DE2856410A1

DE2856410A1 - Peptid-antibiotikum und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2856410A1
Application number: DE19782856410
Authority: DE
Inventors: Shigeji Kondo
Original assignee: Kakenyaku Kako KK
Current assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-12-28
Filing date: 1978-12-28
Publication date: 1979-07-05
Also published as: GB2011425B; DE2856410C2; CA1115223A; SE432589B; LU80729A1; FR2413094A1; AU518767B2; ES476430A1; FR2413094B1; NZ189313A; GB2011425A; NL7812616A; SU786915A3; SE7813269L; NL175294B; NL175294C; JPS5492914A; US4221705A; AU4293978A; JPS5744664B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf K 582 M und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein gezüchtetes Medium, das durch Züchten eines K 582 M erzeugenden Mikroorganismus, der zum Genus Metarhizium gehört, und einer Mischung von K 582 M-A und -B gewonnen wurde, die aus diesem gezüchteten Medium erhalten wurde , und weiter auf K 582 M-A und K 582 M-B, die durch Abtrennen aus der Mischung aus K 582 M-A und -B gewonnen wurden, sowie auf das Verfahren zur Herstellung dieser Produkte.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein geradkettiges Peptid-Antibiotikum K 582 M einschließlich K 582 M - A und

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K 582 M-B geschaffen, das eine antibiotische, tumorverhindernde und andere biologische Wirkungen hat, . sowie das Verfahren zu dessen Herstellung. Das hier beschriebene K 582 M ist ein neues, geradkettiges Antibiotikum vom Peptidtyp, zusammengesetzt aus Arginin 1,Threonin 1,Tyrosin 1, Ornithin 2, Hydroxyarginin m und Lysin η als Aminosäurebestandteile sowie deren Salze. Das nachstehend beschriebene 582 M-A ist K 582 M, bei dem m von Hydroxyarginin und η von Lysin jeweils 1 und 1 erfsprechen.·und K 582 M - B ist K 582 M/ bei dem m von Hydroxyarginin und η von Lysin 2 bzw. O entsprechen.

Figuren 1 und 2 der Zeichnungen zeigen IR-Spektren von K 582 M-A (Hydrochlorid) bzw.K 582 M-B (Hydrochloric!) .

Figuren 3 und 4 der Zeichnungen zeigen UV-Spektren von K 582 M-A (Hydrochlorid)bzw. K 582 M-B (Hydrochlorid).

1 3 Figuren 5 und 6 zeigen ein C -NMR-Spektrum von K

582 M-A (Hydrochlorid) und K 582 M-B (Hydrochlorid). Figur 7 zeigt ein IR-Spektrum von K 582 M-A (Sulfat).

In dem gezüchteten Medium einer zum Genus Metarhizium gehörenden Art, die als K 582 M erzeugender Mikroorganismus verwendet wird, beispielsweise Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorok. var. anisopliae 582 M, sind Substanzen enthalten, die zur Verhinderung des Wachstums von verschiedenen wirklichen Pilzen, insbesondere Candida und andere Hefen, wirksam sind, und ebenfalls Substanzen enthalten,

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die gegen Viren wie Polio, Influenza etc. und gegen Tumore von Versuchstieren wirksam sind.

Die vorliegende Erfindung wurde durch die erfolgreiche Isolierung dieser beiden Substanzen mit ähnlichen Eigenschaften als neue aktive Peptidsubstanz aus dem gezüchteten Medium geschaffen.

Die Gattung Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorok. var. anisopliae 582 M wurde bei Kogyogiutsuin-Biseibutsu-Kogyo-Gijutsu-Kenkyujo (Japan) als FERM-P No. 4217 am 25. November 1977 und bei ATCC als ATCC Nr. 20500 am 27. Dezember 1977 hinterlegt. Die toxischen Eigenschaften dieser Gattung sind folgende:

Makroskopische Beobachtung:

Das Wachstum der Kolonie auf Malzextraktagar ist schnell und erreicht bei 25 C nach zwei Wochen einen Durchmesser von 4.5 - 5,0 cm.Sie zeigt eine etwas garbenartige Form.Sie ist flach oder gelegentlich radial eingezogen. Die Farbe der Kolonie reicht von dunkel-gräulichem Grün zu gelbgrün am sporenbildenden Mittelteil und weiß am Rand. Manchmal sind grüne und weiße Teile vermischt oder in Streifen ausgebildet. Ihre Rückseite reicht von algengelber bis beiger Farbe, und es ist keine Sekretflüssigkeit zu beobachten. Sie hat einen stimulierenden Geruch wie einige, die zum Genus Streptomyces gehören.

Mikroskopische Beobachtung:

Mycelium ist farblos und hat Cepten und Verzweigungen. Conidiophor ist kurz, farblos und besitzt Wände. Es erscheint in einzelner oder verzweigter Form. Eher als in

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einzelner Form ist es am Ende fein verzweigt ausgebildet, wie Penicillin, und bildet schließlich durch enge Versammlung von"firelands" (verzweigt oder spitziges Ende) eine Masse. An dem Teil, der eine lose Schicht bildet, entwickelt sich eine aus Konidien bestehende zylindrische Form. Das"fireland" ist lang und hat eine leicht zylindrische Form, die farblos ist und an ihren spitzigen Enden dünner wird. Außerdem ist es an seinen Enden mit langen Ketten von Konidien verbunden, die durch gegenseitige Verbindung eine lange zylindrische Form bilden. Conidium ist ein monozellulärer flacher helosporenartiger Typ und hat eine schwach grüngelbe Farbe; er ist zylindrisch oder lang ellipsenförmig ausgebildet, und die vier Ecken sind rund. Länge und Breite betragen jeweils 4,0 - 8.0 um und 2,0 - 2,5 μπι, liegen aber normalerweise im Bereich von 5,0 - 7,0 μηι. Candida ist zentripetal zur Bildung von Vielfachketten ausgebildet, die durch Zusammenkleben einen graugrünen großen Zylinder bilden.

Die Eigenschaften von Candida auf verschiedene Agar-Kultur medien sind wie folgt.

