-
Verfahren zum Züchten neuer Hefekulturen
| Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung |
| einer neuen Hefekultur in einem Nährmedium in Gegenwart eines |
| Petroleumkohlenwasserstoffs und eines sauerstoffhaltigen Gases. |
| Es ist bereits bekannt, Futter- oder andere Nährhefen aus Kohle- |
| hydraten wie Melasse, üolzhydrolysaten und Sulfitablaugen her- |
| zustellen. In jüngster Zeit wurden bereits Untersuchungen ange- |
| stellt, das Wachstum von Mikroben zu beschleunigen durch Ver- |
| wendung eines Kohlenwasserstoffs anstelle des Kohlehydrats
als |
| Kohlenstoffquelle. Es wurde nun eine neue Hefeart gefunden
und |
| r!Y V4i@@_ ilfu@ylY11@@=1 da ß l d2-vr#r#
#v"1f IivirL111 111M 11n##@lir#rr#.nw# r#YSVl#I i |
| . .-_ 1#.. ..- @.' u Nli 1Ai 1.IV114tJ1 iJIJ11VJ-
v 1J1i111lV11 |
| wächst in einem Nährmedium in Gegenwart von Petroleum- und |
| insbesondere von paraffinischen Kohlenwasserstoffen mit einer |
| Anzahl von Kohlenstoffatomen im Bereich von 10 bis 22 und in |
| Gegenwart eines Gases, das freien Sauerstoff enthält. |
Bei dieser neuen Hefeart handelt es sich um Trichosporon japonicum.
Diesen Stämmen wurden die Inc.. Nummern 20002_, 20003 und 20004 der American Type
Culture Collection zugeschrieben.
-
Aus den folgenden Untersuchungen ist-offensichtlich, daß@die erfindungsgemäße
Hefe eine neue Art darstellt: 1. Befunde in der I#ialzextral:tkultur Wenn
die Hefe bei 250C 3 Tage gezüchtet wurde, -waren deren Zellen oval oder länglich-oval
und von einer Größe von 2,5 bis 4,0 x 4,0 bis 20,0 Mikron.
-
Ringförmige oder kleine inselförmige-Häutchen wurden an der Oberfläche
der Kulturlösungen gebildet und»ein baumwollartiges Sediment bildete sich im unteren
Teil der Kulturlösung. Bei einmonatiger Züchtung bildeten sich an der Oberfläche
der Lösung gelbe viskose ausgedehnte Membranen.
-
z. Befunde in der Maizextraktagarkultur Wenn die Hefe bei 250C
3 Tage gezüchtet wurde, war die Zelle die gleiche wie in der oben erwähnten Malzextraktkultur
angegeben, die Kolonie war leicht braun, cremig und leicht konvex, der Rand war
ganzrandig oder wellig und es wurde eine Farbe gebildet, die rötlich-braun aber
kein Carotinoid war.
-
3. Schnittkultur ' Das Pseudomycel entwickelte sich gut und
ebenso gut ausgebildete Arthrosporen und Blastosporen.
-
Physikalische Eigenschaften
1) Optimale Züchtungsbedingungen:
pH 5,2; Temperatur 300C; aerob.
