PT895981E

PT895981E - Compostos de terfenilo e medicamentos contendo os mesmos

Info

Publication number: PT895981E
Application number: PT97915711T
Authority: PT
Inventors: Toshiyuki Kamigauchi; Ryuji Suzuki
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1996-04-22
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2001-05-31
Also published as: WO1997039999A1; DE69704057T2; AU2308197A; ES2155991T3; DK0895981T3; EP0895981A4; GR3035664T3; DE69704057D1; CN1216521A; CN1101373C; EP0895981B1; EP0895981A1; US6087540A; CA2248940A1; KR19990087816A; ATE199083T1; US6291231B1; TW419459B; JP4063882B2

Description

85 590 ΕΡ0 895 981/PT *fr DESCRICÃQ “Compostos de terfenilo e medicamentos contendo os mesmos” O invento refere-se a um composto que é útil como um componente farmacêutico, a um processo para produzir o mesmo e à utilização do mesmo. Especificamente, proporciona-se um composto novo de terfenilo que tem uma actividade imunossupressora, anti-inflamatória e anti-tumoral, um processo para produzir o mesmo e um agente imunossupressor, anti-inflamatório e anti-tumoral que constitui o mesmo.

Antecedentes do invento

Um transplante de um tecido ou de um órgão que se executa frequentemente, em anos recentes, está a atrair a atenção como método de recuperar um órgão ou tecido disfrmcional. No entanto, um sintoma de rejeição a fim de excluir uma parte transplantada após uma operação é um sério problema e não é ir muito longe dizer que o sucesso do transplante depende da prevenção do sintoma de rejeição.

Nestas situações, está-se a usar um agente de imunossupressão para a prevenção e tratamento de um sintoma de rejeição contra um transplante de um órgão, ou de um tecido ou de uma reacção do enxerto contra o hospedeiro que é causada pelo transplante de medula óssea, e é um agente farmacêutico importante. O agente de imunossupressão é muitas vezes usado para tratar não só um sintoma de rejeição causado por um transplante mas também doenças auto-imunes, tais como artrite reumatóide crónica, doenças alérgicas e outras do género. Recentemente, desenvolvem-se e usam-se clinicamente vários agentes de imunossupressão tais como azatioprina, corticóide, cicloesporina A, tacrolimus e outros semelhantes, mas não são tão satisfatórios tendo em conta os seus efeitos e os seus efeitos secundários.

Usam-se, também, clinicamente muitos agentes anti-tumor, mas na sua maioria têm uma potente actividade anti-tumor e toxicidade, como efeito secundário, o que limita a dosagem.

Nestas situações, desejou-se desenvolver um agente imunossupressor ou anti-tumor que tenha uma potente actividade e possa ser usada com segurança.

Os compostos que pertencem ao mesmo tipo dos compostos do presente invento estão descritos cm Chemical Pharmaceutics Bulletin, 24 (4), 613 620 (1976), The Journal of

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Antibiotics, 32 (6), 559-564 (1979), Àgricultural Biological Chemistry, 49 (3), 867-868 (1985) e outros do género. Nesta literatura, indicam-se estes compostos como tendo uma toxicidade contra células embrionárias de ouriço do mar e células Hela mas não se menciona de todo a sua actividade anti-inflamatória e imunossupressora.

Exposição do invento

Um objectivo do presente invento é proporcionar um novo composto que tenha uma actividade imunossupressora, anti-inflamatória ou anti-tumor, um processo para produzir o mesmo e um agente de imunossupressão, anti-inflamatório ou anti-tumor compreendendo o mesmo.

Os presentes inventores encontraram um composto que tem uma potente actividade imunossupressora, anti-inflamatória e anti-proliferativa em células de tumor num caldo de cultura de Aspergillus candidus RF-5762, uma espécie de fungo filamentoso, isolaram e purificaram o composto activo e realizaram o presente invento. O presente invento proporciona um composto de fórmula (I):

onde R1 é hidrogénio ou hidroxi e R2 é hidroxi ou metoxi, sais farmaceuticamente aceitáveis ou os seus hidratos. O presente invento proporciona um processo para produzir o composto (I) que compreende fazer a cultura de um microorganismo que pertence ao género Aspergillus e pode produzir o composto (I) e recolhendo o composto (I) da cultura obtida. Para além disso, o presente invento proporciona um processo para produzir o composto (I) que compreende submeter um composto da fórmula (II), um percursor do composto (I): OMe R1

OH (II)

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ΕΡ 0 895981/PT 3 onde R1 e R2 são os mesmos definidos acima, a uma reacção de 3-metil-2-butenilação.

Numa outra concretização, o presente invento proporciona uma composição farmacêutica, especificamente um agente anti-tumor, anti-inflamatório ou imunossupressor, que compreende o composto (I). Para além disso, o presente invento proporciona um método para suprimir uma reacção imune, tratar ou prevenir inflamação ou tratar tumor, que compreende administrar o composto (I). Um outro objectivo deste invento é proporcionar a utilização do composto (I) para o fabrico de um medicamento para suprimir uma reacção imune, tratar ou prevenir inflamação ou tratar tumor. Para além disso, o presente invento refere-se a um microorganismo que pertence a Aspergillus candidus e produz o composto d)·

Melhor forma de realizar o invento

Um processo para produzir o composto (I) do presente invento por cultura de um microorganismo e por síntese química é o seguinte:

Processo por cultura de um microorganismo

No presente processo por cultura de um microorganismo, isola-se o composto (I) pelo método em que se faz uma cultura de um microorganismo que pode produzir o composto (I) do presente invento, numa composição de meio e em condições tais como as usadas na produção por fermentação vulgar e separam-se e recolhem-se os produtos de fermentação de forma usual. O microorganismo que pode produzir o composto (I) do presente invento pertence ao género Aspergillus, nomeadamente ao Aspergillus candidus RF-5762. O carácter morfológico do Aspergillus candidus RF-5762 é a seguinte:

As colónias desta estirpe num meio de ágar de Czapek são brancas ou brancas amareladas e chatas. As suas margens são rendilhadas.

