LT4605B - Fermentinis gliukozės sensorius ir jo gavimo būdas - Google Patents
Fermentinis gliukozės sensorius ir jo gavimo būdas Download PDFInfo
- Publication number
- LT4605B LT4605B LT99-032A LT99032A LT4605B LT 4605 B LT4605 B LT 4605B LT 99032 A LT99032 A LT 99032A LT 4605 B LT4605 B LT 4605B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- enzyme
- glucose
- electrode
- biosensor
- sensor
- Prior art date
Links
- 239000008103 glucose Substances 0.000 title claims abstract description 58
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 50
- 230000006870 function Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 47
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 46
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 26
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 25
- MMXZSJMASHPLLR-UHFFFAOYSA-N pyrroloquinoline quinone Chemical compound C12=C(C(O)=O)C=C(C(O)=O)N=C2C(=O)C(=O)C2=C1NC(C(=O)O)=C2 MMXZSJMASHPLLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 18
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 17
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 16
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 claims description 10
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 claims description 7
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 4
- 239000013047 polymeric layer Substances 0.000 claims description 4
- 125000004151 quinonyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- ATTTYDOGGQCDDK-UHFFFAOYSA-N C1=CC2=CC(=O)C(=O)NC2=C2C=CN=C21 Chemical compound C1=CC2=CC(=O)C(=O)NC2=C2C=CN=C21 ATTTYDOGGQCDDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 3
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 claims description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 abstract description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 abstract 1
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 abstract 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 abstract 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 abstract 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 48
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- IBGBGRVKPALMCQ-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=C(C=O)C=C1O IBGBGRVKPALMCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N hydroquinone O-beta-D-glucopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 7
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 6
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 229960000271 arbutin Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 4
- BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N p-hydroxyphenyl beta-D-alloside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfoxide Natural products CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- -1 inorganic compounds ammonium salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 3
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 3
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 2
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 2
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002468 redox effect Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000011540 sensing material Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- VBZBISQOWJYWCC-UHFFFAOYSA-N 2-(2-carboxypropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)N=NC(C)(C)C(O)=O VBZBISQOWJYWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCYGLFXKCBFGPC-UHFFFAOYSA-N 3,4-Dihydroxy hydroxymethyl benzene Natural products OCC1=CC=C(O)C(O)=C1 PCYGLFXKCBFGPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006418 Brown reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002160 Celluloid Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N Gluconic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005691 oxidative coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001197 polyacetylene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920000128 polypyrrole Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Išradimas priskiriamas medžiagų analizei fermentų pagalba, kurios metu nustatomi elektrocheminiai parametrai. Išradimas apima fermentinį, gliukozės nustatymui skirtą biosensorių, jo sukūrimą, biosensoriaus gamybai skirtus polimerus ir jų gavimą. Gliukozės sensorius gali būti panaudotas medicinoje diagnostikos tikslams (pvz., nustatant cukraus kiekį kraujuje), maisto kokybės kontrolėje (pvz., nustatant gliukozės kiekį maisto produktuose), mikrobiologinėje pramonėje (pvz., nustatant gliukozės kiekį mikrobiologinėse terpėse) arba moksliniams tyrimams, nustatant gliukozės koncentraciją įvairiuose biologiniuose skysčiuose ir mikrobiologinėse terpėse, taip pat gamybinių procesų kontrolėje.
Gliukozės fermentinis nustatymo būdas remiasi reakcija:
gliukozė + Oox —-—* gliukono rūgštis + Ored kurioje E (fermentas) yra katalizatorius, selektyviai atpažįstantis β-D-gliukozę ir katalizuojantis jos oksidaciją, o oksidatoriaus redukuota forma (Ored) registruojama kokiu nors būdu: pvz., elektrochemiškai arba spektrofotometriškai. Tirpale šios reakcijos atliekamos paprastai panaudojant gliukozės oksidazę, arba β-nikotinamido adenino dinukleotidą (NAD) turinčią gliukozės dehidrogenazę ir tirpų vandenyje, dažnai spalvotą oksidatorių.
Naudojant gliukozės oksidavimą katalizuojantį fermentą imobilizuotame būvyje, ir komponuojant katalitinį sluoksnį kartu su atitinkamu oksidatoriumi ant elektrocheminių daviklių paviršiaus, gaunami fermentiniai elektrodai (sensoriai).
Elektrocheminiai biosėnsoriai, kurių sudėtyje yra įvairios biologinės medžiagos - sparčiai besivystanti tyrimų sritis [J. Davis, D.H. Vaughan, M.F. Cardosi Enzyme and Microbial Technology, 1995, 17, 1030-1035], Šių biosensorių veikimo principai yra panašūs, tačiau biosensorių konstrukcijos pasižymi plačia įvairove. Ši įvairovė gali būti aiškinama remiantis kai kuriais elektrocheminių sensorių konstrukciniais elementais: tai sensorinė medžiaga fermentas, polimerai, kurie naudojami sensorinės medžiagos imobilizavimui ant elektrodo paviršaus ir dirbtiniai mediatoriai, pernešantys elektronus tarp fermento ir elektrodo. Pastarieji yra reikalingi, nes tiesiogiai vykdyti elektronų apykaitą tarp fermento aktyvaus centro ir elektrodo paviršiaus būna labai sunku. Dėl aukšto NADH viršvoltažio mediatoriai yra būtini konstruojant biosensorius, turinčius nuo β-nikotinamido adenino dinukleotido (NADH) kofaktoriaus priklausančias dehidrogenazes [P. Leduc, D. Thevenot Bioelectrochem. Bioenerg.,1974, 1, 96-107. J. Moiroux,P.J. Elving Anai. Chem., 1979, 51, 346-350]. Kiti žinomi kofermentai, pavyzdžiui, flavinadenindinukleotidas (FAD) ir pirolochinolinchinonas (PQQ) yra baltymo globulės viduje, kas dar labiau apsunkina elektronų pernešimą [R. VVilson, A.P.F. Turner Biosensor & Bioelectronics 1992,7,165-185 ]. Konstruojant daugiakartinio naudojimo elektrocheminius biosensorius, ir biosensorius naudojamus in vivo yra būtina naudoti vandenyje netirpius mediatorius, arba imobilizuoti juos ant elektrodo paviršiaus. Patikimais mediatoriaus imobilizavimo būdais galima laikyti jų kovalentinį prijungimą prie polimero matricos arba prie paties fermento.[ J. Davis, D.H. Vaughan, M.F. Cardosi Enzyme and Microbial Technology, 1995, 17, 1030-1035 ] Teoriniu požiūriu kovalentinis mediatorių surišimas su polimerine matrica ir /arba fermentu būtų tinkamas problemos sprendimas, tačiau praktiškai mediatorių pririšimas prie polimerų ir šiems tikslams tinkamų polimerų sintezė yra sunkiai išsprendžiamas uždavinys.