| 2) Bedingungen, unter denen sie Hefe wachsen konnte: |
| PI'-, 4,0 bis 6,8; Temperatur 20 bis 40°C; aereb. |
| 3) Assimilation und NitrE,treduktion: keine |
| 4) Koagulation von Milch: keine |
| 5) Reduktion von Pigmenten: keine |
| 6) 0smophilizität- (in einem Kulturmedium von 10 % NaCl): keine |
| 7) Verflüssigung von Gelatine: keine |
| 8) Vitaminbedarf: keiner |
| 9) C,rotino-bdbi ldun--: >eine. |
| 5. Assimilation von Stickstoffverbindu_Zgen |
| Die Hefe assimilierte Peptone, Armmoniumsulf at, Asparagin
und |
| Harnstoff. |
| 6. Assinilation von Kohlenstoffyerbindungen |
| Die Hefe assimilierte Glucose, Galactose, Sucrose und Salicin, |
| assimilierte jedoch nicht IZannose, Fructose, Lactose, Maltose, |
| Trehalose, Raffinose, Äsculin, , Dextrin, |
| Stärke, Inulin, I@Ielibiose, Kylose, Arabinose und Rhamnose. |
| 7. Sie konnte Äthylalkohol als einzige Kohlenstoffquelle nicht |
| assimilieren. |
| B. Sie konnte Kerosin als einzige Kohlenstoffquelle assimi- |
| lieren. |
| 9. Lackmusmilchtest: Sie peptonisierte Milch. |
| 10. Sie konnte in einem Petroleumtreibstofftank oder derglei- |
| chen verteilt werden. |
| Beim Vergleich der taxonomischen Eigenschaften der erfindungs- |
| gemäßen Hefe mit denen, die in der Literaturstelle J. Lodder |
| et a1. "The Yeast, a taxonomic study" (1952) beschrieben sind, |
| rn_ _1- |
| wird gefunden, daß die erf;.nd@?na@;@Am;@ße 11cfc |
| _ #_ Zii (lern n - |
| ron gehört. In dem genannten Werk ist jedoch kein Stamm erwähnt, |
| der mit der erfindungsgemäßen Hefe identisch ist. Das heißt |
| also, da.ß die erfindungsgemäße Hefe mit Trichosporon |
sericeum und Trichosporon capitatum etwas verwandt ist, bei denen
es sich um bekannte Stämme handelt, von diesen jedoch eindeutig verschieden ist
in Bezug auf die Assimilation von Sucrose und die Bildung einer nicht carotinoiden
rötlichbraunen Farbe. Daraus ergibt sich, daß die erfindungsgemäße Hefekultur einem
neuen Stamm angehört. Sie wurde Trichosporon japonicum genannt. Vorzugsweise soll
die als Rohmaterial ver-@ wendete Substanz, die von der erfindungsgemäßen "liefe
assimiliert werden kann, reich an paraffinischen Kohlenwasserstoffen sein. Paraffinische
Kohlenwasserstoffe, die andere Kohlenwasserstoffe wie naphthenische und aromatische
Kohlenwasserstoffe enthalten, können jedoch verwendet werden.
-
Im allgemeinen greifen naphthenische und aromatische Kohlenwasserstoffe
in das Wachstum vo-.i Hefen im Wachstumsprozeß nicht ein. Destillate von Rohölen
wie Gasolin, Kerosin, Gasöl, Schweröl oder irgendwelche andere Praktionen können
verwendet werden. Außerdem ist es besonders vorzuziehen, solche Fraktionen zu verwenden,
die in Bezug auf Gehalt an normalen Paraffinen durch Molekularsiebtrennung angereichert
wurden, oder ein normales Paraffin von mehr als 15 Kohlenstoffatomen.
-
Bei Verwendung der erfindungsgemäßen liefe liegt der größte erzielbare
Vorteil darin, daß eine Hochtemperaturkultur möglich ist. Das heißt, daß sich die
Bebrütungstemperatur von der bei üblichen Hefen unterscheidet und vorzugsweise 30
bis 400C beträgt. Der calorische Wert der Kultur ist bei der Kohlenwasserstoff-Permenti_erung
dreimal so hoch wie in der Kohlehydratfermentierung. Bei der industriellen Herstellung
der Zellen aus Kohlenwasserstoffen ist daher, um die Flüssigkeitstemperatur .:.:.m
: --1'--f#-o- osnndovyV rc. _.m #nmmnr' #,e-, cr3-;11 nnul J.411.4
r opt;mn i.Lnn b@rlrv@lu 1./ylulallil 1. Vl< Temperatur zu halten, eine
Kühlvorrichtung oder Kühlwasser von niedriger Temperatur erforderlich. Wo derartiges
Kühlwasser von niedriger-Temperatur nicht verfügbar ist, ist es unmöglich, die Kultur
in industriellem Maßstab herzustellen.
-
Da andererseits die erfindungsgemäße liefe eine so hohe optimale Wachstumstemperatur
wie 35 bis 400C aufweist, ist das Problem
des Kühlwassers gelöst
und die Entwicklung einer neuen Technik zur industriellen Herstellung der Kultur
ist gegeben.
