DE1792724A1

DE1792724A1 - Verwendung eines Fermentationsmediums zur Gewinnung von Nicotinamid-adenindinucleotid

Info

Publication number: DE1792724A1
Application number: DE19671792724
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-07-29
Filing date: 1967-07-28
Publication date: 1972-10-05
Also published as: GB1165809A; DE1642710A1; DE1642710B2; DE1642710C3; FR1552856A; DE1792724B2; US3705081A; DE1792724C3

Description

Dipi.-lr.;. H-i.'^ .·:,·.:■ ULAR *ugukle-Viktüria-Straßu 56

25 OKt. 1ü7i

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan

Verwendung eines Fermentationsmediums zur Gewinnung von Nicotinamid-adenin-dinucleotid

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines durch aerobes Züchten von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6 872 in einem wässrigen Pantothensäure, ß-Alanin oder Coenzym A enthaltenden Nährniedium bei üblichen Bedingungen erhaltenen Fermentationsmeaiurns zur Gewinnung von Nicotinamid-adenin-dinucleotid.

Es ist bereits bekannt, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6 &('k in einem Pantothensäure, ß-Alanin oder Coensym A enthaltenden liährraectiurn bei üblichen Bedingungen zu züchten; bisher wurde diese Fermentation zur Herstellung von 5*-Xanthinsäure bzw. von 5^!-Purin- -nucleotiüen auf biotechnischem Wege angewendet. Die Gewinnung von Nicotinamid-adenin-dinucleotid aus einem solchen Fermentationsmedium Ijt bisher nicht vorgeschlagen worden.

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2 a τ , ι-/

Aus der deutschen Patentanmeldung P IC ¹Vd 710.4-4i i-.t üin biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Ijiootln.v.'.iu-aceriin-ai nucleqtid bekannt, bei welchem ein I-ükroorganibiui': j-rj^jbaGto sp. ATGC 21 084 oder Artnrobacter sp. ATCC 21 0o5 in -jine;.-: vrässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Ge^iii.-.'crt ν cn rr.ir.-destens einem der Stoffe Pantothensäure, ij-.\xai,in -er Oo^n^yrr. λ gezüchtet und das Nicotinamid-adenin-dinuclectia. j.l,:; -."ic.-;. i'.i:.i'a:;. gewonnen wird. Unter ähnlichen Bedingungen wird bei Verwendung des Mikroorganismus Brevibacterium ammonlagenes ATCC 6 872 ebenfalls Nicotinamid-adenin-dinucleotid in hoher AuJb"·-¹ '_vr rrzeugt.

Nicotinamid-adenin-dinucleotid findet sich in Hefen, Schimmelpilzen, Bakterien usw.. Ein Verfahren zur Gewinnung dieser Substanzen durch Extraktion von Hefezellen und Reinigung derselben ist bekannt. Nicotinamid-adenin-dinucleotid spielt bei biochemischen Reaktionen eine wichtige Rolle.

Erfindungsgemäss wurde gefunden, dass man - wenn Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6 872 in einem Fermentationsmedium. gezüchtet wird, das Pantothensäure, ß-Alanin bzw. Coenzym A oder Gemische derselben enthält - die Menge an Nicotinamid-adenin-dinucleotid wesentlich steigern kann, so dass die'Verwendung eines solchen Fermentationsmediums zur Gewinnung von Nicotinamid-adenin-dinucleo tid geeignet ist und eine" Bereicherung der Technik darstellt. ..

Das Züchtungsmedium besteht entweder aus einem synthetischen oder einem natürlichen Nährmedium, das die wesentlichen Nährstoffe für

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das- '.-/aciistur.-i aer verwendeten Mikroorganismen enthält.

Ein solches ZÜc-itungsmediu;;'; enthält gewöhnlich, eine Kohlenstoffquelle, -vjla Koj leliydrate^ sowie andere einschlägig bekannte Nähr-, stoffe, z.B. eine Stickstoffquelle, anorganische Verbinungen und ähnliche, die von den verwendeten Mikroorganismen in spezieller Menge nutzbar .gemacht werden.

