DE3686960T2

DE3686960T2 - Verfahren zur herstellung von pyrrolochinolinchinon.

Info

Publication number: DE3686960T2
Application number: DE19863686960
Authority: DE
Inventors: Teizi Urakami
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1985-04-24
Filing date: 1986-04-24
Publication date: 1993-03-04
Anticipated expiration: 2006-04-25
Also published as: EP0206471B1; EP0206471A2; DE3686960D1; EP0206471A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pyrrolochinolinchinon, insbesondere ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung desselben unter Verwendung von Bakterien.
Pyrrolochinolinchinon (im folgenden als "PQQ" abgekürzt) ist 2,7,9,-Tricarboxy-1H-pyrrolo[2,3-f]chinolin-4,5-dion der Formel
PQQ wird als Coenzym von Methanol-Dehydrogenase erzeugt durch Methanol-verwendende Bakterien (S.A. Salisbury et al., Nature, Bd. 280, SS. 843-844, 1979), gereinigt und kristallisiert. In den vergangenen Jahren wurde PQQ ebenfalls in solchen Eucaryoten wie Fungi und Hefen und Säugetieren, wie auch in Bakterien, nachgewiesen. Es wird angenommen, daß PQQ eine wichtige Rolle auf medizinischem Gebiet spielt, da es ein Coenzym ist, welches enzymatische Reaktionen oder den Metabolismus erleichtert.
Eines der Verfahren zur Herstellung von PQQ ist eine organische chemische Synthese (JACS. Bd. 103, 55. 5599-5600, 1981). Jedoch ist die organische chemische Synthese nicht wirtschaftlich, da die Synthese so viele Stufen erfordert, daß es eine sehr lange Zeit dauert, bis sie vollständig ist, und sie erfordert mühevolle Stufen für die Entfernung der Isomeren und verschiedener anderer Nebenprodukte. Außerdem ist die Ausbeute an PQQ nicht so hoch. Ein anderes Verfahren ist ein mikrobiologisches (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung 59-113896). Dieses Verfahren ist jedoch auch nicht wirtschaftlich, da die Ausbeute höchstens 0,1-0,3· 10&supmin;&sup8; mol/l ist (im folgenden als "M" bezeichnet), das heißt 4 -12 ug pro Liter.
Der Erfinder hat Untersuchungen durchgeführt, um PQQ unter Verwendung von Bakerien herzustellen. Der Erfinder hat gefunden, daß die im folgenden aufgeführten Bakterien eine große Menge an PQQ bilden können: die Arten Achromobacter, Methylobacillus, Methylomonas, Methanomonas, Protaminobacter, Methylobacterium, Protomonas, Mycoplana, Ancylobacter, Microcyclus, Hyphomicrobium, Xanthobacter, Thiobacillus, Alteromonas oder Methylophaga, und eine besondere Species, die zum Genus Pseudomonas gehört.
Die Erfindung betrifft gemäß einer ersten Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von PQQ, gemäß dem ein im folgenden definiertes Bakterium in einem Medium gezüchtet wird, das als Kohlenstoffquelle eine Methanolquelle und/oder eine Methylaminquelle enthält und gemäß dem PQQ aus der Kulturbrühe oder dem Überstand der Kulturbrühe gewonnen wird, wobei das Bakterium die Fähigkeit besitzt, Methanol und/oder Methylamin unter Bildung von PQQ auszunutzen und ausgewählt wird unter den Genus Achromobacter, Methylobacillus, Methylomonas, Methanomonas, Protaminobacter, Methylobacterium, Protomonas, Mycoplana, Ancylobacter, Microcyclus, Hyphomicrobium, Xanthobacter, Thiobacillus, Alteromonas, Methylophaga oder einer bestimmten Spezies, die zum Genus Pseudomonas gehört.
Die EP-A-0 164 943 betrifft ebenfalls die Herstellung von PQQ durch Züchtung von Bakterien. Jedoch finden sich in dieser Druckschrift keine Hinweise auf die Bakterien, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ausgenommen einigen des Genus Protaminobacter. Ameyama et al ((1984) Agric. Biol.
Chem. 48 (2) 561-565) beschreiben PQQ, das durch Züchtung von Pseudomonas M5 und Pseudomonas AMI erhalten wird. Die Verwendung anderer Bakterien wird bei diesem Verfahren nicht beschrieben.