-
Keine andere petroleumassimilierende Hefe weist eine derartige Hitzebeständigkeit
auf und andere Hefen können daher nicht bei hoher Temperatur gezüchtet werden. Es
ist daher schwierig, sie industriell zu züchten, was einen wichtigen Faktor darstellt.
Ii1 Bezug auf Bebrütungsbedingung wird die erfindungsgemäße Hefe vorteilhafterweise
bei einer Konzentration von 0,5 bis 20 Vol.% des Petroleum-Rohmaterials auf einem
Nährmedium gezüchtet. Es ist notwendig, der Kulturmediumzusammensetzung einen schwachen
Wachstumsfaktor und anorganische Salze zuzusetzen. als schwacher Wachstumsfaktor
wird eine geringe Menge eines allgemeinen Hefeextrakts, Maisquellwasser, Reiskleienextrakt,
Melasse oder irgendein anderes industrielles Produkt, das reich an Vitaminen der
Gruppe B ist, zugesetzt oder es werden Vitamine der Gruppe B zugegeben. Die zugefügte
Menge beträgt etwa 0,01 bis 0,5 i der gesamten Kulturlösung, kann jedoch in Abhängigkeit
von den Wachstumsbedingungen der Hefe nach Belieben eingestellt werden: Als anorganische
Salze werden verwendet Magnesiumsulfat, Natriumdihydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosph
at als Magnesium-und Phosphorquellen und Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Diammoniumhydrogenphosphat,
Harnstoff, flüssiger Ammoniak und Ammoniakwasser als Stickstoffquellen und Kaliumchlorid
als Kaliumquelle.
-
Der pH-Wert des Nährmediums wird im Bereich von 4 bis 7 gehalten.
Im allgemeinen erniedrigt sich dLtr pH-Wert der Kulturlösung mit a i.r_
,,_ .'-...- a T r rr , #j-- - f-rie=livo@,,#?_## #@##
rTPf##f A-11n #iprloch Harijsto.tL a t! i, i #_ #'t'#quelle verwendet wird,
erniedrigt sich der pH-Wert nicht. Im Bedarfsfalle kann irgendein anderes Ammoniumsalz
zu gegebener Zeit oder kontinuierlich zugefügt werden, um den pH-Wert einzustellen.
Da
ein Petroleumkohlenwasserstoff anstelle eines Kohlehydrats als Kohlenstoffquelle
verwendet wird, muß der erforderliche Sauerstoff dauernd in die Kulturlösung eingeblasen
werden. Für diesen Zweck kann Luft verwendet werden. Sie kann in der Kulturlösung
nach irgendeiner bekannten Methode dispergiert und eingebracht werden.
-
Um die Flüssigkeitstiefe, die durch Schaumbildung ver,ndert wird,
einzustellen, kann irgendein allgemein bekanntes Antischäummittel verwendet werden.
-
Die@ßebrütungszeit beträgt meistens weniger als 3 Tage. Das erfindungsgemäße
Verfahren kann mit Unterbrechungen oder kontinuierlich durchgeführt werden.
-
Um die Hefe von der Kulturlösung zu trennen, können so bekannte Trennmethoden
wie vom De Laval- oder Sharples-Typ verwendet werden.
-
Um jedoch die Petroleumkohlenwasserstoffe von der erhaltenen Hefe
vollständig zu entfernen, ist es notwendig, die Hefe wiederholt mit irgendeinem
bekannten Waschmittel zu waschen.
-
Wenn außerdem die die Petroleumsubstanz enthaltende liefe mit einem
geeigneten Lösungsmittel extrahiert und anechließend durch Zugabe eines Waschmittels
gewaschen oder schließlich mit Wasser gewaschen wird, ist es möglich, eine Hefe
herzustellen, von der der Petroleumgeruch entfernt ist.
-
Die folgenden Beispiele erläutern-die Erfindung. Das Protein, i'ct.ü,
ü1C Vitamine, rvüiti@ülädüicil und das iioiliehyür'c.Lt der erfindungsgemäßen Hefe
sind vergleichbar mit denen in einer bekannten üblichen Hefezusammensetzung, Die
erfindungsgemäße Hefe enthält einen hohen Gehalt an Wachstumsfaktor und stellt eine
große Energiequelle dar und kann als Material für Tier- und andere Nahrungsmittel
als Nährhefe dienen.