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- 7 Beobachtung an den verschiedenen Agar-Kulturmedien (28°C)

(beobachtet nach 20 Tagen)

CO CO FO

CD CO OO

Wachstumsbedingungen Wachstum Form Rand Winkelung

Sporenbildung u. Pigment Wassertropfen Farbe der Sporen

Czapek-pepton- Agar	gut	Kissen form	2iliär	gewinkelt	von gelbgrün bis dunkelgrün	erzeugt ·	keine
Czapek- Dox- Agar	gut	Knopf form	schmaler Lappen	Il	gelbgrün bis dunkelgrün	erzeugt	keine
Saburo-Agar	gut	Kissen form	ziliär	11	gelbgrün bis dunkelgrün	erzeugt	keine

Kornmehl-Agar

gering Mycelium- Zahnform

prüfung in unregelin Flach- mäßiger hext Anordnung

keine

dunkelgrün

keines keine

Malzagar

Normales
Agar

etwas
schwach
(weit ausgedehnt )

Mycelium[Welle ist dünn J
flach ·

keine

graugrün bis erzeugt keine dunkelgrün

Kartoffel- dextroseagar	etwas schwach	Mycelium ist dünn, flach	ziliär	keine	dunkelgrün	erzeugt	keine	N3
Gelatine- Agar	etwas schwach	Mycelium ist dünn, flach	Welle	keine	dunkelgrün	keines	keine	CO σ>

etwas Mycelium Welle schwach ist dick,

Schneeflockenform

keine

keines keine

Bei der Kultur nach der Erfindung kann allgemeines Wissen in Bezug auf die Kultivierung von Pilzen angewandt werden. Bezüglich des Kulturmediums und der Nährquellen können verschiedene Arten verwendet werden, jedoch werden als Kohlenstoffquellen vorzugsweise Zucker wie Dextrose, Sucrose, Levulose, Mannose, Glycerin, Stärken, Maltose, Xylose, Lactose, Molasse, Mannan verwendet. Als Stickstoffquellen können anorganische Salze wie Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid etc. sowie organische Stickstoffquellen wie Bouillon, Pepton, Korn-Einweichflüssigkeit, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Aminosäuren etc. verwendet werden. Die anderen geeigneten anorganischen Salze und Hilfsmittel etc. können bei Bedarf verwendet werden.

In Bezug auf das Kulturverfahren kann, selbst wenn man auf einem festen Kulturmedium züchtet, die Bildung von K 582 M erkannt werden, jedoch ist es für die Herstellung in großem Umfang am vorteilhaftesten, in einem flüssigen Kulturmedium zu züchten.

Die Kultivierung wird aerob bei einer Temperatur zwischen 20 und 37 C, vorzugsweise zwischen 28 und 30 C und einem pH-Wert zwischen 3.0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 5,4 und 5,6, durchgeführt. Falls erforderlich, kann in einem geeigneten Stadium ein Entschäumer beigegeben werden.

Um nach Beendigung der Fermentierung K 582 M aus dem Kulturmedium zu gewinnen, kann ein allgemein zur Gewinnung der Fermentierungsprodukte verwendetes Verfahren angewandt werden, beispielsweise Präzipitationsverfahren durch ein hydrophiles organisches Lösungsmittel, beispielsweise Äthanol,

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Aceton etc., ein Präzipitationsverfahren durch eine organische Säure, beispielsweise Pikrinsäure, Flaviansäure etc., Präzipitationsverfahren durch eine chemische Substanz, beispielsweise Phosphor-Wolframsäure, Natriumpentachlorphenol, Benzaldehyd etc., Extraktionsverfahren durch Methanol oder durch verschiedene Arten von aktiven Absorbtionsmitteln und auch durch ein Reinigungsverfahren durch Anwendung eines Ionenaustauschträgers, Molekularsiebchromatographie, Dichtheitsbestimmungsverfahren, Gegenstrom-Verteilerverfahren, Praktionierungsverfahren durch Salze, Lösungsmittel oder Metallionen, Elektrophoreseverfahren, Isolierungsverfahren durch die Bildung einer Komplex-Verbindung und einer geeigneten Kombination dieser Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Substanz.

Beispielsweise kann die erfindungsgemäße Substanz leicht durch ein Verfahren abgetrennt werden, das eine Präzipitation mit einer Reinigung durch ein Ionenaustauscherharz kombiniert, wobei dieses Verfahren Piltrierungsschritte durch Beigabe einer Filterhilfe, Behandlung des Filtrats mit einem sauren Ionenaustauscherharz oder einem basischen Ionenaustauscherharz und dann Elution mit einer Säure oder einem Alkali umfaßt.

Das so gewonnene Konzentrat wird durch die Verwendung des Ionenaustauscherharzes weiter konzentriert, dann werden geeignete Mengen Äthanol und Aceton zur Bildung eines rohen Pulvers einer K 582 M-A und B-Mischung beigegeben. Das so erhaltene rohe Pulver wird zur Schaffung eines gereinigten Produktes weiter mit Methanol, Tonerde, aktivem Kohlenstoff ,Molekular siebchroxnatographie etc. behandelt.

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Die so gewonnene K 582 M - A und B-Mischung enthält dieses K 582 M-A und K 582 M-B und zeigt Eigenschaften,

als ob beide gemeinsam in Bezug auf ihre physiochem.Eigenschaften existieren würden und hat auch physiologische Wirkungen wie antibiotische Aktivität, tumorverhindernde Aktivität, Beschleunigungs- und Verhinderungswirkungen auf die Immunität» Interferon induzierende Wirkungen etc.

Das z.B.so gewonnene gereinigte Produkt oder die gezüchtete Brühe oder das aus der Kulturbrühe durch Ionenaustauschträger gewonnene Eluat können mit verschiedenen Chromatographieverfahren behandelt werden, beispielsweise unter Verwendung von Polyacrylamidgel, CM-Cephadex, etc., um K 582 M-A Und K 582 M - B zu isolieren. Aus dem so gewonnenen K 582 M-A und K 582 M-B können unter Anwendung verschiedener Arten von Reinigung reinere Produkte hergestellt werden.