Patentinėje literatūroje yra plačiai aprašyti fermentinių sensorių konstrukcijų su oksidazėmis ir dehidrogenazėmis variantai, skirti gliukozės nustatymui įvairiuose biologiniuose skysčiuose. Dažniausiai tai - sudėtingos membraninės sistemos, kurių sudėtyje esančios stambiamolekulinės medžiagos atlieka arba mediatorių arba fermentą imobilizuojančios medžiagos funkciją, pavyzdžiui, aprašytos paraiškose WO 90/12889, EP-A- 0194 578, EPA-0 206 471.
JAV patente 4, 545, 382 ir paraiškoje EP-A- 0 078 636 aprašyti sensoriai gliukozės nustatymui in vivo, panaudojant gliukozės oksidazę ir gliukozės dehidrogenazę, sudaryti iš metalinio arba anglies strypo, mediatoriaus sluoksnio ir fermento (oksidazės arba dehidrogenazes), juos sulaikančio gelio sluoksnio ir apsauginės, laidžios vandeniui ir gliukozei membranos.
Konstrukcijoje aprašomos polimerinės medžiagos, pavyzdžiui poliviologenai, polivinilferocenas, atlieka mediatoriaus funkciją. Šio sensoriaus konstrukcija ir jos sukūrimas - sudėtingi technologiniu požiūriu, nes reikia panaudoti keletą skirtingas funkcijas atliekančių polimerų. Paraiškoje EP-A-01770743 aprašytas membraninis elektrodas, skirtas gliukozės nustatymui kraujyje ir kituose biologiniuose skysčiuose, kuriame fermentas dalinai imobilizuojamas, arba užnešamas ant pagrindo (rišančios medžiagos), kuriuo gali būti stambiamolekulinės medžiagos, impregnuotos elektronų mediatoriais. Išradime rišančia medžiaga naudojami poliacetilenai, polipirolai, poli-fenilsulfidai ir kiti polimerai. Sensorius dengiamas dar viena, substratui pusiau laidžia, polimerine membrana.
Žinomų elektrodų (sensorių) kūrime naudojamos įvairios stambiamolekulinės medžiagos skirtingoms funkcijoms atlikti sąlygojo sudėtingos konstrukcijos sensorių, gaunamų naudojant sudėtingas technologijas, pateikimą patentinėje literatūtoje. Todėl nesudėtingų ir greitai pagaminamų sensorių gavimas, kuriuose redoks polimeras vienu metu atliktų mediatoriaus, fermentą imobilizuojančios medžiagos ir apsauginio sluoksnio funkciją - aktualus, sudėtingas ir iki šiol neišspręstas uždavinys.
Išradimo tikslas - elektrocheminio sensoriaus, skirto gliukozės nustatymui sukūrimas, kuriame redoks polimerai atliktų visas aukščiau paminėtas funkcijas. Kitas šio išradimo tikslas - elektroaktyvių redoks polimerų, tinkamų naudoti biosensoriaus konstrukcijoje gavimas.
Išradimas realizuojamas sensoriaus konstrukcija, susidedančia iš anglinio elektrodo, fermento - dehidrogenazės ir elektroaktyvių redoks polimerų. Naudojant išradime siūlomą sensorių galima matuoti gliukozės koncentraciją nuo 0.1 mmol/l iki 22 mmol/l. Šie dydžiai apima visą fiziologinę gliukozės koncentracijų sritį. Gliukozės nustatymo metu nereikia pridėti papildomų reagentų, o analizė atliekama įmerkus sensorių į analizuojamąjį skystį arba užlašinus lašelį tiriamo skysčio ant darbinio elektrodo paviršiaus.
Sensorius yra gaunamas formuojant redoks polimero plėvelę ant anglinio elektrodo paviršiaus. Gliukozės sensoriaus konstravimas gali būti atliktas keliais būdais:
1) ant anglinio elektrodo paviršiaus formuojant atskirus sluoksnius, susidedančius iš fermento dehidrogenazės ir redoks savybes turinčio polimero,
2) anglinis elektrodas dengiamas plėvele, suformuota iš fermento ir redoks polimero,
3) fermento imobilizavimas atliekamas po anglinio elektrodo padengimo polimerine plėvele.
