CN113214056B - 联苯类化合物和二萜类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

联苯类化合物和二萜类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提取自真菌Aspergillus candidus的发酵液的联苯类化合物和二萜类化合物，将该两类化合物作为新型神经元钙振荡调节剂进行活性研究，结果显示联苯类化合物和二萜类化合物均能有效影响小鼠原代大脑皮层神经元的兴奋性，并能解除癫痫诱发剂4‑氨基吡啶对神经元的刺激作用，可用于制备神经保护药物。因此，本发明为研制神经保护药物提供了先导化合物，并且有利于天然药用资源的开发和利用。

Description

联苯类化合物和二萜类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及来自于真菌Aspergillus candidus的发酵液的联苯类化合物和二萜类化合物、其制备方法以及在神经保护药物研发领域的应用。
背景技术
宿主珊瑚Junceelafragillis属于鞭柳珊瑚科灯芯柳珊瑚属海洋无脊椎动物。对于珊瑚Junceelafragillis的研究较多，但对其共附生微生物化学成分的研究较少，目前已从该种柳珊瑚中分离得化合物主要为萜类化合物(详见Ping-Jyun S,Su-Hui W,Chiang MY,et al.Discovery of New Chlorinated Briaranes from Junceella fragilis[J].Bull.Chem.Soc,2009,82(11):1426-1432；Sung P J,Lin M R,Chen W C,etal.Fragilide A,a Novel Diterpenoid from Junceella fragilis[J].Cheminform,2010,35(6):1229-1230；García,Miguel,Rodríguez,Jaime,Jiménez,Carlos.Absolutestructures of new briarane diterpenoids from Junceella fragilis[J].Journal ofNatural Products,1999,62(2):257-260.)。
共附生真菌Aspergillus candidus是属于散囊菌目发菌科曲霉属的一种真菌，常存在于土壤、粮食、发霉药材等中，也是一种常见的珊瑚共附生真菌。已分离得到的次生代谢产物主要有联苯类、聚酮类、生物碱类等化合物(详见KUROBANE I,VINING L C,MCINNESA G,et al.3-Hydroxyterphenyllin,a new metabolite of Aspergilluscandidus.Structure elucidation by H and C nuclear magnetic resonancespectroscopy[J].JAntibiot(Tokyo),1979,32(6):559-564；WEI H,INADAH,HAYASHI A,etal.Prenylterphenyllin and its dehydroxyl analogs,new cytotoxic substancesfrom amarine-derived Fungus Aspergillus candidus IF10[J].J Antibiot(Tokyo),2007,60(9):586-590；MA J,ZHANG X L,WANG Y,et al.Aspergivones A and B,two newflavones isolated from a gorgonian-derived Aspergillus candidus fungus[J].NatProd Res,2016,31(1):32-36；BUTTACHON S,RAMOS A A,IN CIOet al.Bis-IndolylBenzenoids,Hydroxypyrrolidine Derivatives and Other Constituents fromCultures of the Marine Sponge-Associated Fungus Aspergillus candidus KUFA0062[J].MarDrugs,2018,16(4))。
目前尚未见有关从该种真菌中分离到能够调节神经元兴奋性的两联苯和二萜类化合物的报道。
发明内容
本发明依托上述研究进行，第一方面提供从珊瑚Junceelafragillis共附生真菌Aspergillus candidus的发酵液中提取分离得到的15个已知(A2-A16)和3个新的联苯类化合物(A1，A17，A18)以及3个已知的(A19-A21)和3个新的二萜类化合物(A22-A24)。
真菌Aspergillus candidus的种属经18S rRNA基因序列分析进行鉴定：将得到的基因序列在NCBI数据库进行检索，结果显示该真菌的18S rRNA基因序列与菌种Aspergillus candidus相似度为100％(GenBank登记号AB008396.1)，购买途径：ATCC34331。
联苯类化合物具有下列化学结构通式：
化合物A1-12的基团搭配分别如下表所示：
编号 化合物 R1 R2 R3 R4
A1 - H OH X OMe
A2 3″-Hydroxyl-Prenylterphenyllin X OH OH OH
A3 3-Methoxy-4″-deoxyterprenin OMe OX H H
A4 3-Hydroxyterphenyllin OH OH H OH
A5 4-O-methylprenylterphenyllin X OMe H OH
A6 Terphenyllin H OH H OH
A7 3-Methoxyterprenin OMe OX H OH
A8 PrenylterphenyllinJ OMe OMe X OH