B e i s p i e 1 1
Jeder der drei
Stämme. der Kohlenwasserstoff assimilierenden, kürzlich isolierten Hefekulturen
Trichosporon japonicurr, JF 182, 192 und 152 wurde zunächst einzeln in einem Malzextrakt-Agarkulturmedium
gezüchtet. Dann wurde die jeweilige Tiefe in eine, normale Paraffin-Agv-rinediuriktzltur
eingeimpft, die hergestellt wurde durch. Dösen von 2 g Ammoniumchlorid, 0,4 g Dinatriumhydrogenphosphat,
0,5 j K aliumdihydrogenphosrhat, 0,5 g IIagnesiumsulfat, 2 g Natriumchlorid und
1 g Iiefeextrakt in 1 1 Zeitungswasser, Lösen von 20 g Agar in diesem Gemisch, Einstellen
des plI-Werts auf 5 und anschließend Zugabe von 30 Vol. % von C15 bis C22 zu diesem
Gemisch und Sterilisieren und Koagulieren nach üblichen Methoden, und dann wurde
bei 300C bebrütet, um eine Gewöhnung an den Kohlenwasserstoff zu erzielen. Diese
Arbeitsweise wurde fünfmal wiederholt. Auf d-ese Weise erlangte die an das normal-Paraffin
gewöhnte Hefe eine stabile Kohlenwasserstoffassimiliereigenschaft.
-
Dann wurde wie im folgenden beschrieben durch Schütteln in einem Kolben
bebrütet und die Ausbeute an-IIefe wurde bestimmt. Und zwar wurden 50 ml Kulturlösung
hergestellt, indem 4 g Harnstoff, 4 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2 g Mabnesiumsulfat,
0,01 g Zerrosulfat und 1 g Melasse in 1 1 Leitungswasser gelöst wurden, der plI-Wert
wurde auf 5 eingestellt und es wurden 2 Vol.% normal-Paraffin (ein GeAi_sch aus
C15 bis C22) zugefügt, das Ganze wurde in einen Schüttelkolben von 500 ml Volum.
geschüttet und sterilisiert. Die an die oben erwähnte normal-Paraffin-Agarmedium-.kultur
gewöhnte und in ihr gezüchtete Hefe wurde in die Z»l_t»rlösung geimpft und 45 Stunden
geschüttelt. Die Ausbeuten an trockener Hefe bei Bebrütungstemperaturen von 30,
35 und 370 wurden bestimmt und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
-
Als Kontrollen wurden die Ausbeuten an trockener Hefe bei 30,
35
und 37o an jeder der petroleumassimilierenden Hefekulturen Candida rugosa und Candida
tropicalis bestimmt, die an ein normal-Paraffin-Agarkulturmedium in genau der gleichen-.Weise
wie oben beschrieben gewöhnt und in ihm gezüchtet wurden.
