DE1617346A1 - 3'-Chlor-5,2'-dihydroxy-3,7,8-trimethoxy-flavon und Verfahren zu seiner Herstellung auf biologischem Wege - Google Patents

Description

DR. ELISABETH JUNG, DR. VOLKER VOSSIUS, DIPL.-ING. GERHARD COLDEWhY

MÖNCHEN 23 · CLEMENSSTRASSE 30 · TELEFON 345067 · TELEGRAMM-ADRESSE: INVENT/MONCHEN · TELEX 5-29686

P 16 17

U.Z.: C 727 24. November 1969 j/gs

BEECHAM GROUP LIMITED Brentford, Middlesex, England

"3'-Chlor-5,2'-dihydroxy-3,7,8-trimethoxy-flavon und Verfahren" zu seiner- Herstellung auf biologischem Wege"

Priorität: 25. Mai 1966 / Großbritannien Anmeldungs-Nr. 23329/66

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum und Verfahren zu dessen Herstellung.

Das Antibiotikum, welches ein Flavonderivat darstellt, wird durch Züchtung bestimmter Stämme von Aspergillus candidus, zum Beispiel Aspergillus candidus ATCC 20022 und ATCC 20023 hergestellt. Es ist hochaktiv gegen bestimmte Bakterien und Pilzarten einschließlich einiger Arten von Aspergillus, die Pilzkrankheiten beim Menschen verursachen·

Das erfindungsgemäße Antibiotikum 3^l-Chlor-5,2'-dihydroxy-3,7,8-trimethoxy-flavon weist die nachstehende Strukturformel auf:

.......„,.,,. A&&812/1558

naiiTmf.ua UNViH UnNCMrN (.8OPOInSTR. 71. KTO. NR. 80/98794

OH 0

(D

Die antibiotisch wirksame Substanz wird dadurch hergestellt, ___ daß man eine Kultur von Aspergillus candidus unter aeroben Bedingungen in einer wässrigen Nährlösung, die anorganische Salze und eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, wachsen läßt, bis die Nährlösung eine erhebliche antibiotlsche Wirksamkeit zeigt, und dann das Antibiotikum isoliert.

Permenti erung

Kulturen der das Antibiotikum erzeugenden Pilze werden in Bodenproben und auf üblichem Schrägagar auf einem geeigneten Agar-Kulturmedium gehalten, zum Beispiel Hafermehl-Agar auf Rinderextrakt-Agar. Zur Gewinnung von Impfmaterial werden die Kulturen auf Schrägagar eines geeigneten Mediums für das Wachstum, wie Dextroseagar nach Sabouraud oder Rinderextrakt-Agar in üblichen flachen KuItürflaschen etwa 5 bis 10 Tage bei 20 bis 30° C wachsen gelassen. Zur Beimpfung einer·Gärmaische werden Spore» von einer reifen Kultur auf Schrägagar mit sterilem Wasser abgewaschen, das 0,02 % Tween 80 enthalten kann zur besseren Netzung und Dispergierung der Sporen.

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Die erhaltene Sporensuspension wird aseptisch auf Erlenraeyerkolben odsr kleine Gärbehälter übertragen» Der erhaltene Anwuchs kann als das abochliessende Gärverfahren dienen oder als vegetative Ansaatstufe verwendet werden, die als Impfmaterial für ein grb'sseres Volumen des Gärmeöiums dient» In der gleichen Yi ei se können zwei oder mehr Ansaatstufen verwendet werden« Die Menge der vegetativen Ansaat, die als Impfmaterial für die folgende Stufe verwendet wird, liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 10 f», . . ·

Sowohl das Ansaatmedium wie das Gärmedium enthalten Stickstoffquellen, Kohlenstoff- und Energiequellen un<? geeigne te. Mengen an anorganischen Salzen und ,anderen zur Erfahrung des Pilzes notwendige! Substanzen«

Assimilierbare Stickstoffquellen, die verwendet werden können, umfassen anorganische Salze, wie Natriumnitrat', und komplexe organische Materialien des in der Eeraentationsindustrie gewöhnlich verwendeten 2yps, z.B. Maisquellwasser, getrocknete lösliche Haisschlempe» gemahlenes Nussme& ,· Sciabonenmehl, Hydrolysat von Casein und Pep ton. Es wurde gefunden, dass Haisquellwasser eine sehr gute Stickstoff quelle ist, wobei die bevorzugte. Menge im Bereich von 4,5 Gew.-jS bis 7,5 Gew.-^ pro Volumen liegt'·

Eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff und Energie wird beim Nährmedium ebenfalls zusätzlich zu den Quellen verwendet, die im Maisquellwasser oder anderen Materialien, die als alleinige Quelle für organischen Stickstoff dienen, vorhanden

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sind. Kohlenhydrate sind geeignete Quellen für Kohlenstoff und Energie, z.B. Glucose; Lactose, Maltose und Sucrose* Bestimmte tierisch'Q und pflanzliche Öle, wie Schweineschmalze! und Maisöl können vorteilhaft zum Nährniedium zugesetzt werden und dienen ebenfalls als Kohlenstoff- und Energiequelle.

Es kann notwendig sein, bestimmte anorganische Salze zum·Nährmedium zuzufügen, z.B. Magnesiumsulfat, Eisen-II-sulfat, Kaliumphosphat und Kaliumchlorid, insbesondere, wenn die vorhandene Stickstoffquelle anorganischer Natur ist, wie Natriumnitrat. Wenn ein komplexes organisches Material als .Stickstoffquelle verwendet wird, können die notwendigen chemischen Elemente ebenfalls in diesem Material vorliegen. Es wurde jedoch gefunden, dass wenn Maisquellwasser beim letzten Fermentatipnsmedium als Stickstoffquelle verwendet wird, zusätzliche antibiotische Substanz produziert wird, wenn das Medium mit bis zu 0,5 Gew.-^ pro Volumen Kaliumchlorid vervollständigt wird·

Es wird bevorzugt, den p_H-Wert des Mediums vor der Sterilisierung auf einen solchen Wert einzustellen, dass der p«-Wert nach der Sterilisation und Beimpfung beim Beginn der Fermentierung im Bereich von 5,5 bis 6,0 liegt.

Die Belüftungs- und Rührbedingungen während der Fermentierung müssen so beschaffen sein, dass eine angemessene Belüftung der Kultur während der letzten Fermentierung geschaffen wird, und die erforderlichen Bedingungen schwanken mit der Konstruktion

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des verwendeten Gärbehälters· Im allgemeinen sind hohe Rührgeschwindigkeiten erforderlich, um die höchsten Ausbeuten an Antibio- . tikum zu erzielen. Es wird bevorzugt, die Fermantierung. bei nied- ' ' riger Luftstromgeschwindigkeit beginnen zu lassen, die erhöht wird, wenn die Fermentierung fortschreitet. Verschiedene Schaumbremsstoffe können zugesetzt werden, um eine übermässige Schaumbildung während der Fermentierung zu verhindern, z.B,Octadecanol ^:

• - . ■»

und "Hodag WF". Die Ferinentierung kann bei einer !temperatur

zwischen 20° und 30° C durchgeführt werden, »wobei eine Temperatur ^:

zwischen 24° und 26° C bevorzugt ist» Der Permentierungsansatz _: .·

wird geerntet, wenn der antibiotische Titer nach der biologischen ■ '. Bestimmung auf ein Maximum angestiegen ist, gewöhnlich nach etwa

4 bis 5 lagen. ■·*

Zur Bestimmung des Antibiotikums in der Gärmaische werden ganze Maisohproben mit Aromasöl L extrahiert, einem Lösungsmittel, das 80 % !Toluol enthält» Von am Extrakten werden dann biologische Untersuchungen auf Filterpapierscheiben durchgeführt mter Verwendung eines empfindlichen Stammes des Fadenschismeis Paecilomyces varioti als Versuchsorganismus gegenüber Standards des -_ gereinigten Antibiotikums, das in Aromasol L gelöst ist·

Extraktion
Oärmaisohen entaalt@a ®tw© Z._O3 §8«?«,«^ w© Vö1«!b@s m, Feststoffeia₀ ^f·

wasserstofflösungsmittel sind für die Isolierung der Verbindung¹ bevorzugt, da sie weniger Verunreinigungen mit der aktiven Verbindung extrahieren. Handelsübliche Kohlen wasserstofflösungemittel werden bevorzugt wegen ihrer zufriedenstellenden Extraktionswirksamkeit und Preiswürdigkeit·

Wenn der pjj-Wert des Systems auf 4,0 bis 5,0 xaittels 25 #iger Schwefelsäure eingestellt wird, bleibt nur 10· £ der Antifungus- ._: Wirksamkeit in Lösung in der. Kulturflüssigkeit; der Best der Aktivität wird zusammen mit den Mycel-feststoffen abfiltriert. - Das übliche Extraktionsverfahren besteht darin, die Feststoffe aus der Piltrierungsstuf e herauszunehmen und sie mit einem Kohlenwasserstoff lösungsmittel zu extrahieren. Die Verbindung wird dann durch Konzentrieren dieses Extrakts im Vakuum gefällt· Das Produkt kann aus Benzol und. Petroläther umkristallisiert werden und wird in chromatographisch reiner Form erhalten.