K 582 M-A und K 582 M - B hat folgende physiochemische Eigenschaften:

K 582 M-A (HCl-SaIz) K 582 M-B (HCl-SaIz)

1. Elementar-Analyse (%)

C: 39.35 C: 36.25

H: 7.24 H: 6. 61

N: 18.03 N: 18.62

C: 14,83 C: 14.06

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K 582 M - A (HCl-SaIz)

K 582 M - B (HCl-SaIz)

2. Molekulargewicht (gemessen durch die nachstehend genannten drei Verfahren; da jedoch diese Verfahren zu großen Fehlern im nachstehend genannten Molekulargewichts-Bereich führen, sollen die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanzen nicht durch die nachstehend gemessenen Molekulargewichtswerte beschränkt werden):

Ca.- 1300 (GeIfiltrierungsverfahren)

Ca. 1300 (Gefrierpunktverfahren) Ca. 1200 (Dampfdrückverfahren)

Ca. 1200 (GeIfiltrierungsverfahren

Ca. 1220 (Gefrierpunktverfahren )

Ca. 1200 (Dampfdruck-Verfahren)

3. Schmelzpunkt 192- 198 C (Zersetzung)

- 203 C (Zersetzung)

4. Spezifische Rotationskraft (da diese Werte entsprechend den Meßbedingungen sehr veränderlich sind, sollen die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanzen dadurch nicht beschränkt werden):

D²²=+O.2°(C=1%,H₂O)

5. Infrarotspektrum

K 582 M-A (Hydrochlorid) Fig. 1

D²²=+O.6°(C=1%,H₂O)

K 582 M-B (Hydrochlorid) Fig. 2

6. Ultraviolettes Absorptionsspektrum

Fig. 3

Fig. 4

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K 582 M-A (Hydrochlorid K 582 M-B (Hydrochlorid)

7. C¹³-NMR Spektrum

Fig. 5 Pig.

8. Löslichkeit

φ Hydrochlorid wie links

Leicht in Wasser löslich Methanol, schwach in
Äthanol löslich.
In Äther unlöslich,
Petroleum-Äther, Butanol Chloroform, Benzol.

(2) Hydro sulfat (insbesondere die Löslichkeit von Sulfaten

ist gezeigt).

Leicht in Wasser wie links

löslich,

schwach in Methanol
löslich. Unlöslich
in anderen Lösungsmitteln.

9. Farbreaktion:

Ninhydrin-Reaktion + wie links Xanthoprotein-Reaktion + Millonsche Reaktion+
Sakaguchi-Reaktion +
Paulys Reaktion +
Moüsch-Reaktion Tollen-Orcin-Reaktion Na-Nitroprusid-Reaktion -

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K 582 M-A

- 13 -

K 582 M-B

10. Natur (als freie Base) Basische Substanz

wie links

11. Farbe

Weißes amorphes Pulver

wie links

12. Präzipitations-Reaktion

Bei Zugabe folgender
Reagentien erfolgt eine Präzipitation: Phosphor wolf ramat, Pikrinsäure, Flaviansäure,
Pentachlorphenol/ Benzaldehyd.

13. Stabilität

Beständig in Säure und neutraler

Reaktion.

Etwas unbeständig bei basischer

Reaktion.

wie links

14. Zusammensetzung nach Hydrolyse mit Salzsäure (Molverhältnis)

Arginin 1 Threonin 1

Hydroxyarginin 2

Tyrosin 1 Ornithin 2 Lysin 0

Arginin	1
Threonin	1
Hydroxy-
arginin	1
Tyrosin	1
Ornithin	2
Lysin	1

15. Endständige Aminosäuren

C-endslärdig(Hydrazin-Digestionsverfahren)

Tyrosin Tyrosin

N-endständig(Dancylationsverfahren)

Arginin Arginin.

Biologische Aktivitäten von K 582 M-A und K 582 M-B, beides HCL-Salze.

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- 14 1.Antibiotischa Wirkungen von

(Verdünnungsmethode)

K 582 M-A und K 582 M-B

geprüfter Mikroorganis mus	minimale wachstumshemmende Konzentration (mc g/m/)	K 582 M-B
Candida albicans	K 582 M-A	0.4
" tropicalis	0.2	0.4
" pseudo— tropicalis	0.2	0.4
¹¹ utilie	0.2	0.4
" guilliermondii	0.2	0.4
¹¹ kr us ei	0.2	0.4
Saccharomyces cerevisiae Br-60	0.2	0.4
Saccharomyces rouxii bottlucue	0.2	0.4
Zygosaccharomyces salsus	0.2	0.4
Willia anomala	0.2	0.4
Torulaspora delbrückii	0.2	0.4
Rhodotorula lupra	0.2	0.4
Mycotorula	0.2	0.4
Debaryomyces kloecheri	0.2	0.4
Pullularia pullulana	0.2	0.4
Proteus OX-19	0.2	40
Bacillus subtilis	20	> 100
Staphylococcus aureus 209-P	>100	> 100
Eecherichia coli	>1OO	> 100
Shigella sonnei	^100	> 100
Sarcina lutea Hata	>100	y 100
>100

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Bacillus mycoides	> loo	> 100
Mycabacterium cytnote	>looo	> 1000
Mycobacterium Smegmatis	>1OOO	> 1000
Mycobacterium H _RV	>1000	> 1000
Trichohytpn asteiroide	J> 1000	> 1000
Trichohyton lpulam	> 1000	> 1000
Trichomonas waginalis	>1000	> 1000

Wie aus dem Vorstehenden hervorgeht, zeigen K 582 M-A und K 582 M-B eine starke antibiotische Aktivität gegen Candida-Mikroorganismen und andere Hefen.