Es kann irgendein Bakterium verwendet werden, solange es die Fähigkeit besitzt, Methanol und/oder Methylamin unter Bildung einer großen Menge von PQQ auszunutzen und das zum Genus Achromobacter, Methylobacillus, Methylomonas, Methanomonas, Protaminobacter, Methylobacterium, Protomonas, Mycoplana, Ancylobacter, Microcyclus, Hyphomicrobium, Xanthobacter, Thiobacillus, Alteromonas, oder Methylophaga, oder einer bestimmten Spezies des Genus Pseudomonas gehört.
Gemäß einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Pyrrolochinolinchinon, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Bakterium, wie es im folgenden definiert wird, in einem Medium, das als Kohlenstoffquelle eine Quelle für Methylamin enthält, gezüchtet wird, und das so gebildete Pyrrolochinolinchinon aus der Kulturbrühe oder dem Überstand der Kulturbrühe gewonnen wird, wobei das Bakterium die Fähigkeit besitzt, Methylamin auszunutzen und Pyrrolochinolinchinon zu bilden und zu der Spezies Pseudomonas aminovorans gehört.
Beispiele geeigneter Bakterien, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind Achromobacter methanophila ATCC 21275 (= JCM 2841, ditto ATCC 21452, ditto ATCC 21961 (= JCM 2843), Methylobaciilus giycogenes ATCC 29475 (= JCM 2850 = NCIB 11375), Methylomonas methanolica NRRL 8-5458 (= JCM 2851), Methylomonas thalassica ATCC 33146, Methylomonas clara ATCC 31226 (= NCIB 11809), Methanomonas methylovora ATCC 21852 (= JCM 2840 = NCIB 11376), ditto ATCC 21369 (= JCM 2844), ditto ATCC 21958 (= JCM 2847), ditto ATCC 21963 (= JCM 2848), Methanomonas methylovora subsp. thianimophila ATCC 21370 (= JCM 2849), Protaminobactor candidus ATCC 21372 (= JCM 2852), ditto ATCC 21959, Protaminobacter thiaminophagus ATCC 21371 (= JCM 2853), ditto ATCC 21926, ditto ATCC 21927, ditto ATCC 21957, ditto ATCC 21969 Pseudomonas aminovorang NCIB 9039, Methylobacterium organophilum ATCC 29983 (= NCIB 11278), Protomonas extorquens JCM 2802 (= DSM 1337 = NCIB 9399), ditto JCM 2805 (= NCIB 9133 = ATCC 14718 = DSM 1338), ditto JCM 2806 (= DSM 1339 = NCIB 9686), ditto JCM 2811 (= ATCC 14821), ditto JCM 2812 (= NCIB 10598), ditto JCM 2813 (= NCIB 10599), ditto JCM 2814 (= NCIB 10600), ditto JCM 2815 (= NCIB 10602), ditto JCM 2816 (= NCIB 10611), ditto JCM 2817 (=NCIB 10601), ditto JCM 2818 (= NCIB 10603), ditto JCM 2819 (= NCIB 10606), ditto JCM 2820 (: NCIB 10607), ditto JCM 2821 (= NCIB 10608), ditto JCM 2822 (a NCIB 10609), ditto JCM 2823 (= NCIB 10610), ditto JCM 2824 (= NCIB 10612), ditto JCM 2825 (= NCIB 10604), ditto JCM 2826 (= NCIB 10605), ditto JCM 2827 (= ATCC 21438), ditto JCM 2829 (= ATCC 29983 = ICPB 4095), ditto JCM 2830 (= ATCC 27329 = IAM 12099), ditto JCM 2831 (= IAM 12098), ditto JCM 2832 (die Namen von Protomonas extorquens basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 34, PP. 188-201, (1984)), Mycoplana rubra-NCIB 10409 (= JCM 2803), Ancylobacter aquaticus ATCC 25396 (= CCM 1786 = DSM 101 = NCIB 9721), ditto DSM 334, ditto ATCC- 27068, ditto ATCC 27069 (die Namen von Ancylobacter aquaticus basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 33, pp. 397-398, (1983)), Microcyclus eburneus ATCC 21373 (= DSM 1106), Mycrocyclus polymorphum NCIB 10516 (= DSM 2457), Microcyclus methanolica DSM 2666, ditto DSM 2667, ditto DSM 2668, ditto DSM 2669, Hyphomicrobium variable NCIB 10517, Hyphomicrobium vulgare NCIB 9698, ditto NCIB 9775, Hyphomicrobium methylovorum IFO 14180, Hyphomicrobium sp. DSM 1869, Xanthobacter autotrophicus DSM 432, ditto DSM 431, ditto DSM 597, ditto DSM 685, ditto DSM 1393, ditto DSM 1618, ditto DSM 2009, Xanthobacter flavus NCIB 10071 (= DSM 338), Thiobacillus novellus ATCC 8093 (= CCM 1077 = DSM 506 = IFO 12443 = NCIB 9113), ditto NCIB 10456, Thiobacillus versutus ATCC 25364 (die Namen von Thiobacillus versutus basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 33, PP. 211-217, (1983)), Alteromonas thalassomethanolica ATCC 33145, Methylophaga marina NCMB 2244 (= ATCC 35842), Methylophaga thalassica NCMB 2162, und Methylophaga thalassica NCMB 2163.