Sensoriaus konstrukcijoje naudojamos NADH, FAD kofaktorius turinčios dehidrogenazės, gautos iš Sigma firmos. Pagal geriausią sensoriaus konstrukcijos realizavimo variantą naudojama dehidrogenazė, turinti kofaktorių pirolochinolinchinoną (PQQ), išskirta iš Erwinios 34-1 ir aprašyta Biochemijos institute [Biotechnol Lett t 21, 187-192, 1999]. Išradime aprašomai PQQ dehidrogenazei išskirti kamienas Envinios 34-1 kultivuojamas skystoje terpėje. Terpė gali būti sudaryta iš įprastinių anglies šaltinių tokių kaip gliukozė, glicerolis, manitolis, arabinozė, fruktozė, galaktozė, manozė, sacharozė, ksilozė, trehalozė, melasa. Azoto šaltiniu gali būti peptonas, mielių ekstraktas, mėsos ekstraktas, kukurūzų ekstraktas, neorganiniai junginiai amonio druskos, neorganinės magnio druskos, fosfatai, geležies sulfatas. PQQ priklausoma dehidrogenazė, kurią būtų galima panaudoti pramoniniuose gliukozės oksidacijos procesuose, kuriant biosensorius, gaunama valant įprastiniais fermentų grynininmo metodais [ G. Jagow, H. Schagger A practical guide to membrane protein purification. 1994, Academic press, New York],
Naujai išskirta PQQ kofaktorių turinti dehidrogenazė pasižymi šiomis charakteristikomis: optimalus pH 7.5 - 8.5; optimali temperatūra nuo 20 iki 60 °C; stabili prie 40 °C, molekulinė masė nustatyta natrio dodecilsulfato poliakrilamidinės gel elektroforezės būdu ir lygi 88 kDa, Michaelio konstantos Dmaltozei, L-arabinozei, D-gliukozei, 2-dezoksigliukozei atitinkamai lygios - 5.77, 2.46, 0.185, 0.69 mmol/l. Fermento aktyvumo ir stabilumo priklausomybė nuo pH ir temperatūrinis stabilumas duoti Fig. 1-4. Šios dehidrogenazės katalitinės savybės nepriklauso nuo deguonies koncentracijos tiriamajame skystyje, dėl to deguonies koncentracijos pokyčiai neturi įtakos sensoriaus parodymams.
Sensoriaus konstrukcijoje redoks polimerais naudojami elektroaktyvūs polifenolio dariniai, pavyzdžiui, poli-3,4-dihidroksibenzaldehidas, polihidrochinonas, taip pat polimeriniai, feroceno grupę turintys dariniai, pavyzdžiui, poli-feroceniloksietilenas. Šios medžiagos vienu metu realizuoja elektronų mediatoriaus, fermentą imobilizuojančios struktūros ir difuziją kontroliuojančio sluoksnio funkcijas. Aprašomų polimerų elektrocheminis aktyvumas, apsprendžiantis jų mediatorines savybes, įrodytas ciklinės voltamperometrijos pagalba. Iš ciklinės voltamperogramos duomenų, (žiūrėti Fig. 7,13,16) seka, kad polimerai pasižymi grįžtamais oksidacijos - redukcijos virsmais. Fermento imobilizavimas vyksta mechaniškai juos įterpiant į polimerinį sluoksnį, arba sudarant ant elektrodo atskirą polimerinį sluoksnį, kuris sulaiko fermento globules ant elektrodo paviršiaus. Sensoriaus konstrukcijoje naudojama polimerinė plėvelė leidžia gliukozei difunduoti prie imobilizuoto fermento ir įvykti katalitinei reakcijai, ir tuo pačiu metu, riboja gliukozės difuziją prie fermento. Šie požymiai išplečia biosensoriaus signalo priklausomybės nuo gliukozės koncentracijos tiesinį diapazoną. Difuziją kontroliuojančio sluoksnio efektas parodytas Fig. 20.
Išradime aprašomų polichinoninių polimerų sintezė atliekama chemofermentinės arba organinės sintezės metodais.
Žinoma, kad fermentas lakazė oksiduoja ir polimerizuoja daugybę fenolių ir aromatinių aminų [R. B Brown. Oxidative coupling of phenols. New York, 1967, 167], Daugeliu atveju susidaro elektrochemiškai aktyvūs chinonai, o taip pat chinonines grupuotes turintys oligomerai bei polimerai. Taigi, galima tikėtis, kad iš kai kurių lakazės substratų įmanoma susintetinti redoks oligomerus ir polimerus, tinkančius biosensoriams. Šiame išradime pateikiamas polimerų, parinktų šio sensoriaus realizavimui, gavimo būdas, kai fenolines grupes turinčius monomerus veikiant lakaze gaunami elektrochemiškai aktyvūs, mediatoriaus ir difuziją ribojančio sluoksnio funkcijas atliekantys polimerai. Šias savybes turintys redoks polimerai su feroceno grupe gali būti gaunami ir organinės sintezės metodais, prijungiant elektrochemiškai aktyvius komponentus prie oligomerų, pavyzdžiui, poli-feroceniloksietilenas gaunamas, laisvų radikalų metodu prijungiant ferocenilmetantiolą prie etilenglikolio vinilglicidilo diesterio oligomero 75 °C temperatūroje, esant azobisizosviesto rūgšties dinitrilui.[JI. BorycnaBCKHfi n ap; floKJiaAbi PAH, 1996, N° 12],
Išradimas yra iliustruojamas grafikais ir pateiktais eksperimentiniais pavyzdžiais.
Fig. 1 PQQ priklausomos gliukozės dehidrogenazės aktyvumo priklausomybė nuo buferio prigimties ir pH.
Fig. 2 PQQ priklausomos gliukozės dehidrogenazės aktyvumo priklausomybė nuo pH.
Fig. 3 PQQ priklausomos gliukozės dehidrogenazės temperatūrinis stabilumas.
Fig. 4 PQQ priklausomos gliukozės dehidrogenazės aktyvumo priklausomybė nuo temperatūros.