Uma produção de uma cabeça conidial é boa e o lado inverso da colónia é incolor ou branco amarelado. Por vezes esta estirpe produz um pigmento castanho num ágar. A cabeça conidial é de forma esférica chata, de 150-250 μηι de diâmetro, e mais tarde ramifica-se. Ao mesmo tempo, forma-se uma pequena cabeça conidial de 25-50 μηι de diâmetro.

85 590 ΕΡ 0 895 981 / PT &Á0* J/r**'

Os conidióforos são de 20-300 μιη em extensão e de 4,0-6,0 pm em diâmetro, as suas paredes são finas e têm septos. A vesícula é esférica ou esférica chata, em forma, e de 13,0-15,0 x 13,0-15,0 μιη. Na superfície forma-se uma metula, mas na de uma cabeça conidial pequena não se forma, e a cabeça conidial toma-se penicillus. A metula é de 3,5-4,5 x 6,5-7,5 pm e por vezes toma-se hipertrópica para ser esférica ou em forma de pêra e de 10,0-14,0 χ 10,0-14,0 μιη em tamanho.

Um fialido é de 1,5-2,5 x 4,0-8,0 μιη de tamanho. Um conídio é esférico de 2,5-4 pm em diâmetro e a superfície é macia. A temperatura de crescimento é de 140C-36°C e a temperatura óptima de crescimento é de 22°C-32°C.

Compararam-se as características acima com as de espécies conhecidas do género Aspergillus descrito na literatura (”The genus Aspergillus”, 347-350 (1965), William & Wilkins; Journal of the Antibacterium and Antifungal Agents, 19(9), 489-495 (1991); “Picture book of Fungi” (último volume), 1006-1045 (1977), Koudan-sya; Compendium of Soil Fungi Repriní, 1993, 83-85). Como resultado, identificou-se o presente fungo como Aspergillus candidus Link ex Link 1824. A estirpe foi depositada sob o número de concessão FERM P-15439 no National Institute ofBioscience and Human Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, 305, Japão) em 15 de Fevereiro, 1996 e depois transferiu-se para o International Deposition segundo o tratado de Budapeste em 21 de Março, 1997, sob o número de concessão FERM BP-5882.

Como meio para produzir o presente composto (I), utiliza-se de preferência meio quer sintético quer natural que contenha uma quantidade adequada de fontes de carbono, fontes de azoto e minerais. Pode-se também utilizar opcionalmente vitaminas ou outros nutrientes, se necessário.

As fontes de carbono a serem usadas são pelo menos uma seleccionada de fontes gerais de carbono tais como açúcares como a glucose, maltose, frutose, sacarose, amido e outros do género, álcoois como o glicerol, manitol e outros do género, aminoácidos como a glicina, alanina, asparagina e outros do género, ácidos orgânicos como o ácido glucónico, ácido pirúvico, ácido acético e outros do género, ácidos gordos e os seus glicéridos como o

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ΕΡ 0 895 981 /PT 5 ácido oleico, ácido esteárico e outros do género, em deferência da utilização do microorganismo.

As fontes de azoto a serem usadas são pelo menos uma seleccionada de compostos orgânicos azotados tais como pó de soja, licor de infusão de milho, extracto de carne de vaca, peptona, extracto de levedura, vários aminoácidos e outros do género, e compostos inorgânicos azotados tais como os sais de amónio, sais de nitrato, e outros de género, em deferência da utilização do microorganismo.

Pode-se adicionar, se necessário, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de magnésio, sulfato de cobre, cloreto de manganês, sulfato de zinco, cloreto de cobalto ou vários fosfatos, como minerais.

Pode-se adicionar, se necessário, um agente de deformação tal como óleo de plantas, banha, polipropilenoglicol ou outros do género. A adição a um meio de uma substância sólida, tal como a celulose cristalina ou pasta, pode tomar a fermentação estável. A temperatura da cultura pode variar desde que se deixe o microorganismo crescer e produzir o composto (I), no entanto, prefere-se 15-30°C e prefere-se particularmente 20-26°C. O pH preferível é cerca de 6-8, um período de cultura habitual é de alguns dias a algumas semanas e pode-se terminar a cultura quando a produção do composto (I) atingir um patamar. Como método de cultura, pode-se utilizar preferencialmente qualquer um dos métodos usuais tais como cultura em fase sólida, cultura em ventilação-agitação e outros do género. No passo de cultura pode-se também produzir, ao mesmo tempo, um composto (II), um percursor do composto (I).

Um método para separar e isolar o produto de fermentação de uma cultura inclui métodos usuais para separar e purificar produtos de fermentação que combine adequadamente uma filtração, uma separação centrífuga, uma adsorção, uma desadsorção e cromatografia com várias resinas de permuta iónica ou outros absorventes activos, uma extracção com vários solventes orgânicos e outros do género. Por exemplo, extracta-se um corpo de microorganismo separado de uma cultura com um solvente orgânico (acetato de etilo, acetona, metiletilcetona e outros do género), separado e purificado por combinação de cromatografia em sílica gel com cromatografia líquida de alta eficiência. 6 85 590

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Processo por síntese química

No caso em que um composto obtido por fermentação seja um percursor do composto (I) do presente invento (um composto representado pela fórmula (II)), pode-se submeter o composto a uma reacção de 3-metil-2-butenilação para originar o composto (I) do presente invento em condições adequadas.