Varianten, die aus den obigen Stämmen erhalten werden, können ebenfalls verwendet werden. Das verwendete Medium muß -all Kohlenstoffquelle eine Quelle für Methanol und/oder eine Quelle für Methylamin (CH&sub3;NH&sub2;) enthalten. Methyiaminhydrochlorid kann als Quelle für Methylamin verwendet werden. Die Konzentrationen an Methanol und/oder Methylamin im Medium variieren abhängig von den verwendeten Bakterien. Sie betragen im allgemeinen 3 Gew.-% oder weniger, bevorzugt 1,5 Gew.-% oder weniger für Methanol und 1 Gew.-% oder weniger, bevorzugt 0,5 Gew.-% oder weniger für Methylamin, auf der Basis des Mediums vom praktischen Standpunkt aus. Das Medium wird im allgemeinen weiter geeignete Mengen an üblichen Stickstoffquellen und anorganischen und/oder organischen Salzen enthalten. Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, Pepton, Fleischextrakt, usw. können als Stickstoffquelle verwendet werden. Phosphate, Magnesiumsalze, Eisensalze und gegebenenfalls eine geringe Menge von anderen Metallsalzen werden als anorganische und/oder organische Salze verwendet. Weiterhin können eine Aminosäure, eine Nukleinsäure, Vitamin, Hefeextrakt, Malzextrakt und andere wachstumsaktivierende Materialien zugegeben werden. Wenn die Bakterien im wesentlichen ein Nährmedium verlangen, muß das Medium die notwendigen Materialien für diese Wirkung enthalten. 2 bis 4 Gew.-% NaCl werden zu dem Medium zugegeben, wenn das verwendete Bakterium Methylomonas thalassica ATCC 33146 oder Alteromonas thalassomethanolica ATCC 33145 ist, da diese Bakterien NaCl für ihr Wachstum benötigen. Statt dessen kann Meerwasser anstelle von NaCl und Wasser für die Herstellung des Mediums verwendet werden. Die Anwesenheit von Na&spplus; und/oder Mg&spplus;&spplus; ist wesentlich im Medium für den Genus Methylophaga, da alle diese Stämme davon, die oben erwähnt wurden, Nah und Mg&spplus;&spplus; für ihr Wachstum erfordern. Eine bevorzugte Quelle für Na&spplus; ist Meerwasser, da die Stämme, die zu Methylophaga gehören, marine Bakterien sind. Statt dessen kann NaCl zu dem Medium zugegeben werden bis die Nacl-Konzentration 2- 4% beträgt.
Die Züchtungsbedingungen variieren abhängig von den verwendeten Bakterien. Vom praktischen Standpunkt aus, ist es-im-allgemeinen erforderlich, eine Züchtungstemperatur und einen pH der Kulturflüssigkeit innerhalb des üblichen Bereiches von 25ºC bis 45ºC bzw. von 6 bis 8 zu wählen, wobei das Wachstum und die Vermehrung der verwendeten Bakterien beachtet wird. Wenn die Stickstoffquelle ein Ammoniumsalz ist, wird insbesondere der pH des Mediums saurer, wenn sich die Bakterien vermehren. Eine Kontrolle des pHs der Kulturflüssigkeit erfolgt manchmal durch Zugabe alkalischer Materialien, beispielsweise Ammoniak, kaustischer Pottasche (Kaliumhydroxid) oder kaustischem Soda (Natriumhydroxid), damit er während der Züchtung bei konstantem Wert gehalten wird. Ammoniak ist bevorzugt. Die Züchtung, beziehungsweise das Wachstum kann diskontinuierlich oder kontinuierlich erfolgen.