| T a b e 1 1 e I |
| Hochtemperaturkultur von Trichosporon japonicum |
| (Menge an trockener Tiefe in mg/100 ml Kulturlösung; |
| 30°C 35°C 37°C |
| Trichosporon japonicum JF 182 1550 1533 1583 |
| " " JF 192 1465 1508 ".527 |
| " JF '152 1503 1588 1591 |
| Candida rugosa 1119 703 358 |
| Candida tropicalis 956 316 128 |
Die Analysenergebnisse der Zellzusammensetzüng von Trichosporon japonicum JF 182
(ATCC Nr. 20003), die nach den obigen Versuchen erhalten wurden, sind im folgenden
wiedergegeben:
| T a b e a. 1 e II : Analysenwerte |
| Feuchtigkeit 993 ;4 |
| Rohprotein 4.594 ; |
| Rohfett 6,9 n@hid@etw 4 @ 4 @a . |
| Rohasche 5,5 j |
| stickstofffreier Extrakt 28,5 |
| T a b e 1 1 e TII : Aminos@iurezusarimensetzunc |
| (g Aminosäure/100 g Protein) |
| Try 2,41 Pro 1,89 |
| Lys 7981 Gly 4.e99 |
| his 1,83 Ala 2162 |
| Arg 4,79 Val 5,50 |
| Asp 3,£i'; Met 1,2.0 |
| Thr .6e76 . Ileu 5907 |
| Ser 2,16 Leu 7,45 |
| Glu 4,41 Tyr 1,91 |
| Phe 6,23 |
B e i s p i e 1 2
1 1 einer Kulturlösung der kohlenwasserstoffassimilierenden
kürzlich isolierten Iiefekultur Trichosporon japonicum
JF 192 (ATCC Nr. 20002)
wurde durch Schütteln der Kultur in einem Kolben in gleicher gleise wie in Beispiel
1 beschrieben erhalten, außer daß die Züchtungstemperatur 370C betrug. Diese Kulturlösung
wurde dann als Impfstoff in einen Schwingzylin.der-Fermen--u'ator (jar fermentor)
vom Waldhof-Typ einer Kapazität von 20 1 geschüttet und belüftet. 10 1 einer Kulturlösung,
die hergestellt wurde durch Lösen von 0,61 i0 Ammoniumsulfat, 0,04 % Natriumdihydrogenphosphat,
0,05 % Kaliumdihydrogenphosphat und 5 Vol.% Reiskleienextrakt und Einstellen des
pH-Werts auf 5, wurden in üblicher Weise in dem Schwinefermentator sterilisiert.
Der oben erwähnte Impfstoff wurde steril zu dieser Kulturlösung gegeben und wurde
durch Schütteln bei 450 UPM. und durch Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 5
1/Min. gezüchtet. Dazu wurden 250 ml normal-Paraffin (C11 bis C19), das aus Gasöl
durch die Molekularsiebmethode°abgetrennt worden war, gegeben.
-
Die Bebrütungstemperatur betrug 370C.
Das Belüften
und Rühren der Kultur wurde 22 Stunden fortgesetzt. Denn wurden die Hefezellen durch
Zentrifugieren von der Kulturlösung getrennt und gewwschen und getrocknet. Die Ausbeute
betrug 153 g.
| T a b e 1 1 e IV : Analysenwerte |
| Feuchtigkeit B,8 i@ |
| Rohprotein 56,4 |
| Rohfett 693 Rohfasern 4,5 |
| Rohasche 8,4 |
| stickstofffreier Extrakt 15,6 |
| T a b e 1 1 e V : Aminosäurezusammensetzurg |
| (g Aminosäure/100 g Protein) |
| Try 2,12 Pro 2,73 . |
| Lys 7,33 Gly 14,24 |
| His 1971 Ala 3,06 |
| Arg 4,49 Va1 5,61 |
| Asp 4,30 . Met 1,10 |
| Thr 6,21 Ileu 4,78 |
| Ser 3,00 Leu E,95 |
| Glu 5,20 Tyr 2,73 |
| Phe 4,87 |
| B e i t i e 1 3 |
| Eine kohlenwasserstoffassimilierende kürzlich isolierte |
| Hefekultur Tricho sporon japonicum JF 152_ (ATCC Nr. 20004) |
| wurde in einem Fermentator nach derselben Verfahrensweise |
| wie in Beispiel 2 gezüchtet, außer daß die Zusammensetzung |
| der Scliiringf er rienta for-Kulturlösung 0,65 ;5 Anrioniumchl
orid, |
| 0,24 @3 Liarnrlcniu mhyäroir en7)hosi)ha.t, ),05 G ]z
aliumdih"?drogen- |
| phosphat und 0,35 ;@ Maisq,lellwasser enthielt. Der p11-Wert |
| wurde auf 5 eingestellt und die Bebrütungstemperatur betrug |
| 37 00 . |
| Per pli wurde mit flüssigem Ammoniak eingestellt. Als Kohlen- |
| stoffquelle.wurden 3 Vol./'o normal-Paraffin (C11 bis C22) |
| zugesetzt. Nach 18-stiindiger Züchtung wurden 210 g trockene |
| Hefe erhalten. |