Dissolve-se um percursor num solvente orgânico como a acetona, dioxano, tetra-hidrofurano ou outro do género e adiciona-se à solução um catalisador básico como um hidróxido ou um carbonato de um metal alcalino ou um metal alcalino-terroso, uma amina terciária ou outro do género. Exemplos do hidróxido ou carbonato de um metal alcalino ou de um metal alcalino-terroso incluem carbonato de sódio, hidrogenocarbonato de sódio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio, hidróxido de bário, carbonato de cálcio e outros do género. Como amina terciária, exemplifica-se a trietilamina e outras do género.

Adiciona-se à solução obtida halogeneto de 3-metil-2-butilo, tal como o brometo de 3-metil-2-butenilo ou outro do género, para a reacção selectiva de 3-metil-2-butenilação para originar o composto (I) do presente invento.

Submete-se a alquilação um dos compostos (I) do presente invento, onde R1 e R2 são hidroxi na fórmula (I) (a seguir referido como composto (1-1)), para obter um composto onde R! seja hidroxi e R2 seja metoxi (a seguir referido como composto (1-3)).

Concretamente, dissolve-se o composto (1-1) num solvente orgânico e adiciona-se à solução um catalisador básico tal como um hidróxido ou um carbonato de um metal alcalino ou um metal alcalino-terroso, uma amina terciária ou outro do género. Os exemplos do solvente orgânico e do catalisador básico tal como um hidróxido ou um carbonato de um metal alcalino ou de um metal alcalino-terroso, uma amina terciária ou outro do género incluem os mesmos descritos acima. Pode-se submeter o composto a metilação, adicionando à solução obtida um metilador, tal como um éster de sulfato de metilo, como sulfato de dimetilo, sulfato de benzeno, etc., ou um halogeneto de metilo, como iodeto de metilo, brometo de metilo, etc. O presente composto (I) inclui os seus sais concebíveis e farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, sais com metais alcalinos tais como sódio, potássio, etc., e com metais alcalino-terrosos tal como cálcio, bário, etc. Podem-se formar os sais por meio de uma reacção usual.

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ΕΡ 0 895 981 / PT 7 Ο presente composto (I) inclui os seus hidratos e pode coordenar uma ou mais moléculas de água por molécula do presente composto (I). O composto (I) do presente invento tem potentes actividades imunossupressora e anti-inflamatória. Tem uma actividade de supressão da produção de citóquinas como as IL-2, IL-4 e IL-5, uma potente actividade anti-proliferativa em células T e células B e/ou uma actividade supressora da produção de anticorpos (por exemplo, IgE, IgG, etc., especialmente IgE) assim como uma actividade anti-proliferativa em células de tumor. Pode portanto ser administrado, como composição farmacêutica, a animais incluindo humanos, para suprimir uma reacção imune, uma inflamação ou uma proliferação de células de tumor. O composto (I) do presente invento é eficaz como agente imunossupressor ou anti-inflamatório para prevenir ou tratar doenças alérgicas tais como sintomas de rejeição de transplante de um órgão ou tecido, reacção de enxerto contra hospedeiro causada por um transplante de medula óssea, doenças alérgicas (por exemplo, asma brônquica, uma rinite alérgica, uma dermatite alérgica, uma atopia e outras do género), um síndroma de leucócitos eosinófilos elevados, uma conjuntivite alérgica, um lupus eritematoso sistémico, uma miosite múltipla, uma miosite dérmica, uma esclerose sistémica progressiva, MCTD, uma artrite reumatóide crónica, uma doença inflamatória intestinal, uma lesão por uma re-perfusão isquémica. O composto (I) é útil como agente anti-cancro para tratar tumores tais como um cancro sanguíneo, um cancro sólido, etc.

Quando se administra o composto (I) como composição farmacêutica, pode-se administrar oral e parentericamente, com segurança. No caso de uma administração oral, pode ser em qualquer uma das formas usuais, tais como comprimidos, grânulos, pós, cápsulas, pílulas, soluções, xaropes, comprimidos bucais, comprimidos sublinguais e outros do género. Quando a composição é administrada parentericamente, qualquer uma das formas usuais é preferível, por exemplo, injecções tais como injecção intramuscular e injecção intravenosa, um supositório, um agente endémico, um vapor e outros do género. Uma administração oral é especialmente preferível.

Pode-se fabricar uma composição farmacêutica, se necessário, misturando uma quantidade eficaz do composto (I) com vários aditivos farmacêuticos apropriados para a forma, tais como excipientes, aglutinantes, agentes humidificantes, desintegradores, lubrificantes e diluentes. Quando a composição está numa injecção, pode-se esterilizar um componente activo junto com um transportador adequado para originar uma composição farmacêutica.

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Especifícamente, os exemplos dos excipientes incluem lactose, sacarose, glucose, amido, carbonato de cálcio, celulose cristalina e outros do género, os exemplos de aglutinantes incluem metilcelulose, carboxima pirrolidona e outros do género, os exemplos de desintegradores incluem carboximetilcelulose, carboximetilcelulose sódica, amido, alginato de sódio, ágar, laurilsulfato de sódio e outros do género, e os exemplos dos lubrificantes incluem talco, estearato de magnésio, macrogol e outros do género. Pode-se utilizar óleo de cacau, macrogol, metilcelulose e outros do género, como materiais de base de supositórios. Quando a composição é produzida na forma de soluções, injecções emulsionadas ou injecções de suspensão, pode-se adicionar-lhes aceleradores de dissolução, agentes de suspensão, emulsionantes, estabilizantes, conservantes, agentes isotónicos e outros do género, e quando é produzida para uma administração oral, podem-se adicionar agentes edulcorantes, aromas e outros do género.

