1，pH值为7．0～8．0，未接种时溶氧：90～98％；接种后最低溶解氧控制在10～40％。

3．根据权利要求2所述的枯草杆菌的发酵方法，其特征在于发酵过程需要进行分批补料培养，其分批补料培养的是加入权利要求1所述的浓缩无机盐和磷酸缓冲液以及下述有机物成份(g／L)蛋白胨：4～7

                                      酵母：2～5

                                      葡萄糖：200～400

4．根据权利要求3所述的枯草杆菌的分批补料培养方法，其特征在于补料培养基添加方法是有机成分与浓缩的无机盐及磷酸缓冲液等体积混合。

5．根据权利要求3所述的枯草杆菌的分批补料培养方法，其特征在于补料液的添加速度是2～8ml／分。

6．根据权利要求3所述的枯草杆菌的分批补料培养方法，其特征在于补料添加量为发酵液体积的l～10％。