A9 3,3″-dihydroxyterphenyllin OH OH OH OH
A10 Deoxyterhenyllin H OH H H
A11 Prenylterphenyllin X OH H OH
A12 PrenylterphenyllinB H OH X OH
化合物A13-16的基团搭配分别如下表所示：
化合物A17-18的基团搭配分别如下表所示：
编号 R
A17 OH
A18 COOMe
二萜类化合物具有下列化学结构通式：
化合物A19-23的基团搭配分别如下表所示：
编号 化合物 R1 R2
A19 Asperindole A Cl OAc
A20 Asperindole C Cl YOAc
A21 Asperindole D H YOAc
A22 - H OH
A23 - Cl YOH
化合物A24的基团搭配分别如下表所示：
编号 R1 R2
A24 Cl YOH
表中，X表示CH2CHC(CH3)2；Y表示OCOCH(CH3)2。本发明第二方面，还提供了上述化合物的制备方法如下：
A、菌株发酵液的制备：将菌株接种至生物麦芽提取物(biomalt)琼脂(agar)培养基(3％biomalt，2％agar)，在28℃发酵28天。
B、制备总粗提物
将20L菌株发酵液，按常规乙酸乙酯超声提取，将提取液减压浓缩，得总粗提物13.6g。
C、分离纯化
将粗浸膏进行正相硅胶柱层析(200～300目)，采用二氯甲烷/甲醇体系进行梯度洗脱(v/v 100:0,100:1,80:1,60:1,40:1,30:1,20:1,10:1,4:1)，收集流分，经TLC分析合并得13个组分(Fr.1～Fr.13)。
将组分Fr.2(52.7mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到4个组分(Fr.2a～Fr.2d)；Fr.2a(6.1mg)经半制备高效液相分离得到化合物A3(1.3mg,MeOH/H2O 89:11,1.5mL/min,tR 18min)。
组分Fr.5(29.9mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到6个组分(Fr.5a～Fr.5f)；组分Fr.5e(6.1mg)经半制备高效液相分离得到化合物A5(3.1mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR 24min)。
组分Fr.6(644.9mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到8个组分(Fr.6a～Fr.6h)；组分Fr.6e(215.8mg)经正相硅胶柱层析，使用石油醚:乙酸乙酯＝39:1至6:4梯度洗脱，然后经半制备高效液相分离得到化合物A7(1.2mg,MeOH/H2O 79:21,1.5mL/min,tR 18min)，A8(0.9mg,MeOH/H2O79:21,1.5mL/min,tR 21min)，A1(1.2mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR 33min)，A20(2.3mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR63min)，A19(1.8mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR 50min)，A21(1.1mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR 36min)；组分Fr.6f(54.7mg)同样经正相硅胶柱层析后，经半制备高效液相分离得到化合物A23(1.2mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR44 min)，A24(0.7mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR 25min)；组分Fr.6g(18.7mg)经正相硅胶柱层析后，经半制备高效液相分离得到化合物A10(0.8mg,MeOH/H2O 70:30,2mL/min,tR 23min)，A22(0.9mg,MeOH/H2O 70:30,2mL/min,tR 64min)；组分Fr.6h(52.4mg)经半制备高效液相分离得到化合物A16(1.6mg,MeOH/H2O 65:35,2mL/min,tR 30min)，A11(1.5mg,MeOH/H2O 65:35,2mL/min,tR 48min)，A12(1mg,MeOH/H2O 65:35,2mL/min,tR 51min)。
组分Fr.7(788.8mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到6个组分(Fr.7a～Fr.7f)；组分Fr.7c(17.7mg)经半制备高效液相分离得到化合物A6(3mg,MeOH/H2O 75.2:24.8,1.5mL/min,tR 11.5min)，A15(6.5mg,MeOH/H2O 79:21,1.5mL/min,tR 28min)。
组分Fr.8(164.7mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到13个组分(Fr.8a～Fr.8m)；组分Fr.8h(19.8mg)经半制备高效液相分离得到化合物A6(3.6mg,MeOH/H2O 70:30,1.5mL/min,tR 13min)，A2(0.5mg,MeOH/H2O 70:30,1.5mL/min,tR 20min)，A15(3.1mg,MeOH/H2O 70:30,1.5mL/min,tR 41min)；组分Fr.8k(16.9mg)经半制备高效液相分离得到化合物A13(9.8mg,MeOH/H2O 65:35,2mL/min,tR 18min)。