Embora uma dosagem do composto (I) como agente imunossupressor, agente anti-inflamatório ou agente anti-cancro deva ser determinada tendo em conta a idade e peso do paciente, tipo e grau das doenças, e via de administração, uma dosagem oral usual para humanos adultos é de 0,05-100 mg/kg/dia e a dosagem preferível é de 0,1-10 mg/kg/dia. No caso em que é administrado parentericamente, embora a dose dependa fortemente da via de administração, uma dosagem usual é de 0,005-10 mg/kg/dia e a dosagem preferível é de 0,01-1 mg/kg/dia. Pode-se administrar a dosagem apenas numa ou em algumas administrações separadas. O presente invento é ainda explicado pelos Exemplos seguintes, que não pretendem limitar o âmbito do presente invento.

Exemplos

Exemplo 1

Separação e isolamento do composto (1) 1. Processo de fermentação

Inoculou-se a fermentação de Âspergillus candidus RF-5762: Aspergillus candidus que se tinha colocado em cultura em rampa num tubo de teste, num balão meyer de 500 ml contendo 100 ml de um meio que compreendia 5,0% de glucose, 5,0% de licor de infusão de milho, 0,2% de carbonato de cálcio e água da rede (pH 7,0 antes da esterilização) e fez-se a cultura a 25°C durante 4 dias num agitador rotativo a 220 rpm. Inoculou-se cada 4 ml do caldo de cultura em vinte balões meyei de 500 ml, contendo 100 ml do meio de fermentação

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ΕΡ 0 895 981 / PT 9 que compreendia 2,0% de glicerol, 2,0% de sacarose, 0,3% de extracto de carne de vaca, 0,2% de extracto de levedura (pH 7,0 antes da esterilização) e fez-se a cultura a 23°C durante 12 dias num agitador rotativo a 180 rpm. 2. Processo de separação e purificação

Separou-se por filtração a pressão reduzida 2 L do caldo total obtido pelo processo de fermentação, em filtrado e bolo micelial. Depois de se extractar o bolo micelial com 500 ml de acetona duas vezes e de se filtrar a pressão reduzida, concentrou-se o filtrado a pressão reduzida, combinou-se com o filtrado anterior, extractou-se com acetato de etilo (pH 6, 500 ml x 2), lavou-se com água, evaporou-se para retirar um solvente a pressão reduzida, para originar 7,85 g de substância em bruto. Em 30 ml de clorofórmio, dissolveram-se 7,85 g da substância bruta e submeteu-se a cromatografia em sílica gel (Merck Kieselgel 60, 70-230 mesh, 32 mm d.i. x 300 mm). A substância foi revelada com 300 ml de clorofórmio e depois 400 ml de clorofórmio:metanol (20:1). Recolheram-se e concentraram-se num sólido a pressão reduzida as Fr. 1-3 (420 ml) contendo os compostos (1-1), (Π-1), (1-2) e (1-3), para se obter 0,657 g de uma substância parcialmente purificada.

As Fr. 4—7 (280 ml) subsequentemente eluídas continham um composto (Π-2) e concentraram-se num sólido para se obter 0,577 g de substância parcialmente purificada. Depois, obteve-se 1,6 g de um composto (II-3) a partir das Fr. 8-9 (210 ml) eluídas com 400 ml de clorofórmio :metanoI (20:1,5) e obteve-se 1,46 g de substância parcialmente purificada contendo um composto (III) a partir das Fr. 10-12 (160 ml), eluídas com 300 ml de clorofórmio metanol (20:10) na qual se aumentou a quantidade de metanol. 2.1. Separação dos compostos (Ί-11. (11-11. (1-21 e (1-3)

Submeteram-se as Fr. 1-3 (0,657 g), substância parcialmente purificada contendo os compostos (1-1), (II-1), (1-2) e (1-3), a cromatografia em sílica gel (Merck Kieselgel 60, 70-230 mesh, 20 mm d.i. x 350 mm) mais uma vez. Em 5 ml de um solvente de revelação tolueno:acetonitrilo (85:15) dissolveram-se 0,657 g de substância parcialmente purificada e revelou-se com o mesmo solvente para ser separada em fracções de 5 g cada. As Fr. 13-16 continham o composto (1-2), as Fr. 23-26 continham o composto (1-3) e as Fr 27-33 continham os compostos (1-1) e (II-1), e concentrou-se cada fracção num sólido para se obter, respectivamente, 97 mg, 128 mg e 117 mg. 10 85 590

ΕΡ 0 895 981 / PT 2.2. Purificação dos compostos (Ί-11 e (II-l)

Deitaram-se numa coluna de sílica gel (Merck Kieselgel 60, 70-230 mesh, 20 mm d.i. x 350 mm) 117 mg do sólido contendo os compostos (1-1) e (II-l) dissolvidos em 3 ml de um solvente de revelação tolueno:acetonitrilo (90:10), e revelou-se com o mesmo solvente para se separar em fracções de 5 g cada. Eluíram-se os compostos (1-1) e (Π-l) em Fr. 48-65 (90 ml). Concentraram-se as fracções num sólido a pressão reduzida para se obter uma fracção de 90 mg. Separou-se o obtido e purificou-se por cromatografia líquida de pressão média. A coluna usada foi YMC GEL ODS-AM 120-S50, 20 mm d.i. x 500 mm, e o solvente de revelação usado foi solução aquosa de acetonitrilo a 50%. A fracção eltiída a 594-648 ml continha o composto (II-l) e a fracção a 702-756 ml continha o composto (1-1). Recolheu-se cada uma das fracções e concentrou-se a pressão reduzida para remover o acetonitrilo. Extractou-se o resíduo com acetato de etilo, secou-se em sulfato de sódio anidro e concentrou-se num sólido para produzir 10 mg de pó incolor puro (Π-l) e 70 mg de pó incolor puro (1-1). O composto (II-l) era um composto onde R1 e R2 eram hidrogénio na fórmula (II) e 4”-desoxiterfenilina descrito no Chemical Pharmaceutics Bulletin, 24 (4), 613-620(1976).

