DE1595853A1

DE1595853A1 - Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosid-5'-triphosphaten

Info

Publication number: DE1595853A1
Application number: DE19661595853
Authority: DE
Inventors: Toshio Komuro; Masanaru Misawa; Takashi Nara
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1965-02-11
Filing date: 1966-02-10
Publication date: 1970-03-12
Also published as: US3444040A; GB1118995A

Description

S MÜNCHEN 27

Dr.-lng. HANS RUSCHKE Dipl.,Ing. HEINZ AGULAR

PATENTANWÄLTE

Postscheckkonto: Berlin West 7494

Bankkonto:

Bank f. Handel u. Industrie .. ' ' Deposltenkuse 82 T^-X T~* 1

TMitaSrnntea IJr ΚΧΌΙ. ^Ki°'»^m

Kto. 827908 ■■—' ^x · ·■"-'·* ^.f ■*■· Telegramm-Adretee:

Tilegramm-Adresse: . ., . ■■ Quadratur MQmImiI Quadratur Bariin

K 659 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosid-5'-triphosphaten

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosid-5¹-.triphosphaten« Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Purinnucleoaids' -tr!phosphaten durch·Fermentation. Speziell betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Purlnnucleosid-5¹-triphosphaten durch Fermentation mit Hilfe von Mikroorganismen in Gegenwart verschiedener organischer Säuren, organischer Lösungsmittel, oberflächenaktiver Mittel oder von Derivaten organischer Basen, insbesondere Purinbasen.

Purinnucleosid-5'-triphosphate sind wohlbekannt. Spezielle Beispiele sind u.a. Adenosin-5^!~triphosphat und Guanosin-5'-triphosphat_o Adenosin-5'-triphosphat (ATP) ist bekanntlich ein Coenzym, das an der Übertragung der Energie von Phosphatbindungen beteiligt ist und im Organismus die Ablagerung von Glucose als Glykogen ermöglicht. Guanosin-5'-tri-

009811/1113

BAD ORIGINAL

phosphat, C₁₀H₁₆NcO₁₄P₅ , ist ebenfalls eine bekannte Substanz«

Vor kurzem wurde von den vorliegenden Erfindern ein

e--Verfahren zur Herstellung von Purinnuc|bsid-5'-triphosphaten in guter Ausbeute durch Fermentation gefunden. Bei diesem Verfahren wird ein Mikroorganismenstamm von Brevibacterium ammoniagenes in Gegenwart einer Purinbase bzw. eines Purinnucleosids gezüchtet, wodurch das dieser Base entsprechende Purinnucleosid-5'-triphosphat gebildet wird (vgl. japanische Patentanmeldungen Nr. Sho 38-57520 und Nr. Sho 38-63229)· Es wurde jedoch gefunden, daß bei diesem Verfahren außer den gewünschten Purinnucleosid-5'-triphos phat en Purinnucleosiddiphosphate sowie Purinnucleosidmonophosphate gebildet und angesammeltwerden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nun die Tatsache ausgenutzt, daß Purinnucleosid-5·-triphosphate unter bestimmten Bedingungen biosynthetisch aus den entsprechenden Monophosphaten erhalten werden können.

Eines der Ziele, die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegen, ist die Entwicklung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von Purinnucleosid-5'-triphosphaten, mit dessen Hilfe sich die Nachteile und Unzulänglichkeiten der bekannten Verfahren überwinden lassen.

Eine weitere Aufgabe, die der Erfindung zugrundeliegt, ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung

BAD ORJG/NA/'

009811/1533 ^AL

von Purinnucleosid-S'-triphosphaten durch Fermentation, das in wirksamer und einfacher Weise durchgeführt werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosid-5'-triphosphaten durch Fermentation, das das Produkt in hoher Reinheit und guter Ausbeute liefert·

Ziel der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosid-5'-triphosphaten durch Fermentation, das in vorteilhafter* Weise in industriellem Maßstab durchgeführt werden kann und dabei hohe Produktausbeuten liefert.