组分Fr.9(364.2mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到11个组分(Fr.9a～Fr.9k)和A4(50mg)。
组分Fr.10(649.6mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到14个组分(Fr.10a～Fr.10n)和A14(11.6mg)；组分Fr.10g(29.3mg)经半制备高效液相分离得到化合物A18(2mg,MeOH/H2O 70:30,2mL/min,tR 27.5min)；组分Fr.10i(84.5mg)经正相硅胶柱层析后，经半制备高效液相分离得到化合物A17(2.5mg,MeOH/H2O58:42,2mL/min,tR42 min)。
组分Fr.11(201mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到9个组分(Fr.11a～Fr.11i)；组分Fr.11h(20mg)经半制备高效液相分离得到化合物A9(13mg,MeOH/H2O 55:45,2mL/min,tR 11min)。
组分Fr.12(285.4mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到15个组分(Fr.12a～Fr.12o)；组分Fr.12i(9.1mg)经半制备高效液相分离得到化合物A6(2.2mg,MeOH/H2O 55:45,2mL/min,tR 23min)。
通过红外、紫外、质谱和二维核磁共振等多种现代光谱技术的综合解析进行结构鉴定，确定了化合物的化学结构。
本发明的第三方面，还提供了上述所述的联苯类化合物和二萜类化合物或各自的药用盐在制备调节神经兴奋性药物中的用途。
优选的，该调节神经兴奋性药物为降低神经元钙振荡程度的药物。
优选的，所述联苯类化合物为A6、A9、A14、A17或A18，所述二萜类化合物为A24。经实验验证，这些化合物对小鼠原代大脑皮层神经元的兴奋性能够产生明显的影响，并能解除癫痫诱发剂4-氨基吡啶(4-aminopyridine，简称4-AP)对神经元的刺激作用，可用于神经保护药物的研发。
优选的，药用盐为化合物的有机酸或无机酸盐：无机酸盐包括药物的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐或硝酸盐；有机酸盐包括药物的乙酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐或草酸盐。
本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，特别是调节神经兴奋性的药物组合物，包括上述所述的联苯类化合物和二萜类化合物或各自的药用盐，以及药学上可接受的载体。
本发明技术效果如下：
经过实验验证，本发明中的上述部分化合物在较低的微摩尔浓度下能明显影响神经元的兴奋性，并能解除癫痫诱发剂4-氨基吡啶对神经元的刺激作用，因此可用于制备相应的神经保护类的药物。本发明为研制新的神经保护药物提供了先导化合物，并且有利于开发利用海洋药用资源。
附图说明
图1为本发明的化合物A6对小鼠神经元的自发同步钙振荡影响的测试数据图；其中A为A6处理的皮层神经元的钙振荡在加入Veh/4-AP前后的活动痕迹；(B)和(C)为A6抑制钙振荡频率和幅度的浓度-效应关系；(D)和(E)为A6抑制4-AP引发的钙振荡频率和幅度变化的浓度-效应关系。
图2为本发明的化合物A9对小鼠神经元的自发同步钙振荡影响的测试数据图；其中A为A9处理的皮层神经元的钙振荡在加入Veh/4-AP前后的活动痕迹；(B)和(C)为A9影响钙振荡频率和幅度的浓度-效应关系。
图3为本发明的化合物A14对小鼠神经元的自发同步钙振荡影响的测试数据图；其中A为A14处理的皮层神经元的钙振荡在加入Veh/4-AP前后的活动痕迹；(B)和(C)为A14影响钙振荡频率和幅度的浓度-效应关系。
图4为本发明的化合物A17对小鼠神经元的自发同步钙振荡影响的测试数据图；其中A为A17处理的皮层神经元的钙振荡在加入Veh/4-AP前后的活动痕迹；(B)和(C)为A17抑制钙振荡频率和幅度的浓度-效应关系；(D)和(E)为A17抑制4-AP引发的钙振荡频率和幅度变化的浓度-效应关系。
图5为本发明的化合物A18对小鼠神经元的自发同步钙振荡影响的测试数据图；其中A为A18处理的皮层神经元的钙振荡在加入Veh/4-AP前后的活动痕迹；(B)和(C)为A18抑制钙振荡频率和幅度的浓度-效应关系；(D)和(E)为A18抑制4-AP引发的钙振荡频率和幅度变化的浓度-效应关系。
图6为本发明的化合物A24对小鼠神经元的自发同步钙振荡影响的测试数据图；其中A为A24处理的皮层神经元的钙振荡在加入Veh/4-AP前后的活动痕迹；(B)和(C)为A24抑制钙振荡频率和幅度的浓度-效应关系；(D)和(E)为A24抑制4-AP引发的钙振荡频率和幅度变化的浓度-效应关系。
具体实施方式
现结合实施例对本发明作详细描述。
实施例1联苯类化合物和二萜类化合物的制备
1、菌株发酵液的制备：将菌株接种至生物麦芽提取物(biomalt)琼脂(agar)培养基(3％biomalt，2％agar)，在28℃发酵28天。
2、制备总粗提物
将20L菌株发酵液，按常规乙酸乙酯超声提取，将提取液减压浓缩，得总粗提物13.6g。
3、分离纯化
将粗浸膏进行正相硅胶柱层析(200～300目)，采用二氯甲烷/甲醇体系进行梯度洗脱(v/v 100:0,100:1,80:1,60:1,40:1,30:1,20:1,10:1,4:1)，收集流分，经TLC分析合并得13个组分(Fr.1～Fr.13)。
将组分Fr.2(52.7mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到4个组分(Fr.2a～Fr.2d)；Fr.2a(6.1mg)经半制备高效液相分离得到化合物A3(1.3mg,MeOH/H2O 89:11,1.5mL/min,tR 18min)。