Composto (1-1): R1=R2=OH Nome do composto: 3 ’ ,61 -dimetoxi-4-(3-metil-2-buteniloxi)- [ 1, Γ :4 ’, Γ ’ ] terfenil-3,2 ’ ,4” -triol Aparência: Cristal prismático incolor

Solubilidade: Solúvel em acetona, acetato de etilo e clorofórmio. Insolúvel em água. P. f.: 155,5-156°C HR-LSIMS, m/z: calculado para C25H26O6: 422,1728; observado: 422,1730 [M]+ LSI-MS, m/z: 422 [M]+ UV (metanol) nm (ε): 230 (sh), 277 (25, 700) 235 (sh), 297 (26, 200), adicionou-se NaOH 0,01 N 230 (sh), 276 (24, 500), adicionou-se HC1 0,01 N IV cm'1 (KBr): 3393,2932,1611,1588,1522, 1490,1117, 1071, 1001. ’Η-RMN (acctona-d6, 600 MHz) Ô: 1,77 (3H; do género s largo); 1,79 (3H, do género s largo); 3,37 (3H,s); 3,73 (3H,s); 4,63 (2H, do género d largo, J=6,6 Hz); 5,52 (lH,m); 6,49 (lH,s); 6,83 (1H, dd, J=2,2;8,2 Hz); 6,92 (1H, d, J=2,2 Hz); 6,94 (2H,m); 6,96 (1H, d, J=8,2 Hz), 7,54 (2H,m); 7,62 (1H, s lg.); 7,78 (lH,s); 8,64 (1H, s lg).

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EPO 895 981 / PT 11 13C-RMN (acetona-dô, 150 MHz) δ: 18,31 (q); 26,00 (q); 56,04 (q); 60,67 (q), 66,18 (t); 103,85 (d), 112,75 (d); 116,06 (d); 117,61 (s); 118,97 (d); 121,44 (d); 123,15 (d); 127,91 (s); 130,48 (s); 130,85 (d); 133,54 (s); 137,50 (s); 140,04 (s), 146,23 (s); 146,79 (s); 149,24 (s); 154,51 (s); 157,79 (s). TLCRf (detectado com reagente de ácido sulfúrico concentrado): 0,23 (tolueno:acetonitrilo=85:15) HPLC: Tempo de retenção: 5,6 minutos

Coluna: YMC-Pack ODS-AM, AM-302, 4,6 d.i. x 150 mm (YMC Co., Ltd.) Fase móvel: acetonitrilo:água=55:45 Caudal: 1 ml/minuto Detecção: 280 nm (UV) 2.3. Purificação do composto (1-21

Submeteram-se 97 mg de um sólido contendo o composto (1-2) a cromatografia líquida de pressão média. A coluna usada foi YMC GEL ODS-AM120-S5, 20 mm d.i. x 500 mm e o solvente de revelação usado foi solução aquosa de acetonitrilo a 70%. Recolheu-se a fracção eluída a 375-435 ml e concentrou-se a pressão reduzida para remover acetonitrilo. Extractou-se o resíduo obtido com acetato de etilo, secou-se em sulfato de sódio anidro e concentrou-se num sólido para se produzirem 70 mg de um composto puro (1-2) na forma de pó incolor.

Composto (1-2): R=H, r2=oh Nome do composto: 3’,6’-dimetoxi-4-(3-metil-2-buteniloxi)-[l,r:4’,r,]terfenil-3,2’-diol Aparência: Pó incolor

Solubilidade: Solúvel em acetona, acetato de etilo e clorofórmio. Insolúvel em água. HR-LSIMS, m/z: calculado para C25H26O5: 406,1779; observado: 406,1780 [M]+ LSI-MS, m/z: 406 [M]+ UV (metanol) nm (ε): 225 (sh), 274 (17600) 225 (sh), 255 (sh), 295 (26200), adicionou-se NaOII 0,01 N 225 (sh), 273 (18000), adicionou-se HC1 0,01 N IV cm'1 (KBr): 3506, 3465, 2934,1585, 1518, 1408, 1116,1070,1008. 'H-RMN (acetona-dô, 600 MHz) δ: 1,77 (3H; do género s); 1,78 (3H, do género s); 3,38 (3H,s); 3,73 (3H,s); 4,63 (2H, do género d largo); 5,53 (lH,m); 6,52

85 590

ΕΡ 0 895 981 / PT 12 (lH,s); 6,84 (1H, dd, J=2,0;8,2 Hz); 6,93 (1H, d, J=2,0Hz); 6,97 (1H, d, J=8,2 Hz); 7,35 (lH,m), 7,44 (lH,s); 7,46 (2H, m); 7,65 (lH,s); 7,66 (2H,m). 13C-RMN (acetona-dfo 150 MHz) δ: 18,34 (q); 26,00 (q); 56,26 (q); 61,04 (q), 66,44 (t); 104,45 (d), 113,10 (d); 118,63 (d); 119,07 (s); 121,56 (d); 123,28 (d); 127,96 (s); 128,25 (d); 129,35 (d); 129,84 (d); 133,85 (s); 137,70 (s); 139,65 (s), 140,46 (s); 146,50 (s); 147,07 (s); 149,40 (s); 154,78 (s). TLCRf (dctectado com reagente de ácido sulfúrico concentrado): 0,54 (tolueno:acetonitrilo=85:15) HPLC: Tempo de retenção: 13,5 minutos

Coluna: YMC-Pack ODS-AM, AM-302, 4,6 d.i. x 150 mm (YMC Co., Ltd.) Fase móvel: acetonitrilo:água=55:45 Caudal: 1 ml/minuto Detecção: 280 nm (UV) 2.4. Purificação do composto (1-31