PQQ, das nach dem Züchten gebildet wird, kann durch viele Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, gewonnen werden. Beispielsweise kann eine Feststoff-Flüssigkeits-Trennung, beispielsweise eine Filtration und ein Zentrifugieren mit der Kulturflüssigkeit durchgeführt werden, um einen Überstand durch Abtrennung der Zellen von der Kulturflüssigkeit zu erhalten. Der Überstand und die Kulturflüssigkeit, die die Zellen enthält, wie sie beispielsweise vor der Filtration ist, können für die Gewinnung verwendet werden. Die Gewinnung aus dem Überstand oder der Kulturflüssigkeit erfolgt beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration des Konzentrats, Lösungsmittelextraktion des getrockneten Produkts oder durch Affinitätschromatographie.
Die Identifizierung von PQQ, das so gewonnen wurde, kann beispielsweise durch Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Elementaranalyse, kernmagnetische Resonanzspektrometrie, UV-Absorptionspektroskopie und/oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erfolgen.
Die quantitative Analyse kann unter Verwendung der D-Glukose- Dehydrogenase Aktivitätsdeletion Varianten von Pseudomonas aeruginosa (Ameyama et al., FEBS Letters, Bd. 130, SS. 179- 183, 1981) und E. coli (Ameyama et al., Agric. Biol. Chem., 49, 55. 1227-1231, 1985), durch UV-Absorptionsspektra (Dekker et al., European Journal of Biochemistry Bd. 125, 55. 69-73 (1982)), oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erfolgen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine wässrige Lösung (200 ml, pH 7,1), die hergestellt wurde durch Auflösen von 3 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1,4 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,1 g Na&sub2;HPO&sub4;, 0,2 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 30 mg CaCl&sub2;·2H&sub2;O, 30 mg FeC&sub6;H&sub5;O&sub7;·XH&sub2;O, 5 mg MnCl&sub2;·4H&sub2;O, 5 mg ZnSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,5 mg CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 4 mg Thiaminhydrochlorid, 4 mg Kalziumpantothenat, 20 ug Biotin und 8 ml Methanol in 1 Liter Wasser, wird in Erlenmeyerkolben (1 l jeweils) gegossen und bei 120ºC während 20 Minuten sterilisiert. Diese werden als Hauptkulturmedien bezeichnet (hierin wird als Hauptmedium auf diese Bezug genommen).
Die Vorkultivierung erfolgt getrennt durch jeweiliges Züchten der im folgenden angegebenen Bakterien in dem gleichen Hauptmedium wie oben bei 30ºC während 24 Stunden. Die vorgezüchteten Flüssigkeiten werden in einer Menge von 1 Volumenprozent zum Inokulieren des Hauptmediums verwendet. Die so inokulierten Flüssigkeiten werden der Züchtung in einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 30ºC unterworfen. Die Methanolkonzentrationen in allen Kulturflüssigkeiten erniedrigten sich auf nicht mehr als 0,0001 Volumenprozent nach 2 Tagen Züchtung. Die tiberstände werden durch Zentrifugieren der Kulturflüssigkeiten erhalten. Die Mengen an PQQ in den Überständen sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Stämme Menge an PQQ (ug/l im Überstand)
Achromobacter methanophila ATCC 21275 73
Methylobacillus glycogenes ATCC 29475 115
Methylomonas clara ATCC 31226 160
Protaminobacter candidus ATCC 21372 70
Protaminobacter thiaminophagus ATCC 21371 80
Pseudomonas methanolica ATCC 21704 140
Pseudomonas methylotropha NCIB 10510 360
Methylobacterium organophilum ATCC 29983 500
Protomonas extorquens JCM 2802 750
Mycoplana rubra NCIB 10409 600
Ancylobacter aquaticus ATCC 25396 1000
Microcyclus eburneus ATCC 21373 800
Microcyclus polvmorphum NCIB 10516 500
Microcyclus methanolica DSM 2666 600
Hyphomicrobium variable NCIB 10517 310
Hyphomicrobium vulgare NCIB 9698 350
Hyphomicrobium methylovorum IFO 14180 400
Hyphomicrobium sp. DSM 1869 7000
Xanthobacter autotrophicus DSM 432 1200
Xanthobacter flavus NCIB 10071 1000
Thiobacillus novellus NCIB 10456 2200
Methanomonas methylovora ATCC 21852 400
Methanomonas methylovora subsp. thiaminophila ATCC 21370 420
Pseudomonas insueta ATCC 21276 340