组分Fr.5(29.9mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到6个组分(Fr.5a～Fr.5f)；组分Fr.5e(6.1mg)经半制备高效液相分离得到化合物A5(3.1mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR 24min)。
组分Fr.6(644.9mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到8个组分(Fr.6a～Fr.6h)；组分Fr.6e(215.8mg)经正相硅胶柱层析，使用石油醚:乙酸乙酯＝39:1至6:4梯度洗脱，然后经半制备高效液相分离得到化合物A7(1.2mg,MeOH/H2O 79:21,1.5mL/min,tR 18min)，A8(0.9mg,MeOH/H2O79:21,1.5mL/min,tR 21min)，A1(1.2mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR 33min)，A20(2.3mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR63min)，A19(1.8mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR 50min)，A21(1.1mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR 36min)；组分Fr.6f(54.7mg)同样经正相硅胶柱层析后，经半制备高效液相分离得到化合物A23(1.2mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR44 min)，A24(0.7mg,MeOH/H2O 80:20,2mL/min,tR 25min)；组分Fr.6g(18.7mg)经正相硅胶柱层析后，经半制备高效液相分离得到化合物A10(0.8mg,MeOH/H2O 70:30,2mL/min,tR 23min)，A22(0.9mg,MeOH/H2O 70:30,2mL/min,tR 64min)；组分Fr.6h(52.4mg)经半制备高效液相分离得到化合物A16(1.6mg,MeOH/H2O 65:35,2mL/min,tR 30min)，A11(1.5mg,MeOH/H2O 65:35,2mL/min,tR 48min)，A12(1mg,MeOH/H2O 65:35,2mL/min,tR 51min)。
组分Fr.7(788.8mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到6个组分(Fr.7a～Fr.7f)；组分Fr.7c(17.7mg)经半制备高效液相分离得到化合物A6(3mg,MeOH/H2O 75.2:24.8,1.5mL/min,tR 11.5min)，A15(6.5mg,MeOH/H2O 79:21,1.5mL/min,tR 28min)。
组分Fr.8(164.7mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到13个组分(Fr.8a～Fr.8m)；组分Fr.8h(19.8mg)经半制备高效液相分离得到化合物A6(3.6mg,MeOH/H2O 70:30,1.5mL/min,tR 13min)，A2(0.5mg,MeOH/H2O 70:30,1.5mL/min,tR 20min)，A15(3.1mg,MeOH/H2O 70:30,1.5mL/min,tR 41min)；组分Fr.8k(16.9mg)经半制备高效液相分离得到化合物A13(9.8mg,MeOH/H2O 65:35,2mL/min,tR 18min)。
组分Fr.9(364.2mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到11个组分(Fr.9a～Fr.9k)和A4(50mg)。
组分Fr.10(649.6mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到14个组分(Fr.10a～Fr.10n)和A14(11.6mg)；组分Fr.10g(29.3mg)经半制备高效液相分离得到化合物A18(2mg,MeOH/H2O 70:30,2mL/min,tR 27.5min)；组分Fr.10i(84.5mg)经正相硅胶柱层析后，经半制备高效液相分离得到化合物A17(2.5mg,MeOH/H2O58:42,2mL/min,tR42 min)。
组分Fr.11(201mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到9个组分(Fr.11a～Fr.11i)；组分Fr.11h(20mg)经半制备高效液相分离得到化合物A9(13mg,MeOH/H2O 55:45,2mL/min,tR 11min)。
组分Fr.12(285.4mg)经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(2:1)洗脱剂洗脱得到15个组分(Fr.12a～Fr.12o)；组分Fr.12i(9.1mg)经半制备高效液相分离得到化合物A6(2.2mg,MeOH/H2O 55:45,2mL/min,tR 23min)。
4、结构鉴定
通过红外、紫外、质谱和二维核磁共振等多种现代光谱技术的综合解析进行结构鉴定，确定了化合物的化学结构。
A1：无色无定形固体；UV(MeCN)λmax(logε)276(1.77),248(0.96),209(3.11)nm；IR(film)νmax 3357,3198,2922,2852,1659,1609,1520,1485,1462,1396,1361,1174,1112,1073,1029,834,815cm-1；HRESIMS m/z 421.2039[M+H]+(calcd for C26H29O5,421.2010)。1H和13C核磁共振数据见表1和表2。