Após dissolução de 128 mg do sólido contendo o composto (1-3) em 1 ml de acetonitrilo com aquecimento, e se ter retirado por filtração o precipitado que se formou ao deixar-se à temperatura ambiente, concentrou-se num sólido o filtrado obtido para se produzirem 35 mg de um resíduo. Separou-se o resíduo e purificou-se por cromatografia líquida de alta eficiência. Uma coluna usada foi YMC-Pack ODS-AM, 20 mm d.i. x 150 mm e o solvente de revelação usado foi solução aquosa de acetonitrilo a 70%. Recolheram-se fracções de 5 mg cada eluídas a 72-76 ml, concentraram-se a pressão reduzida e evaporaram-se para remover o acetonitrilo. Extractou-se o resíduo obtido com acetato de etilo, secou-se em sulfato de sódio anidro e concentrou-se num sólido para se produzirem 2,7 mg de um composto puro (1-3) na forma de pó incolor.

Composto (1-31: R'=OH, R2OCH3 Nome do composto: 3,3’,6,-trimetoxi-4-(3-metil-2-buteniloxi)-[l,l,:4’,l”]terfenil-2’,4”-diol Aparência: Pó incolor

Solubilidade: Solúvel em acetona, acetato de etilo e clorofórmio. Insolúvel cm água. HR-LSIMS, m/z: calculado para C26H2806: 436,1884; observado: 436,1880 [M]+ LSI-MS, m/z: 436 [M]+ UV (metanol) nm (ε): 230 (sh), 278 (25300)

235 (sh), 295 (25100), adicionou-se NaOH 0,01 N

85 590

EP Q 895 981 / PT

230 (sh), 278 (24500), adicionou-se HC10,01 N IR cm'1 (KBr): 3430, 2432, 1612, 1522, 1488, 1398, 1237, 1116, 1075 'H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) δ: 1,77 (3H; do género s lg.); 1,79 (3H, do género s lg.); 3,38 (3H,s); 3,74 (3H,s); 3,80 (3H,s); 4,59 (2H, do género d largo, J=6,7 Hz); 5,53 (lH,m); 6,50 (lH,s); 6,93 (1H, dd, J=2,0;8,3 Hz); 6,95 (2H,m); 6,97 (1H, d, J=8,3 Hz); 6,99 (1H, d, J=2,0 Hz); 7,54 (2H, m); 7,83 (lH,s); 8,65 (1H.S). 13C-RMN (acetona-dô, 150 MHz) δ: 18,19 (q); 25,84 (q); 56,13 (q); 56,16 (q); 60,65 (q), 66,18 (t); 104,17 (d), 113,80 (d); 116,06 (d); 116,42 (d); 117,70 (s); 121,63 (d); 124,37 (d); 127,73 (s); 130,50 (s); 130,79 (d); 133,66 (s); 137,40 (s); 140,17 (s), 148,37 (s); 149,16 (s); 149,98 (s); 154,52 (s); 157,80 (s). TLCRf (detectado com reagente de ácido sulfúrico concentrado): 0,34 (tolueno:acetonitrilo=85:15) HPLC: Tempo de retenção: 7,4 minutos

Coluna: YMC-Pack ODS-AM, AM-302, 4,6 d.i. x 150 mm (YMC Co., Ltd.) Fase móvel: acetonitrilo:água=55:45 Caudal: 1 ml/minuto Detecção: 280 nm (UV) 2.5. Purificação do composto ÍII-21

Purificaram-se 0,577 g de uma substância parcialmente purificada contendo o composto (ΙΙ-2) por cromatografia em sílica gel (Merck Kieselgel 60, 70-230 mesh, 2,4 mm d.i. x 200 mm). Em 3 ml de tolueno:acetonitrilo (80:20), dissolveram-se 0,577 g da substância parcialmente purificada, revelou-se com o mesmo solvente e recolheram-se as Fr. 1-3 (120 ml) e concentrou-se a pressão reduzida para se produzir 420 mg de substância parcialmente purificada. Separou-se o resíduo obtido e purificou-se por cromatografia líquida de pressão média. Uma coluna usada foi YMC GEL ODS-AM 120-S50,20 mm d.i. x 500 mm e o solvente de revelação usado foi solução aquosa de acetonitrilo a 40%. Após ter-se recolhido a fracção eluída a 432-468 ml, concentrou-se a fracção a pressão reduzida para remover o acetonitrilo. Extractou-se o resíduo com acetato de etilo, secou-se em sulfato de sódio anidro e concentrou-se num sólido para se produzirem 90 mg de um composto puro (11-2) na forma de pó incolor. O composto (II-2) era um composto em que R1 é hidróxido c R2 é hidrogénio na fórmula (II), terfenilina descrita em Agricultural Biological Chemistry, 49(3), 867-868 (1985).

85 590

ΕΡ0 895 981 /PT 14 2.6. Purificação do composto (ΊΙ-3)

Dissolveram-se em metanol (6 ml) 1,6 g da substância parcialmente purificada contendo o composto (II.3). Adicionou-se à solução Norit SX (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (80 mg) e agitou-se durante uma hora à temperatura ambiente. Retirou-se o Norit por filtração, adicionou-se água (14 ml) e dissolveu-se, com aquecimento, o precipitado que se formou, e a seguir deixou-se à temperatura ambiente durante a noite. Filtrou-se o cristal em agulha incolor que se formou para se obter 1,0 g do composto puro (II-3). O composto (II-3) era um composto em que R1 e R2 eram ambos hidroxi na fórmula (II), a 3-hidroxiterfenilina descrita em Agricultural Biological Chemistry, 49(3), 867-868 (1985). 2.7. Purificação do composto (III)

Purificaram-se 1,46 g de uma substância parcialmente purificada contendo o composto (III) por cromatografia em sílica gel (Merck Kieselgel 60, 70-230 mesh, 2,4 mm d.i. x 200 mm). Em 12 ml de tolueno:acetonitrilo (80:20), dissolveram-se 1,46 g da substância parcialmente purificada e revelou-se com o mesmo solvente. Recolheram-se as Fr. 4-8 (200 ml) e concentrou-se a pressão reduzida para se produzirem 800 mg de composto puro (III) na forma de pó incolor. O composto (III) era a 3,3”-di-hidroxilterfenilina descrita em Agricultural Biological Chemistry, 49(3), ,867-868 (1985).