Fig. 5. Poli-dihidroksibenzaldehido sotaus tirpalo BMR 1H (90 MHz) spektras metanolyje.
Fig. 6. (A) Poli -3,4-dihidroksibenzaldehido, susintetinto iakazės pagalba IR spektras KBr tabletėje. (B) IRspektras poli - benzochinono, susintetinto Iakazės pagalba.
Fig. 7. A - Anglinio elektrodo, modifikuoto poli-DBA, ciklinė voltamperinė kreivė 0.05 mol/l fosfatiniame buferyje su 0.1 mol/l KCI, pH 6.7. Skleidimo greitis 10 mV/s. B - Anglinio elektrodo, modifikuoto poii-DBA, pusiausvyrinio potencialo priklausomybė nuo pH.
Fig. 8. Anglinio elektrodo, modifikuoto poli-DBA, anodinės srovės priklausomybė nuo NADH koncentracijos. 1, 2 - dvi to paties elektrodo kalibracinės kreivės.
Fig. 9. Poli-hidrochinono sintezės schema.
Fig. 10. Pakitimai UV ir matomos srities arbutino spektre (100 pmol/l) oksiduojant jį lakaze (25 ng/ml). Spektrai užrašyti be lakazės (1) ir pridėjus lakazę kas 8 min (2 - 6), po 2, 4 ir 24 valandų (atitinkamai 7 - 9).
Fig. 11. Poli-hidrochinono, gauto hidrolizuojant poliarbutiną (A) ir hidrochinono (B) IR spektrai KBr tabletėse.
Fig. 12. Hidrochinono (1) ir poli-hidrochinono, gauto hidrolizuojant susintetintą poliarbutiną (2) UV ir matomos srities spektrai, užrašyti metanolyje (10 mg/l).
Fig. 13. Anglinio elektrodo, modifikuoto poli-hidrochiononu, ciklinė voltamperinė kreivė (1). 2 - To paties elektrodo CV kreivė, pridėjus 12 mmol/l NADH. Skleidimo gretis 10 mV/s, terpė - fosfatinis buferis, pH 7.0.
Fig. 14. Anglinio elektrodo, modifikuoto poli-hidrochiononu, pusiausvyrinio potencialo priklausomybė nuo pH.
Fig. 15. Anglinio elektrodo, modifikuoto poli-hidrochiononu, atsakas į NADH 0.05 mol/ fosfatiniame buferyje su 0.1 mol/l KCI, pH 7.0, potenciostatinėse sąlygose,
E =200 mV, Ag/AgCI atžvilgiu.
Fig. 16. Anglinio elektrodo, padengto poli-Fc sluoksniiu iš 12 mg/ml tirpalo cikloheksanone ciklinė voltamperinė kreivė. Matavimai atlikti 0.05 mol/l fosfatiniame buferyje su 0.1 mol/l KCI, pH 7.0. Skleidimo greitis 10 mV/s.
Fig. 17. Anglinio elektrodo, modifikuoto poli-DBA ir PQQ-GDH, atsakas į gliukozę. Elektrodo potencialas 300 mV Ag/AgCI elektrodo atžvilgiu. 0.05 mol/l Glicininis buferis, pH 7.0 su 0.1 mol/l KCI. 1 ir 2 - dvi nuoseklios kalibracinės kreivės su tuo pačiu elektrodu.
Fig. 18. Anglinio elektrodo, modifikuoto poli-hidrochiononu, atsakas į gliukozę. Matuota 0.05 mol/l fosfatiniame buferyje, pH 7.0, potenxiostatinėse sajygose, E=550 mV, Ag/AgCI atžvilgiu.
Fig. 19. Anglinio elektrodo, padengto poli-Fc sluoksniu atsakas į gliukozę. Matavimai atlikti 0.05 mol/l fosfatiniame buferyje su 0.1 mol/l KCI, pH 7.0, esant tirpale 1.5 vnt. PQQ-GDH. Elektrodo potencialas 550 mV.
A - sluoksnis suformuotas iš koncentruoto (120 mg/ml) poli-Fc tirpalo cikloheksanone;
B - polimerinis sluoksnis suformuotas iš praskiesto (24 mg/ml) poli-Fc tirpalo cikloheksanone.
Fig. 20. Anglinių elektrodų, kurių paviršius padengtas poli-Fc ir adsorbuota PQQ-GDH (0.06 vnt.) kalibracinės kreivės.
- elektrodas, padengtas plėvele iš koncentruoto polimero tirpalo (120 mg/ml) cikloheksanone;
- elektrodas, ant kurio suformuota plėvelė iš praskiesto poli-Fc tirpalo (60 mg/ml).
Eksperimentinė dalis
Pavyzdys. Poli - 3,4-dihidroksibenzaldehido (poli-DBA) gavimas lakazės pagalba ir produkto charakteristika
CHO
L
HO
Poli - 3,4-dihidroksibenzaldehidas gaunamas iš pirktinio reagento 3,4dihidroksibenzaldehido (firmos “Sigma produktas), veikiant jo vandeninį tirpalą lakaze. 690 mg substrato ir 1 mg lakazės vandeninis tirpalas buvo maišomas 24 valandas atvirame inde. Tamsiai rudas reakcijos mišinys paskleidžiamas ant 1 m2 celuloido plėvelės ir toliau iš lėto džiovinamas ore. Išdžiūvęs, netirpus vandenyje produktas buvo naudojamas tyrimuose.
Poli-3,4-dihidroksibenzaldehido spektrinės charakteristikos duotos Fig. 5 ir Fig.
6.