A2：无色无定形固体；UV(MeCN)λmax(logε)277(1.36),250(0.96),210(3.14)nm；IR(film)νmax 3346,2953,2922,2853,1724,1665,1607,1461,1410,1377,1260,1182,1093,1019,799,722cm-1；HRESIMS m/z 423.1787[M+H]+(calcd for C25H27O6,423.1802)。1H和13C核磁共振数据见表1和表2。
A3：无色无定形固体；UV(MeCN)λmax(logε)275(1.36),250(0.98),202(3.40)；IR(film)νmax 3486,3356,3203,3056,2924,2853,1664,1601,1517,1483,1461,1399,1359,1266,1237,1224,1176,1139,1117,1075,1036,1011,929,829,771,734,701cm-1；HRESIMSm/z 421.2027[M+H]+(calcd for C26H29O5,421.2010)。1H和13C核磁共振数据见表1和表2。
A4：黄色油状；m/z 353.1030[M-H]-(calcd for C20H17O6,353.1031)。1H和13C核磁共振数据见文献：Kurobane I,Vining L C,Mcinnes AG,et al.3-Hydroxyterphenyllin,anew metabolite of Aspergillus candidus.Structure elucidation by H and Cnuclear magnetic resonance spectroscopy[J].JAntibiot(Tokyo),1979,32(6):559-564.
A5：黄色无定形固体；HRESIMS m/z 443.18243[M+Na]+(calcd for C26H28O5Na,443.18290)。1H和13C核磁共振数据见文献：Yan W,Wuringege,Li S J,et al.New p-terphenyls from the endophytic fungus Aspergillus sp.YXf3[J].Bioorg Med ChemLett,2017,27(1):51-54.
A6：黄色油状；HRESIMS m/z 337.1095[M-H]-(calcd for C20H17O5,337.1081)。1H和13C核磁共振数据见文献：Kurobane I,Vining L C,Mcinnes A G,et al.3-Hydroxyterphenyllin,a new metabolite of Aspergillus candidus.Structureelucidation by H and C nuclear magnetic resonance spectroscopy[J].J Antibiot(Tokyo),1979,32(6):559-564.
A7：白色粉末；HRESIMS m/z 437.1920[M+H]+(calcd for C26H29O6,437.1959)。1H和13C核磁共振数据见文献：T K.Terprenins,novel immunosuppressants producedbyAspergillus candidus[J].JAntibiot(Tokyo),1998,4(51):
A8：无色无定形固体；HRESIMS m/z 449.1926[M-H]-(calcd for C27H29O6,449.1970)。1H和13C核磁共振数据见文献：Zhou G,Chen X,Zhang X,et al.Prenylated p-Terphenyls from a Mangrove Endophytic Fungus,Aspergillus candidus LDJ-5[J].Journal ofNatural Products,2020,83(1):8-13.
A9：黄色油状；HRESIMS m/z 371.1121[M+H]+(calcd for C20H19O7,371.1125)；m/z369.0997[M-H]-(calcd for C20H17O7,369.0980)。1H和13C核磁共振数据见文献：Liu S S,Zhzo B B,Lu C H,et al.Two New p-Terphenyl Derivatives from the Marine FungalStrain Aspergillus sp AF119[J].Natural Product Communications,2012,7(8):1057-1062.
A10：无色无定形固体；HRESIMS m/z 345.10906[M+Na]+(calcd for C20H18O4Na,345.10973)。1H和13C核磁共振数据见文献：Takahashi,Yoshihira,Natori,et al.Thestructures of toxic metabolites of Aspergillus candidus.I.The compounds A andE,cytotoxic p-terphenyls[J].Chemical&pharmaceutical bulletin,1976,
A11：无色无定形固体；HRESIMS m/z 429.16680[M+Na]+(calcd for C25H26O5Na,429.16725)。1H和13C核磁共振数据见文献：Wei H,Inada H,Hayashi A,etal.Prenylterphenyllin and Its Dehydroxyl Analogs,New Cytotoxic Substancesfrom aMarine-derived Fungus Aspergillus candidus IF10[J].J Antibiot(Tokyo),2007,60(9):586-590.