2. Akute toxische Eigenschaften von K 582 M-A und K 582 M-B

Verabreichungsart	<T ?	Maus LD₁-Q K 582 M-A	mg/kg K 582 M-B
Intravenöse Verabreichung	S ?	120 - 144 144 - 1728	24.1 - 34.8 24.1 - 34.8
Intraper itoneaIe Verabreichung	S ?	über 300 über 300	43.2 - 57.2 43.2 - 57.2
Subkutane Verabreichung	?	320 oder mehr 320 oder mehr	86.8 - 104 104 - 125
Orale Verabreichung	über 6000 über 6000	2400 - 3000 2400 - 3000

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3. Tumorhemmende Wirkungen von K 582 M - A und K 582 M - B (a) Tumorhemmende Wirkungen bei tumortragenden Ratten

Gruppen von jeweils zehn Ratten des Donryu-Stammes (weiblich:

7
150 - 200 g) werden 10 Ascites-Leberkrebszellen AH 44 bzw. AH 66 in die Schwanzvene eingesetzt, dann wird nach Ablauf von 72 Stunden K 582 M-A oder K 582 MB - kontinuierlich zehnmal hintereinander in einer Dosis von 30 mg/kg oral Verabreicht, und nach 60 Tagen wird die Überlebensrate der Ratten bestimmt. Wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht, können in jeder tumortragenden Rattengruppe starke tumorhemmende Wirkungen, verglichen mit der Kontrollgruppe, die lediglich Nahrung erhalten hatte, festgestellt werden.

Überlebensrate (%) Tiergruppe

Tumorzelle Kontrolle K 582 M-A K 582 M-B

AH 44 0 100 50

AH 66 0 80 40

(b) Tumorhemmende Wirkungen bei tumortragenden Mäusen

Gruppen von je 10 Mäusen der dd-Gattung (weiblich: 20 g - 1.0 g) werden 10 Ehrlichsche Ascites-Krebszellen, Sarcomzellen S-180 bzw.Leukämie-Asciteskrebszellen SN 36 in die peritoneale Höhle der Maus eingesetzt, und nach Ablauf von 24 Stunden wird K 582 M-A oder K 582 M-B während 10 Tagen in einer Dosis von 25 mg/kg/Tag in die peritoneale Höhle jsler Maus

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verabreicht. Die Ergebnisse dieses Versuchs bei Verabreichung der erfindungsgemaßen Produkte zeigten stark tumorhemmende Wirkungen (Überlebensrate von 60 Tagen), wie dies aus der folgenden Tabelle hervorgeht, wogegen in der Kontrollgruppe alle Mäuse nach ca. 20 Tagen starben.

Überlebensrate der Mäuse (%)

Mäusegruppe Kontrolle K 582 M-A K 582 M-B Tumorzelle

Sarcomzellen

S-180 0 90 90

Ehrlichsche

Ascites-Krebs- 0 70 80

zellen

Leukämie-

Ascites-Krebs- 0 80 70

zellen SN 36

4. Andere biologische Wirkungen

(a) Wirkungen gegen das Immunsystem des lebenden Körpers

Es wurde nun als Ergebnis verschiedener Versuche herausgefunden, daß K 582 M-A und K 582 M-B Wirkungen auf die Immunität des lebenden Körpers (sowohl humoral als auch zellulär) haben. Insbesondere wurde nun auch gefunden, daß die erfindungsgemäßen Substanzen sowohl Beschleunigungsais auch Hemmwirkungen gegen das Immunsystem im Hämolysintiterverfahren durch SRBC-(rote Blutkörperchen von Schafen)Verabreichung haben; ein entsprechendes Beispiel dieser Wirkungen von K 582 M-B wird nachstehend gezeigt.

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Gruppen von jeweils 5-10 weiblichen Mäusen des ddl-Stammes wird K 582 M - B in einer Dosis von 25 mg/kg sowie 2/5 mg/kg pro Tag während 4 Tagen intraperitoneal verab- reicht, und 4 χ 10 SRBC werden in die Schwanzvenen eingegeben und die Verabreichung von K 582 M - B wird über weitere 4 Tage fortgesetzt; nach Beendigung der Verabreichung werden die Antikörperwerte im Blut gemessen. Eine Gruppe mit 25 mg/kg Verabreichung zeigte 77 % Antikörperwert, basierend auf der Kontrollgruppe, und eine Gruppe von 2,5 mg/kg Verabreichung zeigte 2 34 % Antikörperwert, basierend auf der Kontrollgruppe, und Gruppen mit höherer Verabreichungs-Konzentration zeigten Tendenzen zur Hemmung der Immunität, wogegen Gruppen mit niedrigerer Verabreichungs-Konzentration eine Tendenz zur Beschleunigung der Immunität zeigten.

(b) Wirksamkeit von Interferon induzierartigen Effekten.

Es wurde nun herausgefunden, daß, wenn K 582 M-A oder K M-B in einen lebenden Körper gegeben wird, es höhere Einheiten Interferon im Blut induziert. Als Beispiel sind diese Wirkungen von K 582 M - B nachstehend angegeben. Einer Maus vom dd-Stamm wird K 582 M-B oral in einer Dosis von 2,5 mg/kg verabreicht und der Interferontiter im Blut nach Ablauf der Zeit gemessen;nach 25 Stunden zeigt sich ein Maximalwert von 20 χ 10 I.U. Dies zeigt eine sehr stark interferon-induzierende Wirkung dieser Substanz. Solche Wirkungen sind auch bei anderen Tieren, wie Haushun, Hase, Hund, Schwein etc. zu beobachten. Bei den Versuchen mit Mäusen bezüglich einer Grippevirusinfektion zeigt sich, wenn 2 mg/kg K 582 M-B einer Maus 12 oder 24 Stunden vor

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der Infektion oral verabreicht werden, eine 30 - 40 %ige Verlängerung des Lebens.

Die Eigenschaften von K 582 M-A und K 582 M-B, wie vorstehend genannt, zeigen klar, daß dies neue Substanzen sind. Wenn K 582 M-A (H₂SO₄-SaIz) oder K 582 M-B (H₂SO₄-SaIz) verwendet wird, werden ähnliche Ergebnisse erzielt.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert; sie soll jedoch nicht nur auf diese beschränkt werden, und da die verschiedenen Eigenschaften der erfindungsgemaßen Substanzen klar dargelegt sind, ist es für den Fachmann naheliegend, daß, selbst wenn sie in Bezug auf den Rahmen der Erfindung nicht praktisch beschrieben sind, die Gegenstände der Erfindung auch durch Anwendung der abgeänderten Mittel gewonnen werden können.