Beispiel 2

Eine wässrige Lösung (200 ml, pH 7,1), die durch Auflösen von 3 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1,4 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,1 g Na&sub2;HPO&sub4;, 0,2 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 30 mg CaCl&sub2;·2H&sub2;O, 30 mg FeC&sub6;H&sub5;O&sub7;·XH&sub2;O, 5 mg MnCl&sub2;·4H&sub2; 0,5 mg ZnSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,5 mg CuSO&sub4;·5H&sub2;O und 5 g Methylaminhydrochlorid in 1 l Wasser hergestellt worden war, wird in Erlenmeyerkolben (1 l jeweils) zugegeben und bei 120ºC während 20 Minuten sterilisiert. Sie werden als Hauptkulturmedien bezeichnet.
Die Vorzüchtung erfolgt getrennt durch jeweiliges Züchten von Thiobacillus versutus ATCC 25364 und Pseudomonas aminovorans NCIB 9039 in dem gleichen Hauptmedium wie oben bei 30ºC während 24 Stunden. Die so erhaltenen vorgezüchteten Flüssigkeiten werden zum Inokulieren der Hauptmedien in einer Menge von 1 Volumenprozent verwendet. Die so erhaltenen Flüssigkeiten werden unter Verwendung einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 30ºC gezüchtet. Die Methylaminkonzentrationen in allen diesen Kulturflüssigkeiten wurden auf nicht mehr als 0,01 Volumenprozent nach 2-tägiger Züchtung erniedrigt. Die Überstände wurden durch Zentrifugieren der Kulturflüssigkeiten erhalten. Die Mengen an PQQ in den Überständen betrugen 340 ug beziehungsweise 300 ug pro Liter.

Beispiel 3

Eine wässrige Lösung (200 ml, pH 7,1), die durch die Auflösung von 3 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1,4 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,1 g Na&sub2;HPO&sub4;, 0,2 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 30 mg CaCl&sub2;·2H&sub2;O, 30 mg FeC&sub6;H&sub5;O&sub7;·XH&sub2;O, 5 mg MnCl&sub2;·4H&sub2;O, 5 mg ZnSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,5 mg CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 0,2 g Hefeextrakt, 10 ug Vitamin B&sub1;&sub2;, und 8 ml Methanol in 1 l Meerwasser hergestellt wurde, wurde in Erlenmeyerkolben (jeweils 1 l) gegossen und bei 120ºC während 20 Minuten sterilisiert. Sie wurden als Hauptkulturmedien bezeichnet.
Die Vorzüchtung erfolgte getrennt durch Züchten der jeweiligen, im folgenden angegebenen, Bakterien in dem gleichen Hauptmedium wie oben bei 30ºC während 24 Stunden. Die so erhaltenen vorgezüchteten Flüssigkeiten wurden je zum Inokulieren in einer Menge von 1 Volumenprozent der Hauptmedien verwendet. Die so inokulierten Flüssigkeiten wurden der Züchtung an einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 30ºC unterworfen. Die Methanolkonzentration in all den Kulturbrühen wurde auf nicht mehr als 0,001 Volumenprozent nach 2-tägiger Züchtung erniedrigt. Die Überstände wurden durch Zentrifugieren der Kulturflüssigkeiten erhalten. Die darin enthaltenen Mengen an PQQ sind in der Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Stämme Menge an PQQ (ug/l Überstand)
Methylomonas thalassica ATCC 33146 2600
Alteromonas thalassomethanolica ATCC 33145 6600