A12：无色无定形固体；HRESIMS m/z 429.16695[M+Na]+(calcd for C25H26O5Na,429.16725)。1H和13C核磁共振数据见文献：Cai S,Sun S,Zhou H,et al.PrenylatedPolyhydroxy-p-terphenyls from Aspergillus taichungensis ZHN-7-07[J].Journalof Natural Products,2011,74(5):1106-1110.
A13：无色无定形固体；HRESIMS m/z 353.1030[M+H]+(calcd for C20H17O6,353.1020)。1H和13C核磁共振数据见文献：Liu S S,Zhzo B B,Lu C H,et al.Two New p-Terphenyl Derivatives from the Marine Fungal Strain Aspergillus sp AF119[J].Natural Product Communications,2012,7(8):1057-1062.
A14：无色无定形固体；HRESIMS m/z 369.0986[M+H]+(calcd for C20H17O7,369.0969)。1H和13C核磁共振数据见文献：Liu S S,Zhzo B B,Lu C H,et al.Two New p-Terphenyl Derivatives from the Marine Fungal Strain Aspergillus sp AF119[J].Natural Product Communications,2012,7(8):1057-1062.
A15：无色无定形固体；HRESIMS m/z 419.1535[M-H]-(calcd for C25H23O6,419.1500)。1H和13C核磁共振数据见文献：Cai S,Sun S,Zhou H,et al.PrenylatedPolyhydroxy-p-terphenyls from Aspergillus taichungensis ZHN-7-07[J].Journalof Natural Products,2011,74(5):1106-1110.
A16：无色无定形固体；HRESIMS m/z 367.1179[M+H]+(calcd for C21H19O6,367.1176)；m/z 365.1045[M-H]-(calcd for C21H17O6,365.1031)。1H和13C核磁共振数据见文献：Wang W,Liao Y,Tang C,et al.Cytotoxic andAntibacterial Compounds from theCoral-DerivedFungusAspergillus tritici SP2-8-1[J].Mar Drugs,2017,15(11):
A17：黄色无定形固体；UV(MeCN)λmax(logε)276(2.43),256(1.39),242(2.67),227(2.05),209(3.04),203(2.98)nm；IR(film)νmax 3359,3192,2922,2852,1658,1632,1612,1522,1497,1469,1399,1266,1227,1206,1174,1112,1091,1029,865,831,738,704cm-1；HRESIMS m/z 337.1055[M+Na]+(calcd for C18H18NaO5,337.1046)。1H和13C核磁共振数据见表3和表4。
A18：黄色无定形固体；UV(MeCN)λmax(logε)275(3.21),255(1.98),240(3.43),227(2.95),212(3.67)nm；IR(film)νmax 3354,3001,2924,2853,1741,1660,1611,1522,1497,1437,1400,1267,1213,1172,1104,1080,1028,830,671,601cm-1；HRESIMS m/z357.1349[M+H]+(calcd for C20H21O6,357.1333)。1H和13C核磁共振数据见表3和表4。
A19：白色粉末；HRESIMS m/z 524.1819[M-H]-(calcdfor C29H31NO6Cl,524.1845)。1H和13C核磁共振数据见文献：Ivanets E V,Yurchenko A N,Smetanina O F,et al.Asperindoles A–D and a p-Terphenyl Derivative from theAscidian-Derived Fungus Aspergillus sp.KMM 4676[J].Mar Drugs,2018,16(7):232.
A20：白色粉末；HRESIMS m/z 610.2167[M-H]-(calcdfor C33H37NO8Cl,610.2213)。1H和13C核磁共振数据见文献：Ivanets E V,Yurchenko A N,Smetanina O F,et al.Asperindoles A–D and a p-Terphenyl Derivative from theAscidian-Derived Fungus Aspergillus sp.KMM 4676[J].Mar Drugs,2018,16(7):232.
A21：白色粉末； 1H and 13C NMR数据见Table；HRESIMS m/z 578.2746[M+H]+(calcd for C33H40NO8,578.2748)。1H和13C核磁共振数据见文献：Ivanets E V,Yurchenko AN,Smetanina O F,et al.Asperindoles A–D and ap-Terphenyl Derivative from the Ascidian-Derived Fungus Aspergillus sp.KMM 4676[J].Mar Drugs,2018,16(7):232.