Diese und weitere Ziele und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor«

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß man Purinnucleosid-5'-triphosphate in wirksamer Weise durch Fermentation herstellen kann, wenn man die Fermentation mit Hilfe eines Mikroorganismenstammes von Brevibacterium * ammoniagenes in Gegenwart verschiedener organischer Säuren, organischer lösungsmittel, oberflächenaktiver Mittel oder von Derivaten organischer Basen durchführt. Die Zugabe dieser letztgenannten Substanzen zu der Kulturflüssigkeit erhöht und fördert die Bildung der Purinnucleosid-S'-triphosphate. Die Tatsache, daß bestimmte Substanzen als solche die Produktionsausbeute an den Purinnucleosid-5'-triphosphaten bemerkenswert erhöhen, ist vom industriellen

• c

009811/1533 ~_BAD original ·

Standpunkt aus gesehen sehr vorteilhaft und stellt auoh eine sehr interessante biochemische Erscheinung dar«

Organische Säuren, die zur Erzielung der erfindungegemäßen Ergebnisse verwendet werden können, sind u.a. Citronensäure, Essigsäure, Ameisensäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Phthalsäure und dgl·· Wirksame organische Lösungsmittel sind u«a. Xylol, Toluol, Benzol, Methanol, Äthanol, Äthylacetat usw.· Beispiele für oberflächenaktive Mittel, die verwendet werden können, sind u.a. "Cation AB" (TrimethylocfadecylammoniumChlorid), "Cation F₂50", "Naimin S-215", "Kotamin D24" (ein tertiäres Ammoniumsalz{ eine genauere Angabe über die chemische Zusammensetzung ist nicht erhältlich), Cetylpyridiniumchlorid, Cetylpyridiniumbromid, Cetyltrimethylammoniumbromid, "Emal A", «Softer No. 601", "Honion E 215" (PoIyoxyäthylenoleinäther), "Konion NS208" und "Nonion 02". Derivate von organischen Basen, die verwendet werden können, sind u.a. Purinderivate wie 8-Azadenin, 8-Chlorxanthin, 2-Thioadenin und 2-Thio-6-hydroxypurin. Gemische dieser Substanzen können ebenfalle verwendet werden.

Für den speziellen Typ der zugegebenen Substanzen und die speziellen Fennentationsbedingungen kann zwar nicht definiert angegeben werden, wann und in welcher Konzentration die erfindungsgemäßen Zusätze verwendet werden sollten, doch kann der größte Effekt oftmals erzielt werden,

009811/1S33

wenn die Substanzen zugegeben werden, nachdem das Wachstum des Mikroorganismenstammes einen stationären Zustand erreicht' hat«,

Wenn Adenin oder Adenosin zu dem Fermentationsmedium gegeben werden, wird als Purinnucleosid-S'-triphosphat entsprechend Adenosin-5'-triphosphat gebildet. Wenn Guanin oder Guanosin zu dem Medium gegeben werden, wird entsprechend Guanosin~5'-triphosphat erhalten«

Wie oben bereits bemerkt, handelt es sich bei den Mikroorganismen, die sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als wirksam erwiesen haben, um solche der Gattung Brevibacterium ammoniageneso

Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sind in keiner Weise begrenzend abzufassen. Die Proζentangaben für die einzelnen Bestandteile in dem Fermentationsmedium beziehen sich auf das Verhältnis der Gewichtsmengen zum Gesamtvolumen der lösung in Wasser_e Die Ausbeuten der angesammelten Produkte sind für 5¹-Guanylsäure in mg/ccm des Dinatriumsalzes der 5'-Guanylsäure und für die anderen 5'-Nucleotide in mg/ccm des natriumfreien wasserfreien Produktes angegeben·

Beispiel 1

Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCG 6872 gezüchtete Es wird zunächst 24 Stunden in einem Impfkulturmedium gezüchtet, das 2 $ Glucose, 1,5 $> Pepton, 0,2 $ Harnstoff,

009811/1633

0,1 °/o K₉HPO., 0,03 # MgS0_A»7Hp0, 0,3 # NaCl, 0,01 $> FeS0.o7H₂0 und 30 γ/Liter Biotin enthält und vor der Zugabe zu dem Fermentationsmedium einen pH-Wert von 7,3 aufweist.