Ištirpinto metanolyje poli-DBA BMR 1H spektre (Fig. 5) stebimi signalai aromatinių ir/arba dvigubos jungties protonų srityje (7.24,6.84 m.d.) ir signalas alifatinių protonų srityje (3.48 m.d.).
Polimero, ištirpinto D - dimetilsulfokside, C13 BMR spektre signalas su cheminiu postūmiu apie 138.2 ir 126 m.d., priskirtas aromatinei grupei, ir signalas su cheminiu poslinkiu 67.55 m.d., priskirtas alifatinei grupei.
Poli-DBA IR spektras KBr tabletėje pateiktas Fig. 6, kreivėje A. Pikas spektre ties 1200 cm'1 atitinka fenolinės hidroksilo grupės absorbcijos juostą. Poli-3,4-dihidroksibenzaldehido elektrocheminės savybės tirtos ciklinės voltamperometrijos būdu. Iš ciklinės voltamperogramos duomenų, pateiktų Fig. 7 A, seka, kad polimeras pasižymi grįžtamu oksidacijos - redukcijos virsmui, kurio pusiausvyrinis potencialas prie pH 7.0 yra 185 mV. Pusiausvyrinio potencialo priklausomybė nuo pH parodyta Fig. 7 B. Tiesės nuolinkio kampas (10 mV/pH) rodo, kad elektrodiniame procese dalyvauja 2 protonai ir 2 elektronai.
Ant anglinio elektrodo buvo suformuotas poli - DBA sluoksnis, išgarinant 3 pi sotaus etanolinio polimero tirpalo. Anglinis elektrodas su poli - DBA sluoksniu, poliarizuotas 200 mV Ag/AgCI palyginamojo elektrodo atžvilgiu, atsako į nedideles reduktoriaus - nikotinamidadenindinukleotido (NADH) koncentracijas. Anodinės srovės padidėjimas registruojamas saviraščio pagalba. Kalibracinis grafikas parodytas Fig. 8, kreivėje 1. Tiesinė grafiko dalis siekia 1.5 mM NADH. Polimerinis oksidatorius stabiliai išsilaiko ant elektrodo paviršiaus ir redoks savybės neprarandamos plaunant elektrodą ir vartojant jį pakartotinai. Iš Fig. 8, 2 kreivės matyti, kad antrą kartą matuojant NADH koncentraciją tuo pačiu elektrodu, signalai yra panašūs, kaip ir pirmos kreivės. Tai rodo, kad redoks polimeras ant elektrodo paviršiaus oksiduoja esantį tirpale biologinį reduktorių NADH, ir gali perduoti elektronus elektrodui.
Pavyzdys. Poli-hidrochinono sintezė ir charakteristika
OH
HO
Medžiagos sintezė atlikta pagal modifikuotą metodiką [J.S. Dordick et ai., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 12885-12886] iš pirktinio arbutino (“Sigma”, JAV). Sintezė vykdoma dviem stadijom: pirma, polimerizuojant arbutiną fosfatiniame buferyje pH 5.25, (lakazė yra šio proceso katalizatorius) ir, hidrolizuojant gautą poliarbutiną rūgštinėje terpėje. Reakcijų schema pateikta Fig. 9. Gautas produktas - netirpios vandenyje rudos spalvos nuosėdos plaunamas ant filtrinio popieriaus destiliuotu vandeniu.
Fig. 10 iliustruoja 0.1 mM arbutino tirpalo spektro pakitimus lakazės katalizuojamos oksidacijos metu. Matyti, kad procesas lydimas UV absorbcijos intensyvėjimu, po 24 h praktiškai baigiasi. Poliarbutinas yra tirpus vandenyje, rudos spalvos, sugeriantis šviesą ties 400 nm banga.
Gauto galutinio produkto poli-hidrochinono IR spektras (KBr tabletė) pateiktas Fig. 6, kreivėje B ir Fig. 11, A. Polimero spektre stebimos panašaus dažnio juostos kaip ir monomero spektre, kuris parodytas Fig. 11, B.
Monomero (hidrochinono) ir polimero UV bei matomos srities spektrai sugretinti Fig. 12. UV srityje stebima juosta polimero atveju (kreivė 2) yra pasislinkusi į ilgųjų bangų pusę, kas yra būdinga polimerams.
Polimero elektrocheminės savybės tirtos vandeniniuose buferiniuose tirpaluose, analizuojant modifikuotų polimero sluoksnių anglinių elektrodų ciklines voltamperometrines kreives. Tipinė tokia kreivė fosfatiniame buferyje parodyta Fig. 13. Matyti, kad polimerinė medžiaga pasižymi grįžtamu oksidacijos redukcijos virsmu (kreivė 1), kurio pusiausvyrinis potencialas prie pH 7.0 yra 57 mV. Pusiausvyrinio potencialo priklausomybė nuo pH yra tiesė, kuri parodyta Fig. 14. Tiesės nuolinkio kampas (-56 mV/pH) rodo, kad elektrodiniame procese dalyvauja 2 protonai ir 2 elektronai.
Poli-hidrochinono gebėjimas oksiduoti redukuotą nikotinamidadenindinukleotidą (NADH) atspindėtas anodinės srovės padidėjimu pridėjus 12 mM NADH (Fig. 14, kreivė 2). Potenciostatinėse sąlygose esant potencialui 200 mV, modifikuoto poli-hidrochinonu anglinio elektrodo atsakas į NADH yra tiesinis iki 5 mM NADH (Fig. 15).
Pavyzdys. Poli-feroceniloksietileno (poli-Fc) sintezė ir polimero charakteristika
Medžiagos sintezė atlikta pagal metodiką [JI EorycnaBCKuū n ąp; flOK/iaAbi PAH, 1996, N° 12] , prijungiant ferocenilmetantiolą prie etilenglikolio vinilglicidilo diesterio 75 °C temperatūroje, esant azobisizosviesto rūgšties dinitrilui.