Physikalische und chemische Eigenschaften

Das erfindungsgemäss hergestellte Antibiotikum ist ein blassgelber mikrokristalliner Feststoff niedriger Dichte, der keine optisohe Aktivität besitzt und einen Schmelzpunkt von 212° C aufweist. Es wird kein erkennbarer Verlust an biologischer Wirksamkeit beobachtet« wenn Losungen 1 Stunde bei einem Pg-Wert im Bereich von 2-13 gelagert werden? ebenfalls wird kein Verlust beobachtet, wem die Substanz 1 Stunde b@ä 150° 0 gehalten wird· Sie eUblimiert W& 15δ-ϊ^# 0 C 4 mßte)* was «ine wirksame

Heinigimgeteoteifc-äste - " " '

BADORfQlNAL

12/1

Das Antibiotikum ist fast unlöslich in Wasser bei neutralem Ρττ-Wert: die löslichkeit beträgt ^ 8 ug/ml bei Raumtemperatur. Es ^: ist etwas in Äthanol löslich (¹^ 100 ug/ml) und ziemlich lös- ;'■" lieh in Chloroform (■£· 25 mg/ml) und Dimethylacetamid (—35 mg/ml) <' Die Verbindung ist sparsam löslich in Paraffinlösungsmitteln, ··:■ und diese Eigenschaft ist beim Extraktionsverfahren von grossem " Wert. Die Verbindung ist in Wasser bei alkalischen p_H-Werten .:· löslich und es können ziemlich konzentrierte Lösungen erhalten ν werden. Sie ist ebenfalls in konzentrierter Schwefelsäure löslich und kann unverändert durch Verdünnen der Lösung mit Wasser zurückgewonnen v/erden» Wenn eine Lösung in Schwefelsäure einige' ^: Minuten erwärmt wird, wird eine tief rote Färbung erhalten«

Es wurde eine Reihe von Tüpfelreaktionen mit dem Antibiotikum ausgeführt, deren Ergabnisse in Tabelle X gezeigt werden: . '

Tabelle I

Ergebnis · ■ '.

Alkalisches

Permanganat/Bromphenolblau +

Diazotiertes p-Hitroanilin +

Alkoholisches Eisen-III-chlorid +

Brom/Pluorescin +

Gibbs-Reagens . +

Kinhydriii Tollen's (Zaffaroni)-Reagens

Phosphomolybdänsäure Phosphorsäure

Millon's - Reagens -

Zimmermann — Reagens —

Dragendorff - Reagens -

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Fortsetzung Tabelle I

_-r__ _VgrsucIi ^ Ergebnis_i

Carr-Price - Reagens -

Molisch - Reagens -

Silbarnitrat/Pyrogallol

Bromphenolblau/Zitronensäure

Brady - Reagens -

Die Versuche aeigen die im allgemeinen nicht reaktionsfähige Natur des Antibiotikums und könnten vermuten lassen, dass es sich um eine phenolische Verbindung mit schwach reduzierenden Eigen- " schäften und einer Ungeeättigtheit handelt. ___.-

Die wichtigen Kennzeichen bei der Strukturbestimmung des Antibi otikums als 3'-Chlor-5,2·-dihydroxy-3,7,8-trime thoxyf lavon (I) sind die folgenden:

Die Formel C-^gH-jcClO« gemäss der Massenspe&troslcopie erfordert C 57,07 P, H 3,99 i\ Cl 9,36 tjCMa (3 Gruppen) 24,55 & OH (2 Gruppen) 8,98 $£. Gefunden: C 57,20 Jtj H 3,88 % } Cl 8,93 %i OMe 24,78 $-, OH 7,82 ^. Das N.M.R. Spectrum zeigte 3 Methoxygruppen„ 2 Hydroxygruppen und 1 einzelnes und 3 g,ekoppelte aromatische Protonen» Das U.?. Spectrum in Äthanol ergab Amax.(log« ε. )? 266 αψ. (4,44) 305 (Schulter) (3,85) und 350 (3,85)« Das I«R. Spektrum in Chloroform ergab ίο'« ο ^{1656 cm}"¹·