Das verwendete Fermentationsmedium weist die folgende Zusammensetzung auf:

10 °/o Glucose

1 io K₂HPO₄

1 # KH₂PO₄

0,1 96 MgSO₄ο7H₂O

0,01 # CaCl₂·2H₂O

30 % /JL Biotin

5 y /ecm Calciumpantothenat

3 #* /ecm Thiaminhydro chlorid 0,2 # Fleischextrakt

Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird mit 5 η NaOH auf 8,0 eingestellt. Nach Sterilisation unter Druck wird Harnstoff, der gesondert sterilisiert worden ist, in einer Menge von 0,6 % zu dem Fermentationsmedium gegeben.

Die Impfkultur wird in das Fermentationsmedium in einer Menge von 10 Vol-$ eingeführt» 20-ccm-Anteile der Mischung aus Impfkultur und Fermentationsmedium werden in 250-ccm-Erlenmeyerkolben gegeben. Es wird dann unter Schütteln bei 30⁰C gezüchtet.

72 Stunden nach Beginn des Zuchtens wird Guanin in einer solchen Menge zugegeben, daß eine Konzentration von

009811/1S33

3 mg/com erzielt wird. Zum gleichen Zeitpunkt werden die in Tabelle I genannten verschiedenen Bestandteile in die verschiedenen Kolben gegeben· Nach weiterem 24-stündigem Züchten haben sich - in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Zusatz - die in Tabelle I genannten Guanin-5¹-nucleotide in den angegebenen Mengen angesammelt.

Tabelle I

	4,	Angesammelte Menge(mg/com) an:	2,00	Guanosin- 5^!-triphos phat
Zusatz	7° Konzen tration des Zu satzes	Natrium- Guanosin- salz von 5'-di- 5'-Guanyl- phosphat säure		2,26
Kein Zusatz	-	2,10	1,48
Organische Säuren			2,05	6,24
Natriumfumarat	0,5	0,95	1,05	6,40 ·
Natriumforariat	1,0	0,69	1,80	5,54
Natriumeitrat	0,5	1,10	1,00	5,40
Natriumacetat	1,0	1,50	1,17	5,40
Natriumsuccinat	2,0	1,40	m	5,24
Phthalsäure 1	0,5	1,32	1,03
Organische Lösungsmittel			0,91	7,52
Xylol	1,0	0,82	1,03	6,92
Toluol	1>0	0,98	1,47	6,72
Benzol *	2,0	0,61	1,21	4,30
Methanol	1,0	1,76	0,84	4,90
Äthanol	1,0	1,00		5,22
Äthylacetat	2,0 .	1,08
Beispiel 2

Es wird unter Verwendung des gleichen Bakterienstammes und des gleichen Fermentationsmediums wie in Beispiel 1 gezüchtet. Gleichzeitig mit der Zugabe des Guanine zu der Kultur in einer Menge von 3 mg/ccm, d.h. 72 Stunden nach Be

009811/1533

ginn des Züchtens, werden jedoch anstelle der in Beispiel . 1 verwendeten organischen Säuren und organischen Lösungs- ' mittel verschiedene oberflächenaktive Mittel und Purinbasenderivate zu der Kultur gegeben. Es wird dann weitere 24 Stunden gezüchtet, wobei sich die in Tabelle II angegebenen Mengen an Guanin-5'-nucleotiden - in Abhängigkeit von dem ^jeweils verwendeten Zusatz - ansammeln«

	T a»b e 1	1 e II	2,00	Guanosin s' -tri phos phat
				2,26.
Zusatz	7° Konzen tration _t des Zu- ' satzes		0,97
Kein Zusatz	-	Angesammelte Menge(mg/ccm) an:	1,00	5,95
Oberflächenaktive Mittel		Natrium- Guanosin- salz von 5'-di- 5'-Guanyl- phosphat säure	1,34	5,85
»Cation P₂50	0,1	2,10	1,98	4,98
C etylpyridinium- chlorid	0,1		1,89	4,60
**Softer No. 601	0,5	Q₉Ht		4,02
♦♦*Nonion NS 208	1,0	1,19	1,98
****Nonion r< '	1,0	1,20	1,80	5,30
Derivat von Purinbasen		Spur	1,20	4,62
2-Thioadenin	0,05	0,86	1,42	4,20
2-Thio-6-hydroxypurin	0,1		3,81
8-Azadenin	0,1	0,65
8-Chlorxanthin	0,1	1,38
1,72
1,34

* Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (Nissan Oil and Pat

* Chemical Co.)