Beispiel 4

Eine wässrige Lösung (200 ml, pH 7,1), welche durch Auflösen von 3 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1,4 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,1 g Na&sub2;HPO&sub4;, 0,2 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 30 mg CaCl&sub2;·2H&sub2;O, 30 mg FeC&sub6;H&sub5;O&sub7;·XH&sub2;O, 5 mg MnCl&sub2;·4H&sub2;O, 5 mg ZnSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,5 mg CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 0,2 g Hefeextrakt, 10 ug Vitamin B&sub1;&sub2; und 8 ml Methanol in 1 l Meerwasser hergestellt worden war, wird in Erlenmeyerkolben (jeweils 1 l) gegossen und bei 120ºC während 20 Minuten sterilisiert. Sie wurden als Hauptkulturmedien bezeichnet.
Die Vorzüchtung erfolgte getrennt durch jeweiliges Züchten der im folgenden aufgeführten Bakterien, in dem gleichen Medium wie oben, bei 30ºC während 24 Stunden. Die vorgezüchteten Flüssigkeiten wurden je zum Inokulieren in einer Menge von 1 Volumenprozent der Hauptmedien verwendet. Die so inokulierten Flüssigkeiten werden dem Züchten unter der Einwirkung von Rotationsschüttelvorrichtungen bei 30ºC unterworfen. Die Methanolkonzentrationen in den Kulturflüssigkeiten wurden auf nicht mehr als 0,001 Volumenprozent nach der Züchtung während 1 1/2 Tagen erniedrigt. Die Überstände wurden durch Zentrifugieren der Kulturbrühen erhalten. Die Mengen an PQQ in den Überständen sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

Stämme Menge an PQQ (ug/l Überstand)
Methylophaga marina NCMB 2244 4400
Methylophaga thalassica NCMB 2162 4000
Methylophaga thalassica NCMB 2163 2600

Beispiel 5

Beispiel 4 wurde wiederholt, ausgenommen daß 1 Liter einer wässrigen NaCl-Lösung, die 30 g NaCl enthielt, anstelle von Meerwasser verwendet wurde. Die Methanolkonzentration in allen Kulturflüssigkeiten wurde auf nicht mehr als 0,001 Volumenprozent nach 1 1/2 Tagen Züchtung erniedrigt. Die Mengen an PQQ sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4

Stämme Menge an PQQ (ug/l Überstand)
Methylophaga marina NCMB 2244 5000
Methylophaga thalassica NCMB 2162 4600
Methylophaga thalassica NCMB 2163 3000

Beispiel 6

Beispiel 4 wurde wiederholt, ausgenommen daß 5 g Methylaminhydrochlorid pro Liter gelöst in Meerwasser anstelle von Methanol verwendet wurde. Die Methylaminkonzentrationen in allen Kulturbrühen waren am Ende der Züchtung auf 0,01 Volumenprozent erniedrigt. Die Mengen an PQQ sind in Tabelle 5 angegeben.

Tabelle 5

Stämme Menge an PQQ (ug/l Überstand)
Methylophaga marina NCMB 2244 4200
Methylophaga thalassica NCMB 2162 4100
Methylophaga thalassica NCMB 2163 2800

Beispiel 7

Beispiel 5 wird wiederholt, ausgenommen daß 5 g Methylaminhydrochlorid pro Liter Medium anstelle von Methanol verwendet wurden. Die Methylaminkonzentrationen in allen Kulturbrühen wurden auf 0,01 Volumenprozent gegen Ende der Züchtung erniedrigt. Die Mengen an PQQ sind in der Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6