Beispiel 1

(a) 200 ml flüssiges Kulturmedium (PH ca. 6)enthaltend 3.0 % Glucose, 1,0 % Polypepton, 0.2 % Natriumnitrat,

0.1 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0.05 % Kaliumchlorid, 0.05 % Magnesiumsulfat, 0.01 % Ferrosulfat, werden mit Metarhizium anisopliae (Metsch.)Sorok. var. anisopliae 582 M (Bikokken FERM-P Nr. 4217, ATCC Nr. 20500) geimpft, und die Kultur wird bei 30 C während 14-20 Tagen geschüttelt.

(b) Das Verfahren nach Beispiel 1 a) wird wiederholt, außer daß anstelle von 1.0 % Polypepton 0.1 % Amircsäure (Glycin, Asparagin, Arginin, Histidin, Alanin und andere

Aminosäuren zugegeben werden.

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Beispiel 2

5 1 Filtrat der in Beispiel 1 gewonnenen Brühe werden unter Beigabe von Hiflo-Supercel filtriert.

Nach Einstellung des pH-Wertes auf 6.0 - 7.0 wird das gewonnene Filtrat durch eine Säule eines Ionenaustauscherharzes IRC-50 (H , Na , gemischter Typ) mit einem Innendurchmesser von 20 mm und einer Höhe von 500 mm durchgeleitet, um die erfindungsgemäßen Substanzen darin zu adsorbieren. Die Säule wird mit Wasser gewaschen, dann werden 500 ml 1.0 N HCl mit einer Flußgeschwindigkeit von 10 ml/Min. durchgeleitet, um die erfindungsgemäßen Substanzen zu eluieren. Das Eluat wird auf einen pH-Wert von 6.0 eingestellt und dann unter reduziertem Druck konzentriert. Das Konzentrat bleibt bei 35 C unter Beigabe von Natriumpentachlorphenol über Nacht stehen, damit eine Präzipitation von Pentachlorphenolat einer K 582 M-A und -B-Mischung entsteht. Das gewonnene Pentachlorphenolat einer K 582 M-A und B-Mischung wird mit Wasser gewaschen, dann in Butylacetat gelöst, und die gewonnene Lösung wird zweimal mit verdünnter Salzsäurelösung mit einem pH-Wert von 2.0 bis 3.0 extrahiert, um eine wässrige Lösung der K 582 M - A und B-Mischung (HCl-SaTz) zu erhalten. Die wässrige Lösung wird mehrere Male mit Butylacetat gewaschen, und die wässrige Schicht wird auf pH 4.O eingestellt und dann unter reduziertem Druck konzentriert. Dem Rest wird eine ausreichende Menge Äthanol beigegeben, damit eine K 582 M-A und B-Mischung ausgefällt wird. So werden 5.0 g rohen Pulvers einer K 582 M-A und B-Mischung (HCl-SaIz) erhalten.

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Das gewonnene Pulver wird erneut in Methanol gelöst und durch Zugabe einer ausreichenden Menge Aceton und Äthanol zu der Methanollösung wird eine K 582 M-A und B-Mischung (HCl-SaIz) ausgefällt, die durch Filtrieren gesammelt wird. Die so gewonnene K 582 M-A und B-Mischung (HCl-SaIz) wird in Methanol gelöst und durch Verwendung einer Säule Cephadex LH-2O gereinigt, damit sich 4.0 g einer K 582 M-A und B-Mischung (HCl-SaIz) als weißes Pulver ergeben.

Beispiel 3

1 g einer K 582 M-A und B-Mischung (HCl-SaIz), die durch das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren gewonnen wurde, wird in 5 ml Wasser gelöst, und die wässrige Lösung wird unter Verwendung einer Säule (Innendurchmesser 26 mm, Höhe 1200 mm) Biogel P-2 (0,15-0,075mm Maschenweite ;100-2OOmesh) chromatographiert.D.h., unter Verwendung von 0,1M wässriger NaCl-Lösung wird sie in einer Geschwindigkeit von 30 ml/h eluiert, und zuerst wird die K 582 M-A (HCl- Salz)-Fraktion, dann die K 582 M - B(HCl-SaIz)-Fraktion gewonnen. Die so gewonnenen Eluate A und B werden jeweils erneut chromatographiert und unter reduziertem Druck konzentriert. Zur Präzipitation wird eine Mischung aus Aceton und Äthanol (4 : 1) zu dem gewonnenen Rest gegeben, und nach Trocknen werden die Präzipitate wiederholt mit Methanol extrahiert. Die Methanollösung wird unter reduziertem Druck konzentriert, und der Rest wird durch Beigabe einer Mischung aus Aceton und Äthanol (4:1) ausgefällt und getrocknet, so daß K 582 ΜΑ (HCl-SaIz) -Pulver oder K 582 M-B (HCl-SaIz)-Pulver entsteht. Nachdem das gewonnenen A- und B-Pulver jeweils in einer geringen Menge 80%igen Methanols gelöst wurde und

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die Methanollösung durch Entsalzung mittels Chromatographie unter Verwendung einer Cephadex LH-20-Säule (Innendurchmesser 26 mm, Höhe 1200 mm) gereinigt wurde, wurde das gewonnene Eluat unter reduziertem Druck konzentriert und der Rest mit einer Mischung aus Aceton und Äthanol (4:1) ausgefällt. Die Präzipitate wurden getrocknet, und so wurden jeweils O.41 g K 582 M-A (HCL-SaIz) (Ausbeute 41.0 %) und 0,35 g K 582 M-B (HCl-SaIz) (Ausbeute 35.0 %) gewonnen.