A22：白色粉末；UV(MeCN)λmax(logε)279(0.40),268(0.38),230(1.88),210(1.15)nm；IR(film)νmax 3360,3191,2920,2851,1720,1658,1632,1468,1411,1260,1077,1016,930,885,800,742,633,506cm-1；ECD(MeCN,c4.5×10-6)λmax(Δε)238(-20.91)nm；HRESIMS m/z 472.20864[M+Na]+(calcd for C27H31NO5Na,472.20944)。1H和13C核磁共振数据见表5和表6。
A23：白色粉末；UV(MeCN)λmax(logε)285(0.41),267(0.30),236(2.26),209(0.89)nm；IR(film)νmax 3358,3190,2920,2851,1730,1659,1633,1467,1377,1260,1162,1083,1013,878,799,704,567,476cm-1；ECD(MeCN,c3.5×10-6)λmax(Δε)242(-39.92)nm；HRESIMS m/z 568.2122[M-H]-(calcd for C31H35NO7Cl,568.2108)。1H和13C核磁共振数据见表5和表6。
A24：白色粉末；UV(MeCN)λmax(logε)303(0.44),293(0.42),286(0.43),270(0.37),236(1.91),211(1.12)nm；IR(film)νmax 3349,2920,2851,1730,1659,1462,1377,1260,1183,1140,1089,1018,798,681,593cm-1；ECD(MeCN,c 3.5×10-6)λmax(Δε)228(+13.42),242(-24.29),322(+17.99),373(-10.36)nm；HRESIMS m/z592.20681[M+Na]+(calcd for C31H36NO7NaCl,592.2073)。1H和13C核磁共振数据见表5和表6。
表1 A1，A2和A3的氢谱数据
aChemical shifts(δ)inppm,and coupling constants(J)in Hz.
bAt 500MHz for 1HNMR experiments in CDCl3.
cAt 500MHz for 1HNMR experiments in CD3OD.
doverlapped signals.
表2 A1，A2和A3的碳谱数据
aAt 500MHz for 13C NMR experiments in CDCl3.
bAt 500MHz for 13C NMR experiments in CD3OD.
表3 A17和A18的氢谱数据
aChemical shifts(δ)inppm,and coupling constants(J)in Hz.
bAt 600MHz for 1HNMR experiments in DMSO.
cAt 500MHz for 1H NMR experiments in DMSO.
表4 A17和A18的碳谱数据
aAt 125MHz for 13C NMR experiments in DMSO.
表5 A22，A23和A24的氢谱数据
aChemical shifts(δ)in ppm,and coupling constants(J)in Hz.
bAt 500MHz for 1H NMR experiments in CDCl3.
cAt 600MHz for 1H NMR experiments in CDCl3.
dAt 500MHz for 1H NMR experiments in DMSO.
eoverlapped signals.
表6 A22，A23和A24的碳谱数据
aAt 125MHz for 13C NMR experiments in CDCl3.
bAt 125MHz for 13C NMR experiments in DMSO.
实施例2 本发明化合物对小鼠原代皮质神经元自发同步钙振荡的影响实验
1、小鼠大脑皮层神经元的分离与培养
C57Bl/6J小鼠大脑皮层神经元的分离与培养见参考文献(Zheng,J.；Yu,Y.；Feng,W.；Li,J.；Liu,J.；Zhang,C.；Dong,Y.；Pessah,IN.；Cao,Z.EnvironmentalHealthPerspectives 2019,127,67003)。取出生0-1天的乳鼠，断头，取大脑。在解剖镜下分离大脑皮层，仔细剥除脑膜，巴斯德吸管吹散后，胰蛋白酶37℃消化25min。在含有胰蛋白酶抑制剂(soybean)和脱氧核糖核酸酶I的解剖缓冲液中将皮层吹散为单细胞悬液，取细胞悬液离心(1000rmp/5min)。用Neuron Plating Media重悬，以1×106个cells/mL的密度接种于经0.5mg/mL的多聚-L-赖氨酸包被的96孔FLIPR板上，每孔150μL。24h-36h内加10μM阿糖胞苷，每孔10μL。细胞板培养于37℃、5％CO2和95％湿度的细胞培养箱中。第4天、第7天各换液一次。
2、胞内同步自发钙振荡的测定
原代神经元培养9天之后，吸弃96孔板中的培养基，每孔加入60μL含有染料的缓冲液(含有4μM Fluo-4和5％牛血清白蛋白的Lockes’缓冲液)，在37℃、5％CO2和95％湿度的环境下孵育45min-60min，然后用Lockes’缓冲液洗5次，最终每孔剩余150μL的液体。将细胞置入FLIPR中，激发波长为470-495nm，发射波长515-575nm，每1s读一个点。记录基线自发Ca2+振荡5分钟后，加入25μL浓度为终浓度8倍的化合物工作液，并监测[Ca2+]i 15分钟。为了测试化合物抗癫痫能力，加入癫痫引发剂25μL4-AP(80μM)，并继续监测[Ca2+]i，持续10分钟。给出的数据是F/F0的值，其中F是任何时间点的荧光强度，F0是基本荧光强度。