Stämme Menge an PQQ (ug/l Überstand)
Methylophaga marina NCMB 2244 4100
Methylophaga thalassica NCMB 2162 4300
Methylophaga thalassica NCMB 2163 3000
Erfindungsgemäß kann stabiles PQQ mit niedrigen Kosten, wie oben beschrieben, unter Verwendung von Bakterien hergestellt werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Pyrrolochinolinchinons, dadurch gekennzeichnet, daß eins der im folgenden definierten Bakterien in einem Medium, das als Kohlenstoffquelle eine Methanolquelle und/oder eine Methylaminquelle enthält, gezüchtet wird, und das so gezüchtete Pyrrolochinolinchinon aus der Kulturflüssigkeit oder dem Überstand der Kulturflüssigkeit gewonnen wird, wobei das Bakterium die Fähigkeit besitzt, Methanol und/oder Methylamin unter Herstellung von Pyrrolochinolinchinon zu verwenden und zum Genus Achromobacter, Methylobacillus, Methylomonas, Methanomonas, Protaminobacter (mit der Maßgabe, daß dies nur P. candidus und P. thiaminophagus umfaßt), Methylobacterium, Protomonas, Mycoplana, Ancylobacter, Microcyclus, Hyphomicrobium, Xanthobacter, Thiobacillus, Alteromonas oder Methylophaga gehört.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium Achromobacter methanophila Methylobacillus glycogenes. Methylomonas methanolica, Methylomonas thalassica Methylomonas clara, Methanomonas methylovora, Methanomonas methylovora subsp. thiaminophila, Protaminobacter candidus or Protaminobacter thiaminophagus, Methylobacterium organophilum, Protomonas extorquens, Mycoplana rubra, Ancylobacter aquaticus Microcyclus eburneus, Microcyclus polymorphum, Microcyclus methanolica, Hyphomicrobium variable, Hyphomicrobium vulgare, Hyphomicrobium methylovorum, Hyphomicrobium sp., Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus, Thiobacillus novellus, Thiobacillus versutus, Alteromonas thalassomethanolica, Methylophaga marina, oder Methylophaga thalassica ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium Achromobacter methanophila ATCC 21275, ATCC 21452 oder ATCC 21961; Methylobacillus glycogenes ATCC 29475; Methylomonas methanolica NRRL B-5458; Methylomonas thalassica ATCC 33146; Methylomonas clara ATCC 31226; Methanomonas methylovora ATCC 21852, ATCC 21369, ATCC 21958 oder ATCC 21963; Methanomonas methylovora subsp. thiaminophila ATCC 21370; Protaminobacter candidus ATCC 21372 oder ATCC 21959; Protaminobacter thiaminophagus ATCC 21371, ATCC 21926, ATCC 21927, ATCC 21957 oder ATCC 21969; Methylobacterium organophilum ATCC 29983; Protomonas extorquens JCM 2802, JCM 2805, JCM 2806, JCM 2811, JCM 2812, JCM 2813, JCM 2814, JCM 2815, JCM 2816, JCM 2817, JCM 2818, JCM 2819, JCM 2820, JCM 2821, JCM 2822, JCM 2823, JCM 2824, JCM 2825, JCM 2826, JCM 2827, JCM 2829, JCM 2830, JCM 2831, oder JCM 2832; Mycoplana rubra NCIB 10409; Ancylobacter aquaticus ATCC 25396, DSM 334, ATCC 27068 oder ATCC 27069; Mi-crocyclus eburneus ATCC 21373; Microcyclus polymorphum NCIB 10516; Microcyclus methanolica DSM 2666, DSM 2667, DSM 2668 oder DSM 2669; Hyphomicrobium variable NCIB 10517; Hyphomicro-bium vulgare NCIB 9698 oder NCIB 9775; Hyphomicrobium methylovorum IFO 14180; Hyphomicrobium sp. DSM 1869; Xanthobacter autotrophicus DSM 432, DSM 431, DSM 597, DSM 685, DSM 1393, DSM 1618, oder DSM 2009; Xanthobacter flavus NCIB 10071; Thiobacillus novellus NCIB 10456 oder ATCC 8093; oder Thiobacillus versutus ATCC 25364; Alteromonas thalassomethanolica ATCC 33145; Methylophaga marina NCMB 2244, oder Methylophaga thalassica NCMB 2162 oder NCMB 2163 ist.

4. Verfahren zur Herstellung eines Pyrrolochinolinchinons, dadurch gekennzeichnet, daß ein Bakterium wie es im folgenden definiert wird, in einem Medium, das als Kohlenstoffquelle eine Quelle für Methylamin enthält, gezüchtet wird, und das so gebildete Pyrrolochinolinchinon aus der Kulturflüssigkeit oder dem Überstand der Kulturflüssigkeit gewonnen wird, wobei das Bakterium die Fähigkeit besitzt, Methylamin unter Bildung eines Pyrrolochinolinchinons zu verwenden und zur Spezies Pseudomonas aminovorans gehört.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium Pseudomonas aminovorans NCIB 9039 ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Methanol in der Kulturflüssigkeit nicht mehr als 3 Gew.-% beträgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Methanol in der Kulturflüssigkeit nicht mehr als 1,5 Gew.-% beträgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Methylamin in der Kulturflüssigkeit nicht mehr als 1 Gew.-% beträgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Methylamin in der Kulturflüssigkeit nicht mehr als 0,5 Gew.-% beträgt.