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Das Diacetat des Antibiotikums ist ein blassgelbes Pulver ohne definierten Schmelzpunkt. Berechnet für ^C22^H19^C^°g^: -—' C 57,08 p, H 4,14 P, Cl 7,66 P₉ Gefunden: C 57,09 P₁ H 4,08 p, Cl 7,70 <f°* Das N.M.E., Spektrum zeigte 3 Methoxygruppen, 2 Acetylgruppen und ein einzelnes und 3 gekoppelte aromatische Protonen. Das Ü,V· Spektrum in Äthanol ergab λ max. (log£): 256 mu (4,40), 305 (4,02) und 318 (Schulter) (4,.QO). Das I.E.Spektrum in Chloroform ergab f_{c β Q}1645 cm"*¹.

Der Dimethyläther des Antibiotikums ist eine weisse kristalline ■Substanz vom P. 114-115°. C* Berechnet für C₂₀H₁QClO^: C 59,04 P, H. 4,70 p_t' Cl 8,71 Jf, Gefunden: C 59,28 p, H- 4,91 P, Cl 8,44 ft Das N.M.R. Spektrum zeigte 5 Methoxygruppen und 1 einzelnes und 3 gekoppelte aromatische Protonen. Das U.V. Spectrum in Äthanol ergab Amax. (log C )' 258 mu (^19)i 333 (3,94). Das I.S. Spektrum in Chloroform ergab Tq = O ¹^^ ?^m ·

Die alkalische Hydrolyse des Antibiotikums ergab 3-Chlorsalizyl eäure und 4,5-Dimethoxyresorzin. Die alkalische Hydrolyse des Dimethyläthers ergab 3~Chlor-2-methoxybenzoesäure und 2-Hydroxy-3,4,6-tetramothoxyacetophenon, Die Kombination dieser vier Produkte ergibt (I) als einzig mögliohe Struktur.

Die bathoohrome Verschiebung der Carbonylwellenlänge um 10 auf 20 cm"¹ bei der Aoetylierung oder Methylierung let ein Kenn- seichen für S-

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Die Reduktion des Antibiotikums mit Magnesium und Salzsäure ergibt eine tiefrote Färbung, die charakteristisch, für Flavone mit Sauerstoff in 3-Stellung ist.

Biologische Eigenschaften

Sie Aktivität des gemäsa der Erfindung hergestellten Antibiotikums gegen Pilze in vitro zeigt die Tabelle II·

Tabelle	Pilss	II	Minimum den* Hemm— konzentration (^/ml)	■finduxut.
Aspergillus amstelodami	Stamm (BRL Kr.)	0,08
Aspergillus fumigatus	* 608	0,08
Aspergillus fumigatus	57	0,08
Aspergillus fumigatus	165	0,08
Aspergillus fumigatus	424	0,16
Aspergillus fumigatus	434	0,16
Aspergillus fumigatus	636	0,08
AspergillUB fumigatus (var. helvolus)	724	0,63
Aspergillus oohraceous	714	0,16
Die folgenden Baiatiiele erlä	708
utern'die Ex

Beispiel 1

FUnf Liter Impfmediusi wurden in einem ΙΟ-Liter Permentierungsgefäss sterilisiert. Dia ZuD^u^eneetiung des Impfmediums war wie folgt:

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- 11 -	1617346
Bestandteil	Men^e («A)
liaißQusilwasser (50 f. Pest stoffe)	76
Xrside	10
Sucrose (brauner Zucker)	20
läaisöl	2,5

Der powert wurde auf 5,8 mit Natriuohydroxyd vor der Sterilisierung eingestellt» Nach dem Abkühlen wurde das Medium mit einer Sporensuspsnsion aus einem Schrägagar von Aspergillus candidus BBL 274 beimpft und 48 Stunden bei 26° C inkubiert, bei einem Luftstrom von 5 Litern/Minute und unter Bühren mit 500 U/min, unter Verwendung eines Pächersehsibenrührblatts von 3,9 cm Durchmesser. Ein 100 Liter Fermentierungsgefäss, das Liter des gleichen Impf mediums enthielt, wurde bei 120° C Minuten sterilisiert und dann mit dem Inhalt der ersten Impf stuf β beimpft. Die aweite Impfstufe wurde dann bei 26° C 30 Stunden bei einem Luftstrom von 75 Litern/Minute und unter Bühren mit 210 U/min mit einem Pächerscheibenrührblatt von 19 cm Durchmesser inkubiert·