Exemnlo 2 Síntese do composto tl-lla partir do composto (ΊΙ-31 A uma solução de acetona (5 ml) de 354 mg do composto (ΙΙ-3), adicionaram-se 402 mg de carbonato de potássio anidro e 149 mg de brometo de prenilo com 2 ml de acetona e agitou-se à temperatura ambiente durante seis horas. Depois de se retirar por filtração a substância insolúvel, concentrou-se o filtrado a pressão reduzida para se obter produto bmto. Submeteu-se o produto bmto a cromatografia em coluna de pressão média (coluna: YMC GEL ODS-AM 120-S5,20 mm d.i. x 500 mm; solvente: solução aquosa de acetonitrilo a 50%) para a separar em fracções de 10 g cada. O composto (1-1) eluiu nas Fr. 43-50. Depois de se concentrarem as fracções a pressão reduzida para remover o acetonitrilo, extractou-se o resíduo com acetato de etilo, secou-se em sulfato de sódio anidro e concentrou-se num sólido para se obterem 138 mg de um composto puro (1-1). 15 85 590

ΕΡ 0 895 981 /PT

Teste 1

Efeito de supressão contra a reaccão mitopénica de esplenócitos de ratos, in vitro

1.1 Efeito de supressão de uma reaccão de concanavalina A (Con AI

Adicionaram-se, a cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços, 5xl05 esplenócitos de rato RDF1 em suspensão em 0,1 ml de soro de vitelo fetal a 10%. Adicionou-se meio fortificado com RPMI 1640 (adicionaram-se 2 mM de bicarbonato de sódio, 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina e 5xlO'5M de 2-mercaptoetanol). A cada poço, adicionaram-se 5 pg/ml de Con A como mitogénico e o composto (1-1), (1-2) ou (1-3) de uma concentração pré-determinada de modo a que o volume final de cada poço atingisse 0,2 ml. Dissolveu-se cada composto do presente invento em dimetilsulfóxido (DMSO) e diluiu-se com o meio RPMI 1640 acima para ajustar a concentração final para lOOng/ml ou menos. Fez-se a cultura de esplenócitos na placa de microtitulação de 96 poços a 37°C durante 48 horas numa incubadora, mantendo a humidade a 100%, o dióxido de carbono a 5% e o ar a 95%. Marcaram-se as células por impulso radioactivo com 3H-timidina (18,5 Kbq/poço) antes de 6 horas de colheita. Após a cultura, recolheram-se as células por um dispositivo de colheita e mediu-se a radioactividade incluída nas células para se utilizar como indicador de uma actividade de proliferação de células. Usou-se meio isento de Con A (-Con A) como controlo. Os resultados encontram-se no Quadro 1.

Quadro 1 (i-D (1-2) (1-3) Concentração do composto (ng/ml) Radioactividade cpm± SD Supressão (%) Radioactividade cpm ± SD Supressão (%) Radioactividade cpm ± SD Supressão (%) -Con A 3440 + 568 100 3440 ±568 100 3440 ± 568 100 0 277061 +7118 0 277061 ±7118 0 277061 ±7118 0 0,25 292470 + 542 -5,6 281904 ± 6522 -1,8 285408 ± 7252 -3,1 0,98 210046 + 3288 24,5 281371 ±10119 -1,6 266173 ± 6208 4,0 3,91 56871 ±1554 80,5 191575 ±6969 30,9 101504+1326 64,2 15,6 11366 + 372 97,1 41660 ±531 86,0 20510 ± 287 93,8 62,5 6411 +246 98,9 11793 ±235 96,9 7755 ± 624 98,4 250,0 6404 ± 403 98,9 8233 ±254 98,2 7522 ± 485 98,5 IC50 (ng/ml) 1,2 5,6 2,0

85 590 ΕΡ Ο 895 981 / ΡΤ 16

Como se apresenta no Quadro 1, os compostos (1-1), (1-2) e (1-3) suprimiram significativamente a reacção de Con A de esplenócitos de rato, dependendo da concentração de composto. 1.2 Supressão de uma reaccão de liponolissacárido

Examinou-se uma supressão da reacção pelo mesmo método descrito no ponto 1.1 acima, exceptuando-se o facto de se usar lipopolissacárido (LPS, 10 pg/ml) em vez de concanavilina A. Usou-se meio isento de LPS (-LPS) como controlo. Os resultados encontram-se no Quadro 2.

Quadro 2 (1-1) (1-2) (1-3) Concentração do composto (ng/ml) Radioactividade cpm ± SD Supressão (%) Radioactividade cpm 1 SD Supressão (%) Radioactividade cpmi SD Supressão (%) -LPS 2939 ±167 100 2939+ 167 100 2939 + 167 100 0 153851 15649 0 153851 15649 0 153851 +5649 0 0,98 15339616123 0,3 20802318941 -35,9 184366110625 -20,2 3,91 88405 1 10394 43,4 13283415106 13,9 12843614167 16,8 15,6 32548 + 315 80,4 78686 + 4135 49,8 46765 + 2209 71,0 62,5 160701944 91,3 398241651 75,6 22961 ±1187 86,7 250,0 15046 1 344 92,0 22312 + 1122 87,2 14962 1 866 92,0 IC50 (ng/ml) 4,5 15,6 8,0

Como se mostra no Quadro 2, os compostos (1-1), (1-2) e (1-3) têm um potente efeito supressivo na reacção de LPS de esplenócitos de rato que depende da concentração do composto.