** Alkylbetain (Nissan Oil and Pat Chemical Co.)

*** Polyoxyäthylenalkylaliyläther (Nissan Oil and Pat Chemical

Co.) **** Polyäthylenglykolmorooleat (Nissan Oil and Pat Chemical Go.)

009811/1533

Beispiel 3

Es v/erden der gleiche Bakterienstamm und das gleiche Fermentationsmedium wie in Beispiel 1 verwendet. Es wird . weiterhin unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß anstelle von Guanin Adenin zu dem Kulturmedium gegeben wird«. Das Adenin wird 72 Stunden nach dem Beginn des Züchtens in einer solchen Menge zugegeben, daß die Konzentration in dem Medium 3 mg/ccm beträgt ο Gleichzeitig werden die in Tabelle III genannten verschiedenen Zusätze in die verschiedenen Kolben gegeben. Die angesammelten Mengen an Adenin-5'-nucleotiden sind in Tabelle III angegeben«

Tabelle III

Zusatz

Konzentration des Zusatzes

Angesammelte Menge(mg/ccm) an:

5'-Adenyl- Adenosin- Adenosinsäure 5'-di- 5'-triphos phat phosphat

Kein Zusatz

Organische Säuren

Natriumcitrat 0,5

Natriumfumarat 0,5

Natriumformiat 1,0

Natriumsuccinat 0,5

Natriumacetat 1,0

Organische Lösungsmittel

Xylol 0,5

Toluol 1,0

Benzol 1,0

Methanol 1,0

Oberflächenaktive Mittel

»Cation f₂5O" . 0,1

*"Emal A"

C etyltrimethyliiuaibromid

0,1 0,1

2,15

0,55
O,'4O
0,80
1,00
0,95

Spur
Spur
0,70
0,88

1,25
1,40

2,25

0,90 1,45 1,45 1,60 2,00

1,05 1,20 1,35 1,75

1,40 1,70

2,40

6,25 5,80 5,25 5,25 4,75

6,84 6,35 6,00 5,35

5,75 5,50

1,45
1,55

2,00 1,00

4,90 6,00

Derivats von Purinbase.n

2-Thioadenin 0,05

*Ηιι1ίαΐ excess höheren Alkohols, erhältlich von der Kao Soap Co, _tg£.i .uere Angabe der chemischen Zusammensetzung war nicht erhältlich),

009811/1533 - "/

BAD ORIGINAL

Beispiel 4

Brevibacterium ammoniagenes ATGC 6871 wird unter Verwendung des gleichen Impfkulturmediums wie in Beispiel 1 gezüchtet.

Das verwendete Fermentationsmedium enthält die folgenden Bestandteile:

1Q"/> Glucose

1,25b KH₂PO₄

1,2?S MgSO₄- 7H₂O

0,01$ CaCl₂*2H₂O

30 V· / / Biotin

2 Jf /ecm ß-Alanin

0,5 //ecm Thiaminhydrochlorid 0,5$ Ρ ept on

Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird vor der Sterilisation auf 8,0 eingestellt» Nach der Sterilisation unter Druck wird Harnstoff, der gesondert sterilisiert worden ist, in einer Menge von 0,6 °ß> zu dem Fermentationsmedium gegeben. Die Züchtung wird unter den gleichen Bedingungen und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.

Nach 48-stündigem Züchten wird Guanin in einer Menge zu der Kulturflüssigkeit gegeben, daß eine Konzentration von 3 mg/ccm erzielt wird. Nach weiteren 12 Stunden Züchten werden Xylol und Toluol In den in Tabelle IV angegebenen zrAtrotionen in verschiedene« Kolben gegeben. Die Mengen

8AD

an Guanin-5*-nucleotiden, die sich nach 92-stündigem Züchten in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt haben, werden in Tabelle IV angegeben·