Das letzte Permentierungsmedium hette die folgende Zusammensetzung:

Bestandteil * Menge (g/Liter)

MaisQuellwasser	60
(50 jL Peststoffe)
Kreide	2
Grlucose-monohydrat	50
Kaliumchlorid	5
Schweineschmalzöl	2,5

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Der p_H-Wert wurde mit liatriuahydroxyd auf 5»8 vor der Sterilisierung eingestellt* 1500 Liter des Mediums wurden in einem 2000 Liter-Fermentationsgefäss sterilisiert. Nach dem-Abkühlen wurde das Medium mit dem Inhalt der zweiten Impfstufe beimpft und die Fermentierung bei 26° C unter einem Luftstrom von 600 Litern/Minute während der ersten 30 Stunden und danach von 1000 Litern/Minute inkubiert· Der Gäransatz wurde mit 166 U/min mittels zwei Fächerscheibenrührblättern von 49,2 cm Durchmesser gerührt. Während der Fermentierung wurden 50 ml Portionen eines Antisohaumiaittels aus 2 i<> Octadecanol in Sehweineschmalöl mit einem Gehalt von 7,5 Vol.-# Testbenzin zugegeben, falls die Schaumbildung dies notwendig machte. Der Gäransatz wurde nach 100 Stunden Inkubationszeit geerntet, nach welcher Zeit der antibiotische liter auf 9,5 ug/ml angestiegen war.

1650 Liter der Gärmaische nach der Ernte wurden auf einen Pg-Wert 4,0 mit 25 #iger Schwefelsäure eingestellt· Die festen Stoffe wurden sodann entfernt unter Verwendung eines Drehtrommelfilters. 1440 Liter des Filtrats wurden verworfen und die Mycelfeststoffe mit 200 Litern SBP 6 extrahiert (SBP 6 ist ein handelsübliches Kohlenwasserstofflösungsmittel der Shell-Mex Ltd.). Nach der Entfernung der Feststoffe aus dem SBP 6 wurden diese erneut mit 200 Litern Aromasol L' extrahiert (Aromasol L ist ein Kohlenwasserstofflösungsmittel der Imperial Chemical Industries Ltd·)· Der SBP 6-Extrakt wurde im Vakuum auf 1,6 Liter eingeengt und die abgeschiedenen Feststoffe aus

I 0 9 8 1 2 I 1 B b &

Petroläther 100/120 umkristallisiert. Insgesamt wurden 5,05 g B'-Clilor-S^'-dihydroxy^pTfÖ-trimQ'&hoxyf^avcii erhalten. In gleicher Weise wurden 0,yi> g des Produkts aus dem AromaBol-Extrakt erhalten.

Beispiel 2 .

Die Impfansatzstufen und der letzte Fermentationsaneatz wurden in genau gleicher V/eise wie in Beispiel 1 durchgeführt! ausser dass die Rührgeschwindigkeit in der letzten Fermentierungsstuf e 182 U/min betrug. Der Ansatz wurde nach 102 Stunden Inkubationszeit geerntet, nach welcher Zeit der antibiοtische Titer auf 12 ug/ml gestiegen war»

1600 Liter der Gärmaische wurden auf einen pg-Wert 5,0 mittels 25 jSiger Schwefelsäure eingestellt» Nach Entfernung der Iflycel-Feststoffe durch Filtrieren wurden diese in zwei Seilen unter Verwendung von je 100 Litern SBP 6 extrahiert. Die erste Hälfte wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur extrahiert und die zweite Hälfte bei 60° C für eine gleiche Zeitspanne. Nach der gleichen Isolierung wie in Beispiel 1 wurden 2,9 g der reinen Verbindung aus der Extraktion bei Raumtemperatur und 3,1 g aus der Extraktion bei 60° C gewonnen.

- Patentanspruch -

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Claims (2)

1. Patentansprüche
2. 2) Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums gemäß Anspruch 1, Formel I, auf biologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Aspergillus candidus oder einer Mutante davon unter aeroben Bedingungen in einer wässrigen Nährlösung, die anorganische Salze und eine Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff enthält, wachsen gelassen wird, bis die Nährlösung eine wesentliche antibiotische Aktivität zeigt, wonach das Antibiotikum isoliert wird.

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