Beispiel 4

1gK 582 M-A und B-Mischung (HCl-SaIz), die durch das Verfahren nach Beispiel 2 gewonnen wurde, wird in 5 ml Wasser gelöst, und die wässrige Lösung wird unter Verwendung einer CM-Cephadex C-25-Säule (Innendurchmesser 20 mm, Höhe 500 mm; (0,1 5-0,075mm Maschenw.)chromatographiert. Die Chromatographie wird zunächst mit 0,1M Phosphorsäurepuffer (pH 6), dann mit 0,4 M NaCl-Lösung und dann mit 0,9 M NaCl-Lösung als Elutions-Lösungsmittel durchgeführt. Nachdem die Elution auf 0,9 M NaCl-Lösung gewechselt wurde,wird zunächst K 582 M-A (HCl-SaIz) und dann K 582 M-B (HCl-SaIz) eluiert. Die Eluate von K 582 M-A (HCl-SaIz) und K 582 M-B (HCl-SaIz) werden jeweils konzentriert, getrocknet, wiederholt extrahiert, und dann wird der methanollösliche Teil konzentriert und der Rest durch Zugabe einer Mischung von Aceton und Äthanol (4:1) ausgefällt, damit K 582 M-A (HCl-SaIz) und K 582 M B (HCl-SaIz) jeweils in Pulverform erhalten wird. Das so gewonnene A- und B-Pulver wird jeweils in einer geringen Menge 80 %igen wässrigen Methanols gelöst, und die Methanollösung wird durch Entsalzung mittels Chromatographie unter

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Verwendung einer Cephadex LH-20-Säule gereinigt. Nach Konzentrieren tinter reduziertem Druck wird das Eluat durch Beigabe einer Mischung von Aceton und Äthanol (4:1) ausgefällt, und die Präzipitate werden getrocknet, wobei 0,40 g gereinigtes K 582 M-A (HCl-SaIz) (Ausbeute 40-0 %) und 0,43 g gereinigtes K 582 M-B (HCl-SaIz) (Ausbeute 43.0 %) erhalten werden.

Beispiel 5

5 1 eines durch das Verfahren nach Beispiel 1 gewonnenen Kulturmediums werden unter Beigabe von 100 g Hiflo-Supercel filtriert. Das gewonnene Filtrat wird auf einen ph-Wert von 5.,0 - 6.0 eingestellt, auf ein Volumen von 1/10 - 1/20 konzentriert, die darin enthaltenen anorganischen Salze entfernt, erneut zur Trockne konzentriert und mehrere Male mit 200 ml Methanol extrahiert. Der kombinierte Extrakt wird konzentriert, wiederholt unter aufeinanderfolgender Reduzierung der Methanolmenge extrahiert und die Extrakte Werden in einer geringen Menge Wasser vollständig gelöst; die gewonnene wässrige Lösung wird mit einer Säule (Innendurchmesser 50 mm, Höhe 1000 mm) vom Typ Biogel P-20 (0,15-0,075m; Maschenweite) chromatographiert. Das heißt, sie wird mit 0,1 M NaCl-Lösung (Plußgeschwindigkeit 30 ml/h) eluiert, um zunächst die K 582 M-A (HCl-SaIz) - Fraktion und dann die K 582 M-B (HCl-SaIz)-Fraktion zu erhalten. Die Eluate dieser Fraktionen werden jeweils durch Entsalzen entsprechend dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gereinigt (Methaholextraktioh, Beigabe einer Mischung von Aceton und Äthanol, Behandlung mit Cephadex LH-20-Säule) ,wobei jeweils 1,4g getrocknetes K 582 M-A (HCl-SaIz) bzw. 1,2 g getrocknetes K 582 M-B (HCl-SaIz) erhalten werden.

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Beispiel 6

5 1 des entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 1 gewonnenen Kulturmediums werden unter Beigabe von Hiflo-Supercel filtriert. Nach Konzentration unter reduziertem Druck Wird das Filtrat aus der abgetrennten Substanz filtriert, auf einen pH-Wert von 5.0 - 7.0 eingestellt und dann durch eine CM-Cephadex C-25-Säule (0,15-0,075mm Maschenw.) (Innendurchmesser 20 mm, Höhe 1000 mm) geleitet, um darin die erfindungsgemäße Substanz zu adsorbieren. Dann wird die Säule zunächst mit 0.1 M Phosphorsäurepufferlösung mit einem pH-Wert, von 6,0, dann mit 0,4 M NaCl-Lösung und dann mit 0,9 M NaCl-Lösung eluiert. Nachdem die Elutionslösung auf eine 0,9 M NaCl-Lösung geändert wurde, wird zunächst K 582 M-A (HCl-SaIz) und dann K 582 M-B (HCl-SaIz) eluiert. Diese fraktionierten Eluate die jeweils K 582 M - A (HCl-SaIz) und K 582 M - B (HCl-SaIz) enthalten, werden konzentriert, getrocknet, durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren entsalzt (Methanolextraktion), es wird ihnen eine Mischung aus Aceton und Äthanol beigegeben, sie werden mit einer Cephadex-LH-20-Säule behandelt und getrocknet; so werden 1,2 g getrocknetes K 582 M - A (HCl-SaIz) und 1,3 g getrocknetes K 582 M-B (HCl-SaIz) gewonnen.

Beispiel 7

2 g K 582 M-A (Hydrochlorid), das nach dem Verfahren entsprechend Beispiel 3 oder 4 gewonnen wurde, werden in 5 ml destilliertem Wasser gelöst und in eine IRC-50-Säule (4 χ 25 cm) eingebracht. Nachdem die Säule mit 400 ml de-

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stilliertem Wasser gewaschen wurde, wird K 582 M - Λ (Sulfat) mit 1 NH „SO₄ eluiert. Dem K 582 M-A (Sulfat) enthaltenden Eluat wird lRA-400 beigegeben. Nachdem die Mischung auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt wurde, wird sie filtriert und dann konzentriert. Dem Konzentrat wird eine Acetonmischung beigegeben: Äthylalkohol(4:1)und die abgetrennten Präzipitate werden abfiltriert.Das gewonnene K 582 M-A (Sulfat) wird unter Verwendung einer Cephadex LH-20-Säule ( 2.2 χ 80 cm) entsalzt und gereinigt. Zum Eluieren wird destilliertes Wasser verwendet. Durch Gefriertrocknen des entstehenden Eluats werden 1,4 g K 582 M-A (Sulfat) gewonnen. Sein IR-Spektrum ist in Fig. 7 dargestellt. Durch eine Behandlung entsprechend zu dem oben genannten Verfahren kann ähnliches K 582 M-A (Sulfat) gewonnen werden.