Tabelle IV

	Konzen tration des Zu satzes	Angesammelte	Menge (mg/ccm) an:	Guanosin- 5«-tri phos phat
Zusatz	-	Natrium- salz von 5'-Guanyl- säure	Guanosin s' -di- phosphat	2,11
Kein Zusatz	0,1 0,25 0,5 1,0 1,50	1,85	2,00	3,60 5,70 6,00 5,85 · 3,80
Xylol	0,1 C,25 0,5 1,0 1,5	1,39 0,78 0,55 0,80 1,35	1,50 . 1,35 1,40 1,40 1,20	2,85 4,50 6,05 5,89 2,85
Toluol		1,45 1,00 0,70 0,80 1,10	1,95 1,45 1,35 1,45 1.65
Beispiel

Der gleiche Bakterienstamm wie in Beispiel 4 wird in einem Impf kulturmedium, das 2 $> Glucose, 3 $> Fleischextrakt. 0,1 # Harnstoff, 0_t1 ^ K₂HPO₄ , 0,03 96 MgSO₄* 7HgO und 30 y/Liter Biotin enthält, 24 Stunden gezüchtet. Sodann wird diese Impfkultur in einer Anteilmenge von 10 VoI·-# zu dem Fermentationsmedium von Beispiel 4 gegeben, nachdem zu dem Permentationsmedium Adenin in einer Menge von 3 mg/ccm Fermentationsmedium gegeben worden ist. Es wird dann wie in Beispiel 4 beschrieben gezüchtet.

Nach Beginn dee Ztichtens werden die organischen Lösungsmittel Methyläthylkston und Dioxan in verschiedenen

009811/1533

8AD ORIGINAL

Zusatz

Kein
Zusatz

Methyläthylketon

Dioxan

Kolben zu verschiedenen Zeiten und in verschiedenen Mengen zu der !Permentationsflüssigkeit gegeben. Diese Variationen sind in Tabelle V angegeben. Nachdem das Züchten 96 Stunden fortgesetzt worden ist, haben sich die in Tabelle V angegebenen Mengen an Adenin-5*-nucleotiden in der Permentationsflüssigkeit angesammelt.

Tabelle V

Zeitpunkt der Stunden nach

Menee des
Zusatzes 5^f-Ade

Menge(mg/ocm)ant

Adenoein- Adenosin-5»-di-5«-tri-

2,04

2,15

2,00

24 48 7?

24 48 72

Beispiel 6

Brevibacterium ämmoniagenes KY3464 (ATOC 15750) wird unter VeI¹Wenάυng des gleichen Impfkulturmediume und des gleichen Fermentationsmediums wie in Beispiel 1 gezüchtet,

1	1 ^r
0,5'	_;J45
0,1	0,85
1	1,78
0,5	1,30
0,1	0,75
1	1,43
0,5	0,45
0,1	0,35
2	1,99
1	1,45
0,2	1,33
2	1,00
1	1,21
0,2	1,00
2	0,85
1	0,50
0,2	2,00

',* 13	4,04
1,80	5,60
1,10	6,05
2,20	4,22
1,75	5,80
0,75	6,30
1,98	4,76
1,85	6,05
1,25	6,25
2,21	4,00
1,85	4,40
1,80	4,85
2,00	4,96
1,95	5,25
1,54	4,15
1,95	5,11
1,45	6,00
1,80	2,45

009811/1533

^BAD ORIGI_NAL

Die Züchtungsbedingungen sind ebenfalls die gleichen. Nach 72-stündigem Züchten wird Guanin in einer solchen Menge zugegeben, daß seine Konzentration in dem Medium 3 mg/ccm beträgt„ Gleichzeitig werden die in Tabelle genannten weiteren Zusätze in verschiedene Kolben gegeben, Nach weiterem 24-stündigem Züchten haben sich die in Tabelle VI angegebenen Mengen an Guanosin-5^!-triphosphat angesammelte

Tabelle VI

	Menge des	Guanosin-5¹-
Zusatz	Zusatzes W	triphosphat (mg/ccm)
Kein Zusatz	_	1,85
Natriumformiat	1,0	5,20
Natriumcitrat	0,5	5,20
Natriumtartrat	2,0	4,80
Natriumfumarat	0,5	. 4,75
Xylol	0,5	5,85
Isopropanol	1,0	3,64

Beispiel 7

Brevibacterium ammoniagenes KY 3465 (ATCG 15751) wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß 3 mg/ccm Adenin zu Beginn des Zuchtens zugegeben werden. Nach 48-stündigem Züchten werden lie in Tabelle VII genannten organischen Lösungsmittel und oberflächenaktiven Mittel in verschiedenen Kolben zugege-

BAD ORIGINAL

009811/1533

ben· Die Mengen an Adenosln-5'-triphosphat, die sich bei Verwendung der verschiedenen Zusätze in der Fermentationsflüs3igkeit angesammelt haben, sind in Tabelle VII angegeben.