3、实验结果
对比对照组和本发明合物处理组的神经元钙离子振荡的活动(振幅和频率)来分析化合物对神经元兴奋性的影响。如图1所示，图1为化合物A6在不同浓度下对神经元钙振荡的影响。化合物A6浓度依赖性地降低钙振荡的频率和振幅，其频率IC50值为6.76μM，振幅IC50值为11.14μM。此外，A6还有效地抑制了4-AP诱导的皮质神经元钙振荡的过分活跃，其频率IC50值为23.96μM，振幅IC50值为27.81μM。化合物A17、A18和A24对神经元钙振荡的活动具有类似的抑制作用，见图4，图5和图6。另如图2和图3所示化合物A9和A14能够有效抑制自发钙振荡的振幅，其IC50值小于10μM，而对自发钙振荡的频率表现出增强作用，其EC50值在1μM上下。其余化合物对神经元钙振荡的活动影响不明显。
上述实验结果表明，本发明中的几个化合物在较低的微摩尔浓度下能明显影响神经元的兴奋性，并能解除癫痫诱发剂4-氨基吡啶对神经元的刺激作用，因此可用于制备相应的神经保护类的药物。本发明为研制新的神经保护药物提供了先导化合物，并且有利于开发利用海洋药用资源。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.提取自真菌Aspergillus candidus的发酵液的联苯类化合物和二萜类化合物或各自的药用盐在制备调节神经兴奋性药物中的用途，其特征在于：
所述联苯类化合物为下列化合物中的一种，
化合物A6
化合物A9
化合物A14
化合物A17-18的结构通式如下：
化合物A17-18的基团搭配分别如下表所示：
编号 化合物 R A17 - OH A18 - COOMe
；
所述二萜类化合物为化合物A24，结构式如下：
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，联苯类化合物和二萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A菌株发酵液的制备：将Aspergillus candidus菌株接种至含3％生物麦芽提取物及2％琼脂的培养基上，在28℃发酵28天；
B制备总粗提物：将菌株发酵液按常规乙酸乙酯超声提取，将提取液减压浓缩，得总粗提物；
C分离纯化：将粗浸膏通过200～300目正相硅胶柱层析，采用二氯甲烷/甲醇体系分别通过体积比为100:0,100:1,80:1,60:1,40:1,30:1,20:1,10:1,4:1进行梯度洗脱，收集流分，经TLC分析合并后，对合并后的组分进一步进行分离得到具体结构化合物。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，步骤C中，经TLC分析合并后得13个组分Fr.1～Fr.13，该13个组分的进一步分离步骤如下：
组分Fr.6经过Sephadex LH-20凝胶柱层析得到8个组分Fr.6a～Fr.6h；组分Fr.6f经正相硅胶柱层析及经半制备高效液相分离得到化合物A24；
组分Fr.7经过Sephadex LH-20凝胶柱层析得到6个组分Fr.7a～Fr.7f；组分Fr.7c经半制备高效液相分离得到化合物A6；
组分Fr.8经过Sephadex LH-20凝胶柱层析得到13个组分Fr.8a～Fr.8m；组分Fr.8h经半制备高效液相分离得到化合物A6；
组分Fr.10经过Sephadex LH-20凝胶柱层析得到14个组分Fr.10a～Fr.10n和A14；组分Fr.10g经半制备高效液相分离得到化合物A18；组分Fr.10i经正相硅胶柱层析及半制备高效液相分离得到化合物A17；
组分Fr.11经过Sephadex LH-20凝胶柱层析得到9个组分Fr.11a～Fr.11i；组分Fr.11h经半制备高效液相分离得到化合物A9；
组分Fr.12经过Sephadex LH-20凝胶柱层析得到15个组分Fr.12a～Fr.12o；组分Fr.12i经半制备高效液相分离得到化合物A6。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节神经兴奋性药物为降低神经元钙振荡程度的药物。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药用盐为化合物的有机酸或无机酸盐，
所述无机酸盐包括药物的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐或硝酸盐；
所述有机酸盐包括药物的乙酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐或草酸盐。
6.提取自真菌Aspergillus candidus的发酵液的联苯类化合物和二萜类化合物，其特征在于：
所述联苯类化合物为A17或A18，
其中，A17及A18的结构通式如下：
化合物A17-18的基团搭配分别如下表所示：
编号 化合物 R A17 - OH A18 - COOMe
；
所述的二萜类化合物为A24，
A24的结构式如下：
7.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求6所述的联苯类化合物和二萜类化合物或各自的药用盐，以及药学上可接受的载体。
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