Die Konlehydrate, die im Verlauf der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose, Stärke, Stärkehydrolysat, Melasse und dgl,. Kleine Mengen anderer geeigneter .Kohlenstoffquellen, wie Glycerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren, Kohlenwasserstoffe usw. können bei der Züchtung zusammen mit den Kohlehydraten verwendet werden. Die .Kohlehydrate können entweder einzeln oder in Mischungen von zwei oder mehreren verwendet werden und jede geringe Menge von anderen Kohlenstoffquellen kann auch einzeln oder in Mischungen von zwei" oder mehreren vor-aanden sein.

Die anorganischen. Verbindungen, die im.Züchtungsmedium gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden künnen,sind anorganische Phoa phate, z.B. Kaliumphos phat, Anmoniumphos phat usw. und andere anorganische Stoffe, v.'ie Magnesiumsulfat, Eisensulfat oder andere Liöenöälse, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid usw.„

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen 3&2en oder- Verbindungen verwendet werden, wie -

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z.B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Amrnoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat usw. oder eine oder mehr als eine Aminosäure im Gemisch miteinander, oder natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleisc--extrakt, Fischmehl," Pepton, Bouillon, Caseinhydro Iy sate, Fischpreldsafte, Reiskleieextrakt usw.. Diese Substanzen können auch verwendet werden entweder einzeln oder in Verbindung von zwei oder mehreren. Es kann auch notwendig werden, dem Züchtungsmedium gewisse wesentliche Nährstoffe zuzusetzen, je nach dem verwendeten Mikroorganismus, wie Aminosäure, z.B. Asparaginsäure, Threonin, Methionin usw. und/oder Vitamine, z.B. Biotin, Thiamin, Cobalamin und ähnliche.

Pantothensäure, β-A lain oder Coenzyin A können dem Medium als Verbindungen selbst oder geeigneter Salze derselben zugesetzt oder

in Form natürlich vorkommender Substanzen, Vielehe diee Verbindun-. gen enthalten, zugeführt werden. Vorteilhafterweise wird Pantothensäure dein Fermentationsmedium in einerMenge von ungefähr 0,1 bis 20 mg/1 zugesetzt; ß-Alanin in einer Menge von etwa 0,3 bis 50 rng/1 und Coenzym A in einer Menge von etwa 1 bis 50 rag/l. Wenn, die Verbindungen kombiniert verwendet werden, ist die ; Menge jeder zugesetzten Verbindung proportional kleiner und hängt von der jeweiligen Kombination ab.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, z.B. unter arobem Schütteln der Kultur, durch Rühren einer submersen Kultur bei einer Inkubationstemperatur von etwa 20 bis 40° C und einem bevor-

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zugten pH-V.'ert von etwa 5 t>is 9 durchgeführt. Man findet bemerkenswert grosse Mengen von Nicotinamid-adenin-dinucleotid in der Fermehtationsflüssigkeit angereichert:.

Andere Temperatur- und pH->-er t-Bedingungen können verwendet werden, aber mit geringerer Ausbeute.

Nach Abschluss der Fermentation kann das Nicotinamid-adenin-dinucleotid aus der Züchtungsflüssigkeit auf übliche Weise abgettjnnt werden, .wie z.B. durch Behandlung mit Ionenaustauscherharz, durch Fällung mit Metallsalzen, Extraktionsmethoden, herkömmliche Adsorptionsmethoden, Chromatographie und dgl.

Da.3 folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, sie jedoch nicht beschränken. Die Angaben bsiehen sich, wenn nichts anderes vermerkt ist, auf Gew.-%.

Beispiel . ■ -

Brevibacterlum ammoniagenes ATGC 6 872 wird als Einsaatbakterium verwendet. Es wird bei 30° C 24 Stunden lang in einemZüchtungsmedium, das 2.% Glucose, 1 % Pepton, 1 % Hefeeiirakt, 0,3 % Natriumchlärid und JO mog/l Biotin enthält, gezüchtet.