Poli-Fc spektrinės charakteristikos, įrodančios medžiagos struktūrą, sutampa su literatūroje nurodytomis charakteristikomis.
Medžiagos IR spektrai KBr tabletėse rodė juostas, charakteringas feroceno žiedui (dvigubas pikas 480 ir 500 cm'1) srityje. Viniloksigrupėi charakteringos juostos_(1605, 1625 cm'1) sintezės eigoje išnykdavo.
Struktūrinė oligomero forjnulė:
(CH—O—CH,),—CH, CH-S
Poli - feroceniloksietileno (poli-Fc) elektrocheminės savybės tirtos tiesiog ant anglinio elektrodo paviršiaus išgarinant 2 pi cikloheksanoninio polimero tirpalo. Poli-Fc ciklinė voltamperinė kreivė parodyta Fig. 16. Stebimas grįžtamas vienelektroninis oksidacijos-redukcijos procesas, kurio pusiausvyrinis potencialas yra apie 450 mV Ag/AgCI palyginamojo elektrodo atžvilgiu.
Fermentinių elektrodų, pagamintų panaudojant aukščiau aprašytus polimerus veikimas aprašytas šiuose pavyzdžiuose.
Pavyzdys. Gliukozės sensorius su poli-DBA ir PQQ-GDH.
Ant anglinio elektrodo paviršiaus sorbuojamas sluoksnis iš 0.05 vnt. fermento PQQ-gliukozės dehidrogenazės ir išgarinama 3 pi sotaus etanolinio poli-DBA tirpalo.
Toks elektrodas potenciostatinėse sąlygose (300 mV) atsako į gliukozės pridėjimą į buferinį tirpalą (Fig. 17.). Sensoriaus jautrumas yra apie 0.2 μΑ/mM. Jautrumas nepakito, atliekant matavimus antrą kartą su tuo pačiu elektrodu (kreivė 2), tai rodo, kad fermento ir redoks polimero savybės nepakito, ir imobilizavimas įvyko efektyviai.
Pavyzdys. Gliukozės elektrodo su PQQ-GDH ir polihidrochinonu gamyba.
Fermentinis elektrodas gaminamas formuojant ant anglies elektrodo du sluoksnius: adsorbuoto fermento sluoksnį iš 0.06 vnt fermento PQQ-gliukozės dehidrogenazės ir polimero plėvelę. Plėvelė susidaro išgarinus ant elektrodo paviršiaus 2 pi polimero tirpalo dimetilsulfokside.
Gliukozės matavimai atliekami 0.4 ml tūrio gardelėje su 0.05 M fosfatiniu buferiniu tirpalu, kurio pH 7.0, poliarizuojant paruoštą elektrodą 550 mV Ag/AgCI palyginamojo elektrodo atžvilgiu. Pridedant į tirpalą gliukozės, registruojami anodinės srovės pokyčiai. Rezultatai, atspindintys signalo priklausomybę nuo gliukozės koncentracijos, parodyti Fig. 18. Elektrodo jautrumas - 0.08 pA/mM gliukozės.
Pavyzdys. Gliukozės elektrodo su poli - Fc gamyba
Ant anglinio elektrodo paviršiaus suformuota polimerinė plėvelė išdžiovinant 3 μΙ poli-Fc tirpalo cikloheksanone. Elektrodas su polimeriniu sluoksniu merkiamas į 0.2 ml tūrio gardelę su 1.5 vnt. PQQ-gliukozės dehidrogenazės buferiniame tirpale (pH=6) ir nustatoma foninė elektrodo srovė, poliarizuojant jį 550 mV Ag/AgCI palyginamojo elektrodo atžvilgiu. Į gardelę įnešama po 2 μΙ 0.1 M gliukozės tirpalo ir registruojami anodinės srovės pokyčiai. Gliukozės matavimai, naudojant poli-Fc padengtą elektrodą, kai poliferoceninis sluoksnis tarnauja sistemos oksidatoriumi, o fermentas yra tirpale, iliustruojamas Fig. 19. Elektrodo, kurio paviršiuje suformuota plėvelė iš 120 mg/ml poli-Fc tirpalo, jautrumas gliukozei buvo 0.04 μΑ/mmoll ir kalibracinio grafiko tiesinė dalis siekė iki 8 mmol/l (Fig. 21, A kreivė). Elektrodo, kurio paviršiuje suformuota plėvelė iš 24 mg/ml poliFc tirpalo, jautrumas buvo 0.25 μΑ/mmoll, o kalibracinio grafiko tiesiškumas siekė 6 mmol/l (Fig. 19, B kreivė). Iš gautų rezultatų matyti, kad esant 5 kartus mažesniam polimero kiekiui, elektrodo jautrumas gliukozei yra 6 kartus didesnis, tačiau toks Biosensorius turi trumpesnę kalibracinio grafiko tiesinę dalį.
Pavyzdys, Gliukozės sensoriaus su poli-Fc ir PQQ GDH gamyba.
Polimero pagalba ant elektrodo paviršiaus imobilizavome fermentą. Tam konstravome dviejų sluoksnių fermentinį elektrodą. Vidiniame sluoksnyje buvo fermentas PQQ-GDH (0.06 vnt), adsorbuotas ant anglinio elektrodo paviršiaus. Išorinį sluoksnį sudarė polimerinė plėvelė iš 2 ųl poli-Fc tirpalo cikloheksanone. Tokia konstrukcija turi kelis privalumus. Pirma, polimerinė plėvelė,būdama mažai tirpi vandenyje, apsaugo fermentą nuo išsiplovimo į tirpalą. Antra, plėvelė sukelia difūzinius apsunkinimus gliukozės patekimui iš tirpalo į fermentinį sluoksnį, dėl ko pailgėja kalibracinio grafiko tiesinė dalis.