Beispiel 8. Aminosäuresequenz von K 582 M - A

Nach einer Studie bezüglich der Aminosäureanalyse im Hinblick auf K 582 M-A wurde nun herausgefunden, daß K 582 M-A aus Arginin 1, Q -Hydroxyarginin 1, Ornithin 2, Threonin 1, Lysin 1 und Tyrosin 1 besteht und die C-endständige Aminosäure Tyrosin ist (Hydrazin-Zersetzungsverfahren).

Unter Verwendung des Edman Eliminierungsverfahrens wird die Aminosäurefolge von K 582 M - A nacheinander aus dem N-endstär digen Ende analysiert. Das heißt, 3 mg K 582 M-A werden in 0,5 ml Wasser und 1,0 ml Pyridin gelöst, und der pH-Wert wird durch die Zugabe von 1 N NaOH auf 9.0 - 9.5 eingestellt. Nachdem 100 ul Phenylisothiocyanat beigegeben wurde und der Kolben mit Stickstoffgas gespült wurde, wird der Kolbeninhalt während 90 Minuten auf 40 C gehalten. Nach-

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dem er mit Benzol gewaschen wurde, wird er gefriergetrocknet, und der Kolben wird mit Stickstoffgas gespült mit 200 ul Trifluoressigsaure gefüllt und während 15 Minuten auf 40 C gehalten. Nach Entfernung der Trifluoressigsaure wird ein Teil des Restes herausgenommen und durch die Einwirkung von 6 N HCl während 22 Stunden bei 110° C hydrolysiert, um die Aminosäure zu analysieren. Als Ergebnis wird bestätigt, daß ein Arginin von K 582 M-A abgespalten wird, d.h., daß die N-endständige Aminosäure Arginin ist.

Unter Anwendung des vorstehend erwähnten Edman Eliminierungs-Verfahrens wird die Aminosäuresequenz in K 582 M - A von der N-endständigen Aminosäure zu der dritten Aminosäure nacheinander analysiert, und sie erweist sich als Arginin- -Hydroxyarginin-Ornithin.

Nach Erhitzen bei 55° C während 24 Stunden in Trifluoressigsaure und anschließender Entfernung der Trifluoressig-Bäure werden 50 mg K 582 M - A einer Filterpapier-Elektrophorese unter hohem Druck unterworfen. Zusätzlich zu K 582 M A werden zwei Ninhydrid-positive Substanzen erkannt, und eine davon ist bei Sakaguchi-Reaktion positiv. Wenn das Produkt nach Zersetzung mit Trifluoressigsaure bei 1 ml/Fraktion mit einer Sephadex LH-20-Säule (Säulengröße: 18 χ 840 mm; Lösungsmittel: 80 %-iges Methanol)einer Gelfiltration unterworfen wird,werden K 582M - A und eine Ninhydrin-positive und Sakaguchireaktion-positive Substanz als Mischung in den Fraktionen Nr. 136-154 eluiert.

In den Fraktionen Nr. 156-164 wird auch eine Ninhydrinpositive und Sakaguchireaktion-positive Substanz als einzelne Substanz eluiert. Nach der Analyse dieser in den Fraktionen Nr. 156-164 eluierten Substanz stellte sich heraus, daß sie

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aus Arginin 1 und $ -Hydroxyarginin 1 besteht. Nach Konzentrierung werden die Fraktionen Nr. 136-154 an einer CM-Zellulosesäule adsorbiert, die mit 0,01 M Ammoniumacetat ins Gleichtgewicht gebracht wurde (Säulengröße: 17 χ 160 mm), und dann unter Verwendung von 2 M wässriger NaCl-Lösung bei 1,5 ml/Fraktion einer Gradienten- Elution unterworfen, um eine Ninhydrin-positive und Sakaguchireaktbn-negative Substanz in den Fraktionen Nr. 220-233 zu eluieren. In den Fraktionen Nr. 302-328 wird auch K 582 M-A eluiert. Die Fraktionen Nr. 220-230 werden mit Sephadex LH-20 (80 %iges Methanol) entsalzt, und nach der Aminosäureanalyse wird eine Aminosäurezusammensetzung von Ornithin 2, Threonin 1, Lysin 1 und Tyrosin 1 gewonnen. Außerdem wurde durch das Hydrazin-Zersetzungsverfahren herausgefunden, daß die C-endständige Aminosäure Tyrosin ist.

Die Fraktionen Nr. 220-230 werden zur aufeinanderfolgenden Analyse der Aminosäuresequenz vom N-endständigen Ende verwendet,d.h. 2 mg der Fraktionen Nr. 220-233 werden in 0,2 ml Wasser und 0,3 ml Pyridin gelöst und auf einen pH-Wert von 9.0 9,5 eingestellt. 100 ul Phenylisothiocyanat werden beigegeben, und der Kolbeninhalt wird mit Stickstoff gas gespült. und während 90 Minuten auf 40°C gehalten. Nach dem Waschen mit Benzol wird er gefriergetrocknet, und der Kolben wird mit Stickstoffgas gespült, mit 200 ul Trifluoressigsäure gefüllt und während 15 Minuten auf 40⁰C gehalten. Nach Entfernen der Trifluoressigsäure wird ein Teil des Restes herausgenommen und durch die Wirkung von 6 N HCl während 22 Stunden bei 110°C hydrolysiert, um die Aminosäure zu analysieren. Es bestätigt sich, daß Ornithin von den Fraktionen Nr. 220-233 abgespalten wird, d.h. daß die N-endständige Aminosäure der Fraktionen Nr. 220-233 Ornithin ist.