Teste 2

Actividade inibitória da proliferação de células do composto (1-1) A cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços, adicionou-se um número pré-determinado de várias estirpes de células (0,1 ml) e fez-se uma pré-cultura durante um dia nas mesmas condições de cultura do Teste 1. A cada poço adicionaram-se 0,1 ml do composto (1-1), de modo a que a concentração ficou na gama de 0-10000ng/ml. Depois da cultura durante 3-4 dias, adicionaram-se a cada poço 25 μΐ de solução 6 mg/ml de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-iI)-2,5-difeniltetrazóIio] (Sigma) e fez-se a cultura das células a 37°C durante 4 horas nas mesmas condições que acima. Após a cultura, 85 590

EP 0 895 981 / PT 17 adicionaram-se 50 μΐ de solução de ácido clorídrico 0,02 N e de dodecilsulfato de sódio a 20% ao formazano formado e deixou-se a 37°C durante 24 horas para dissolver o formazano. Mediu-se uma intensidade de absorção (OD) de formazano gerada em proporção ao número de células vivas com um imunoleitor (InterMed) equipado com um filtro de 570 nm (The Journal of Immunological Method, N° 65, p.55-63, 1983). Calculou-se a concentração de 50% de inibição de uma proliferação de células (IC50) a partir de uma correlação entre a concentração do composto (T-l)ea intensidade de absorção. Os resultados encontram-se no Quadro 3.

Quadro 3 Célula Origem Meio ,J N° de células/poço IC50 (ng/ml) CCD-19Lu Pneumócito humano normal MEM 2xl04 >10000 Lu-99 Cancro humano de célula grande pulmonar RPMI1640 2xl03 1,0 CCFR-CEM Célula de leucemia humana RPMI1640 5xl03 0,2 P388 Célula de leucemia de rato RPMI 1640 5xl02 12,0

Meio 11: MEM é um meio em que se adiciona soro de vitelo fetal a 10% a um MEM de Eagle; e RPMI-1640 é o mesmo meio descrito no Teste 1, exceptuando o facto de um meio para células humanas não conter 2-mercaptetanol.

Como se mostra no Quadro 3, o composto (1-1) tem uma actividade anti-proliferativa em células de tumor mas não em pneumócitos CCD-19Lu normais.

Exemplo de Formulação 1

Composto (1-1) 50 mg

Lactose 46 mg

Amido de milho 20 mg

Hidroxipropilcelulose pouco substituída 8 mg

Hidroxipropilmetilcelulose 5 mg

Estearato de magnésio 1 mg

Total 130 mg

Após todos os componentes, excepto a hidroxipropilmetilcelulose e o estearato de magnésio, serem uniformemente misturados, adicionou-se à mistura uma solução aquosa a 18 85 590

ΕΡ 0 895 981 / PT 8% (ρ/ρ) de hidroxipropilmetilcelulose como aglutinante, para produzir grânulos para a formação de comprimidos por um método de granulação húmida. Misturaram-se esses grânulos com estearato de magnésio e depois enformaram-se em comprimidos orais (7 mm de diâmetro e 130 mg por comprimido) por meio de uma prensa de comprimidos.

Aplicabilidade Industrial

Como se indicou nos Exemplos experimentais acima, o composto (I) do presente invento tem uma potente actividade imunossupressora, anti-inflamatória e anti-proliferativa nas células de tumor. O composto (I) do presente invento é muito útil para agente imunossupressor, anti-inflamatório e anti-cancerígeno.

Lisboa, "6. KAR. 2Q01

Por SHIONOGI & CO., LTD. - O AGENTE OFICIAL -

EMS.* AMTÔHIO lÕAC DA CÍJNBA FERREIRt

Af. O}. Pr. Ind.

Rm des Flores, 74-4. ieao lisboa

Claims

85 590 ΕΡ 0 895981/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composto da fórmula (I):

onde R1 é hidrogénio ou hidroxi e R2 é hidroxi ou metoxi, seus sais farmaceuticamente aceitáveis ou seus hidratos.
2. Processo para produzir o composto, seus sais ou hidratos farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a reivindicação 1, que compreende efectuar a cultura de microorganismos Aspergillus candidus RF-5762 depositados como FERM BP-5882 e isolar o composto da cultura obtida.
3. Processo para produzir o composto, seus sais e hidratos farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a reivindicação 1, que compreende submeter a 3-metíl-2-butenilação um composto de fórmula (II): OMe

(Π) onde R1 é hidrogénio ou hidroxi e R2 é hidroxi ou metoxi.
4. Composição farmacêutica que compreende o composto, seus sais ou hidratos farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a reivindicação 1, como componente activo. ΕΡ Ο 895 981 /ΡΤ 2/2
5. Composição farmacêutica que compreende o composto, seus sais ou hidratos farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a reivindicação 1, para se utilizar como agente imunossupressor, agente anti-inflamatório ou agente anti-tumor.
6. Utilização do composto, dos seus sais ou hidratos farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a reivindicação 1, para o fabrico de um medicamento para supressão de uma rcacção imune, tratamento ou prevenção de inflamação ou tratamento de tumor.
7. Microorganismo que é Aspergillus candidus RF-5762, depositado como FERM BP-5882. Φ Lisboa, -6. fttíl 2001 Por SHIONOGI & CO., LTD. - O AGENTE OFICIAL -

EN6.* ANTÓNIO JOAO »A CUNHA FERREIRA As. Of. Pr. fnd. Rh· das Fleres, 74 - 4.* ieao lisboa