Das verwendete Züchtungsmedium hat die folgende Zusammensetzung: 100 g Glucose .

Og Harnstoff
. 10g K

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10 g KH-PO,.
■ . . ■ 10 g MgGO^ . 7H₂O

2f" g Fleischextrakt
30 nig Biotin pro Liter des Züciitunr-L-.ediur;:;:.

1 ml einer 12 ^igen Harnstofflösung wird getrennt sterilisiert und zu 19 ml des Fermentationsmediums, welches vorher in. eine::, Autoklaven bei 1 kg/cm zehn Minuten lang sterilisiert vmrde, hinzugesetzt. . . ·

Die Züchtungseinsaat wird dem Fermentationsmedium in einer Menge von etwa 10 Vol.-# desselben eingeimpft. Die Mischung der Medien wird dann in Anteilen von 20 ml in einzelne 250 ml fassende konische Kolben gegossen. Dem Fermentationsmedium werden verschiedene Mengen von Calciumpantothen, ß-Alanin oder Coenzyo A oder Mischungen daraus zugesetzt. Nach Sterilisation unter Druck wird eile Züchtung'durchgeführt unter aerobem Schütteln der Kultur bei 2Q°C. Nach einer Züchtungszeit von 48 Stunden v/erden dem Medium Adenin und Nicotinamid zugesetzt, um eine Konzentration von 2 mg/ml zu erreichen. Nach einer weiteren Züchtungszeit von 48.Stunden wird in der Züchtungsflüssigkeit Nicotinamid-adenin-dinucleotid erzeugt. Das Nicotinamid-adenin-dinucleotid wird dann aus der Züchtungsflüssigkeit durch eine Ionen-Austauschbehandlung gewonnen. Die folgende.Tabelle zeigt, welche Mengen von Nicotinamid-adenin-dinucleotid erzeugt werden, wenn verschiedene Mengen, an Calcium- -Pantothenat, ß-Alanin oder Coenzym- A dem Medium zugesetzt werden. Diese Ergebnisse werden mit dem Fall verglichen, wenn kein Zusatz

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dieser V.jrbir.jungen zum Ferrnentationsmediurn vorliegt.

Wie wan leicht a\xa Tabelle 1 ersehen kann, ergibt sieh eine
v/es ent ii.;ae Iten^enzunanme ues erzeugten Nicotinamid-adenin-dinuoleotias, wenn Calciumpantothenat, ß-Alanin oder Coenzym A
ae,Ti Füririentationsriieüiurn zugesetzt viorden sind. '

Tabelle 1

Zusatz zur:; Gi"dndir.ediu!;i Menge an produziertem Nicotin-

amid-adenin-dinucleotid (mg/ml)

3,1.

kein Zusatz	mg/1 -
Calciurnpantothenat 100 /us/l	räsA
- 2	iag/1 ·
12
20	/■ug/i
J-Alanin	:ng/l
380	,Oag/1
7 ο
-iQ,	mg/1 '.
Zoen^ X	-g/l
1	ni-5/1 [
10	n.c,, ^.
30
50

3,3

,1

3,5 2,1

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Aus dem obigen Beispiel wird ersichtlich, dass die im Fermentationsmedium erzeugte Menge an Nicotinamid-adenin-dinucleotid wesentlich gesteigert wird, wenn ein Zusatz von'Pantothensäure, ß-Älanin oder Coenzym A bzw. von Mischungen derselben vorgenommen wurde» Die Verwendung eines solchen Fermentationsmediums zur Gewinnung des Nicotinainid-adenin-dinuclectids. stellt daher eine vorteilhafte Methode.dar,

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Claims

Patentans ρ r u c h :

Verwendung eines durch aerobes Züchten von Brevibaeterium ammoniagenes ATCC 6 872 in einem wässrigen Pantothensäure, ß-Alanin oder Coenzym A enthaltenden Nährmedium bei üblichen Bedingungen erhaltenen Fermentationsmediums zur Gewinnung von Nicotinamid-adenin-dinucleotid. ,

Dr. Γ?.../

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