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Durch Anwendung des vorstehend genannten Edman Eliminierungsverfahrens wird die Aminosäurefolge der Fraktionen Nr. 220-233 in Folge, ausgehend vom N-endständigen Ende analysiert und es stellte sich heraus, daß sie Ornithin-Threonin-Ornithin-Lysin-Tyrosin lautet.

Aus den vorstehend genannten Ergebnissen ergibt sich, daß die Aminosäurefolge von K 582 M - A Arginin- $-Hydroxyarginin-Ornithin-Threonin-Ornithin-Lysin-Tyrosin ist.

Beispiel 9. Aminosäuresequenz von K 582 M-B

Eine Aminosäureanalyse von K 582 M-B zeigt, daß ihre Aminosäurebestandteile Arginin1,^-Hydroxyarginin 2, Ornithin 2, Threonin 1 und Tyrosin 1 sind, und die Hydrazinzersetzung zeigt, daß die C-endständige Aminosäure Tyrosin ist.

Die N-endständige Aminosäure von K 582 M-B wird unter Anwendung des Edman Eliminierungsverfahrens bestimmt. Das heißt, 1 mg K 582 M-B wird in 0,2 ml Wasser und 0,3 ml Pyridin gelöst und durch Beigabe von 1 N NaOh auf einen pH-Wert von 9,0 - 9,5 eingestellt. Dann werden 100 μΐ Phenylisothiocyanat beigegeben, und der Kolbeninhalt wird mit Stickstoffgas gespült und während 90 Minuten auf 40°C gehalten. Nach Waschen mit Benzol wird er gefriergetrocknet, und der Kolben wird mit Stickstoffgas gespült, mit 200 μΐ

Trifluoressigsäure gefüllt und während 15 Minuten auf 40 C gehalten. Nach Entfernen der Trifluoressigsäure wird ein Teil des Restes herausgenommen und durch die Wirkung von 6 N HCl während 22 Stunden bei 11O⁰C hydrolysiert, um die Aminosäure zu analysieren. Es bestätigt sich, daß ein Arginin von K 582 M-B abgespalten wird, d.h. daß die N-

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endständige Aminosäure Arginin ist.

100 mg K 582 M-B werden während 9 Stunden bei 40°C in Trilfluoressigsaure erhitzt. Nach Entfernen der Trifluoressigsäure werden sie unter Verwendung einer Sephadex LH-20 Säule (Säulengröße: 18 χ 970 mm; Lösungsmittel: Wasser) einer GeIfiltrierung unterworfen; in dieser Säule werden, nachdem 105 ml des ursprünglichen Eluats abgetrennt wurden, die Fraktionen möt einer Unterteilung von 1,15 ml/Fraktion gesammelt. Es werden dadurch eine Mischung in den Fraktionen Nr. 40-83 und ein aus Arginin 1 und Hydroxyarginin 1 als Aminosäurebestandteile bestehendes Dipeptid in den Fraktionen Nr. 84-92 sowie Tyrosin in den Fraktionen Nr. 114-134 eluiert. Nach Konzentrierung werden die Fraktionen Nr. 40-83 an einer CM-Cellulose-Säule (Säulengröße: 15 χ 600 mm) adsorbiert, die mit 0,01 M Ammoniumacetat ins Gleichgewicht gebracht wurde, und dann unter Gradienten- Elution bei 1,0 ml/Fraktion unter Verwendung von 1 M NaCl behandelt. In den Fraktionen Nr. 191-204 wird ein Tetrapeptid eluiert, von dem durch Aminosäureanalyse herausgefunden wurde, daß es aus Ornithin 2, Threonin 1 und Hydroxyarginin 1 besteht.

Unter Anwendung des Edman Eliminierungsverfahrens wurden die Fraktionen Nr. 191-204 unter denselben Bedingungen wie bei K 582 M-A analysiert, um nacheinander die Aminosäuresequenz zu bestimmen.Eswurde bestimmt, daß die Fraktionen Nr. 191-204 ein Tetrapeptid mit der Aminosäuresequenz Ornithin-Threonin-Ornithin- Jf -Hydroxyarginin sind.

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Aus den vorstehend genannten Ergebnissen wird die Aminosäuresequenz von K 582 M-B letztlich als Arginin-^-Hydroxyarginin-Ornithin-Threonin-Ornithin- ^-Hydroxyarginin-Tyrosin bestimmt.

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Claims

Ansprüche

V 1. feeradkettiges Peptid-Antibiotikum K 582 M aus Arginin 1, ^"^Threonin 1, Tyrosin 1, Ornithin 2, Hydroxyarginin m, Lysin η als Aminosäurebestandteile.
2. K 582 M-A nach Anspruch 1, bei dem m von Hydroxyarginin 1 und η von Lysin 1 sind.
3. K 582 M-B nach Anspruch 1, bei dem m von Hydroxyarginin 2 und η von Lysin 0 sind.
4. Verfahren zur Herstellung von K 582 M (ein Antibiotikum vom geradkettigen Peptid-Typ mit Arginin 1,Threonin 1, Tyrosin 1, Ornithin 2, Hydroxyarginin m, Lysin n, als Aminosäurebestandteile) unter Verwendung von K 582 M - produzierenden Mikroorganismen, die zur Gattung Metarhizium gehören.

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Postscheckkonto Stuttgart CBLZ 6OO10O7O3 429 3Ο-7ΟΘ ■ Dresdner Bank Stuttgart CBLZ 6OOSOOOO) Konto 9011341

ORIGINAL INSPECTED

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5. Verfahren nach Anspruch 4, zur Herstellung von K 582 M-A, bei dem m von Hydroxyarginin 1 und η von Lysin 1 sind.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, zur Herstellung von

K 582 M-B, bei dem m von Hydroxyarginin 2 und η von Lysin O sind.
7. Arzneimittel, enthaltend K 582 M, in einem für die insbesondere parenterale Verabreichung geeigneten Träger.

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