Į paruoštą 0.4 ml tūrio gardelę įvedama 0.008 ml 0.1 mol/l gliukozės tirpalo ir išmaišoma. Galutinė gliukozės koncentracija gardelėje 2 mmol/l. Matavimai atliekami gardelėje su 0.05 M fosfatiniu buferiniu tirpalu, kurio pH 7.0, poliarizuojant paruoštą elektrodą 550 mV Ag/AgCI palyginamojo elektrodo atžvilgiu Registruojami anodinės srovės pokyčiai šešis kartus iš eilės, merkiant fermentinį elektrodą į tą patį 2 mmol/l gliukozės tirpalą ir po kiekvieno matavimo elektrodą nuplaunant destiliuotu vandeniu. Fermento sluoksnio stabilumą ir katalitinio aktyvumo išlikimą, panaudojus elektrodą kelis kartus, iliustruoja šie rezultatai. Užregistruoti signalai sudarė : 0.16; 0.25; 0.15; 0.15 0.14 ir 0.24 μΑ. Reikšmių vidurkis x = 0.18 μΑ,. Variacijos koeficientas CV = 11.6% rodo, kad gautos reikšmės yra eksperimento paklaidos ribose.
Elektrodo, kurio paviršius modifikuotas dviem sluoksniais - PQQ-GDH ir poliFc plėvele, jautrumas gliukozei pateiktas Fig. 20.
Iš 1 kreivės matyti, kad esant polimerinei plėvelei suformuotai, iš 120 mg/ml poliFc tirpalo, elekrodo jautrumas buvo 62 nA mmol·11, o kai polimerinė plėvelė gauta iš dvigubai mažesnio poli-Fc kiekio (Fig. 20, 2 kreivė), tai elektrodo jautrumas gliukozei buvo didesnis ir siekė apie 98 nA/mmol l. Tai leidžia manyti, kad esant mažesniam polimero kiekiui susidaro plonesnis sluoksnis, kuriame feroceno darinys turi didesnį judrumą ir gali efektyviau sąveikauti su aktyviu fermento centru. Taip pat gauti rezultatai patvirtina, kad polimerinė plėvelė apsunkina gliukozės difuziją katalitiniame sluoksnyje, nes kalibracinio grafiko tiesinė dalis pailgėja iki 24 mmol/l.
Claims (10)
- IŠRADIMO APIBRĖŽTIS1. Biosensorius (fermentinis elektrodas), skirtas gliukozės nustatymui biologiniuose skysčiuose, besiskiriantis tuo, kad susideda iš anglinio elektrodo, fermento dehidrogenazės ir polimerinės plėvelės, kuri vienu metu atlieka mediatoriaus, fermentą imobilizuojančios struktūros ir difuziją kontroliuojančio sluoksnio funkciją.
- 2. Biosensorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad fermentu dehidrogenaze yra β-nikotinamido adenino dinukleotido (NADH), flavinadenindinukleotido (FAD) arba pirolochinolinchinono (PQQ) kofaktorius turinčios dehidrogenazės.
- 3. Biosensorius, kuriame fermentu dehidrogenaze yra pirolochinolinchinono (PQQ) kofaktorių turinti dehidrogenaze pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad pirolochinolinchinono (PQQ) kofaktorių turinčią dehidrogenazę išskiria iš mikroorganizmo kamieno Erwinia sp 34-1.
- 4. Biosensorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo sudėtyje esanti polimerinė plėvelė yra polichinoninės struktūros redoks polimerai.
- 5. Biosensorius pagal 1 ir 4 punktus, besiskiriantis tuo, kad jo sudėtyje esančius polichinoninių struktūrų redoks polimerus gauna chinoninės struktūros monomerus polimerizuojant fermento lakazės pagalba.
- 6. Biosensorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo sudėtyje esanti polimerinė plėvelė yra feroceno grupę turintys dariniai.
- 7. Biosensoriaus pagal 1 punktą gavimo būdas dengiant fermentą ir redoks polimero plėvelę ant elektrodo paviršiaus, besiskiriantis tuo, kad fermentą imobilizuoja nekovalentiniais ryšiais įterpiant į polimerinį sluoksnį.
- 8. Biosensoriaus gavimo būdas pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad polimerą dengia ant elektrodo sudarant atskirą, fermentą sulaikantį, sluoksnį.
- 9. Biosensoriaus gavimo būdas pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad elektrodą dengia plėvele, suformuota iš fermento ir redoks polimero.
- 10. Biosensoriaus gavimo būdas pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, fermentas imobilizuojamas po elektrodo padengimo polimeru.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT99-032A LT4605B (lt) | 1999-04-07 | 1999-04-07 | Fermentinis gliukozės sensorius ir jo gavimo būdas |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT99-032A LT4605B (lt) | 1999-04-07 | 1999-04-07 | Fermentinis gliukozės sensorius ir jo gavimo būdas |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT99032A LT99032A (lt) | 1999-11-25 |
| LT4605B true LT4605B (lt) | 2000-01-25 |
Family
ID=19722068
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT99-032A LT4605B (lt) | 1999-04-07 | 1999-04-07 | Fermentinis gliukozės sensorius ir jo gavimo būdas |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| LT (1) | LT4605B (lt) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0078636A1 (en) | 1981-10-23 | 1983-05-11 | MediSense, Inc. | Sensor for components of a liquid mixture |
| EP0194578A2 (en) | 1985-03-13 | 1986-09-17 | Miles Inc. | Proteins immobilised on polyamides or cellulose hydrate and the use thereof for the preparation of biocatalysts, test strips or chromatography materials |
| EP0206471A2 (en) | 1985-04-24 | 1986-12-30 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Process for preparation of pyrrolo-quinoline quinone |
| WO1990012889A1 (en) | 1989-04-25 | 1990-11-01 | Migrata Uk Ltd | Method of analysis, reagent composition and use thereof for glucose determination |
| EP1770743A2 (de) | 2005-09-30 | 2007-04-04 | Schott AG | Verbundsystem, Verfahren zur Herstellung eines Verbundsystems und Leuchtkörper |
-
1999
- 1999-04-07 LT LT99-032A patent/LT4605B/lt not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0078636A1 (en) | 1981-10-23 | 1983-05-11 | MediSense, Inc. | Sensor for components of a liquid mixture |
| US4545382A (en) | 1981-10-23 | 1985-10-08 | Genetics International, Inc. | Sensor for components of a liquid mixture |
| EP0194578A2 (en) | 1985-03-13 | 1986-09-17 | Miles Inc. | Proteins immobilised on polyamides or cellulose hydrate and the use thereof for the preparation of biocatalysts, test strips or chromatography materials |
| EP0206471A2 (en) | 1985-04-24 | 1986-12-30 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Process for preparation of pyrrolo-quinoline quinone |
| WO1990012889A1 (en) | 1989-04-25 | 1990-11-01 | Migrata Uk Ltd | Method of analysis, reagent composition and use thereof for glucose determination |
| EP1770743A2 (de) | 2005-09-30 | 2007-04-04 | Schott AG | Verbundsystem, Verfahren zur Herstellung eines Verbundsystems und Leuchtkörper |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JAMES DAVIS, D HUW VAUGHAN, MARCO F CARDOSI: "Elements of biosensor construction", ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, 1995, pages 1030 - 1035, XP055283224, DOI: doi:10.1016/0141-0229(95)00013-5 |
| P. LEDUC, D. THEVENOT: "Chemical and electrochemical oxidation of aqueous solutions of NADH and model compounds", BIOELECTROCHEMISTRY AND BIOENERGETICS, 1974, pages 96 - 107, XP026713699, DOI: doi:10.1016/0302-4598(74)85011-7 |
| R.B. BROWN: "Oxidative coupling of phenols", pages: 167 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LT99032A (lt) | 1999-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cosnier | Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment or attachment to electrochemically polymerized films. A review | |
| Emr et al. | Use of polymer films in amperometric biosensors | |
| US5783056A (en) | Electrochemical enzyme biosensor | |
| Palmisano et al. | Electrosynthesized bilayer polymeric membrane for effective elimination of electroactive interferents in amperometric biosensors | |
| Cosnier | Electropolymerization of amphiphilic monomers for designing amperometric biosensors | |
| Garjonyte et al. | Prussian Blue-and lactate oxidase-based amperometric biosensor for lactic acid | |
| Garjonyte et al. | Glucose biosensor based on glucose oxidase immobilized in electropolymerized polypyrrole and poly (o-phenylenediamine) films on a Prussian Blue-modified electrode | |
| Haghighi et al. | Prussian blue modified glassy carbon electrodes—study on operational stability and its application as a sucrose biosensor | |
| Mizutani et al. | Amperometric determination of pyruvate, phosphate and urea using enzyme electrodes based on pyruvate oxidase-containing poly (vinyl alcohol)/polyion complex-bilayer membrane | |
| Mizutani et al. | High-throughput flow-injection analysis of glucose and glutamate in food and biological samples by using enzyme/polyion complex-bilayer membrane-based electrodes as the detectors | |
| Li et al. | Development of an amperometric biosensor based on glucose oxidase immobilized through silica sol–gel film onto Prussian Blue modified electrode | |
| Malinauskas et al. | Bioelectrochemical sensor based on PQQ-dependent glucose dehydrogenase | |
| Nakabayashi et al. | Amperometric glucose sensors fabricated by electrochemical polymerization of phenols on carbon paste electrodes containing ferrocene as an electron transfer mediator | |
| Dempsey et al. | Electropolymerised o-phenylenediamine film as means of immobilising lactate oxidase for a l-lactate biosensor | |
| Cardosi et al. | Amperometric glucose sensors for whole blood measurement based on dehydrogenase enzymes | |
| Garcia et al. | New fructose biosensors utilizing a polypyrrole film and D-fructose 5-dehydrogenase immobilized by different processes | |
| Schuhmann et al. | Electrocatalytic properties of polypyrrole in amperometric electrodes | |
| Mizutani et al. | Rapid measurement of transaminase activities using an amperometric l-glutamate-sensing electrode based on a glutamate oxidase–polyion complex-bilayer membrane | |
| Cosnier et al. | Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly (pyrrole-ammonium) and poly (pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. | |
| Lee et al. | Amperometric glucose biosensor based on screen-printed carbon electrodes mediated with hexacyanoferrate–chitosan oligomers mixture | |
| Şen et al. | Polyvinylferrocenium modified Pt electrode for the design of amperometric choline and acetylcholine enzyme electrodes | |
| Tzang et al. | Voltammetric biosensors for the determination of formate and glucose-6-phosphate based on the measurement of dehydrogenase-generated NADH and NADPH | |
| Mizutani et al. | Amperometric glucose-sensing electrode based on carbon paste containing poly (ethylene glycol)-modified glucose oxidase and cobalt octaethoxyphthalocyanine | |
| Schuhmann et al. | Electrocatalytic oxidation of NADH at mediator-modified electrode surfaces | |
| Eremenko et al. | Biosensor based on an enzyme modified electrode for highly-sensitive measurement of polyphenols |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20010407 |