T a b e 1 1 e VII

	Menge des	Adenosin-5'-tri
Zusatz	Zusatzes	phos phat
		(mg/ccm)
Kein Zusatz		2,05
Xylol	0,5	6,00
Benzol	0,5	5,75
Isopropanol	1,0	4,20
Isoamylalkohol	1,0	4,15
^Kerosin Nr.1	1,0	4,11
"Emal A"	0,05	5,25
**»Naimin S215"	0,05	4,50

* "Nr*1" bedeutet die Liefernummer des verwendeten Kerosins, Angaben über seine chemische Zusammensetzung waren nicht erhältlich.

*♦ Polyoxyäthylenalkylamin, erhältlich von der Nissan Oil and Fat Chemical Co·

Aus der obigen Beschreibung und den Beispielen ist ersichtlich, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine große Zahl verschiedener Substanzen verwendet werden kann. Zu organischen Carbonsäuren, die verwendet werden können, gehören sowohl gesättigte als auch ungesättigte aliphatische Säuren sowie aromatische Säuren, wie z.B« die Phthalsäuren. Zu den verwendbaren organischen Lösungsmitteln gehören aro-

009811/1S33

bad

matische Kohlenwasserstoffe sowie Alkohole, Eater, Ketone und Äther· Aus den obigen Angaben ist ersichtlich, daß zu den verwendbaren oberflächenaktiven Mitteln kationische, anionisch« und nichtionieche Mittel gehören« Schließlich ist ersichtlich, daß es sich bei den bevorzugten Derivaten von organischen Basen um Derivate, von Furinbasen handelt«

BIe Züchtungsbedingungen und die zu verwendenden Fermeutationsmedien sind die gleichen, wie sie üblicherweise in der Fermentationsteohnik bei der Züchtung von Brevibaoterixaa ammoniagenea verwendet werden« Es sind sowohl künstliche Medien ale auch natürliche Nährmedien geeignet, so lange sie nur die für das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wesentlichen Hährstoffe enthalten» Diese Nährstoffe sind wohlbekannt» Datsu gehören Substanzen wie Quellen für Kohlenstoff, Quellen für Stickstoff, anorganische Verbindungen und 'dgl«, die von den verwendeten Bakterienstanm in geeigneten Mengen verwertet werden« Als Quelle für Kohlenstoff können s«B· verwendet werden Kohlenhydrate, wie - Glucose, Stärkehydrolysate_t Melassen uew·, oder irgend*oloh<r anderen bekannten Kohlenstoffquellen· Diese Substanz» können entweder einzeln oder in form von Gemischen aus zwei oder 'mehr dieser Substanzen verwendet werden. Ale Quelle für Stickstoff können die verschiedenartigsten anorganischen oder organischen Salze bzw. Verbindungen, wie Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, usw., oder natürliche stickst :f ieltige Substanzen, wie Maisquell-

BAD ORIGINAL

009811/1533

flüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl usw., verwendet werden· Auch diese Substanzen können sowohl einzeln als auch in Form von Gemischen aus zwei oder mehr dieser Substanzen verwendet werden· Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind u«a· Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Kaliumchlorid usw.. Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, wie z.B· als Schüttelkultur oder unter Rühren einer Tauchkultur, bei einer Temperatur von etwa 20 - 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,5 - 9,0 durchgeführt.

Aus der obigen Beschreibung ist ersichtlich,daß das erfindungsgemäße Verfahren in der verschiedensten Weise abgeändert werden kann. Alle diesp '"*, Liderungen liegen innerhalb des Erfindungsbereichs,

- Patentansprüche -

009811/1533

Claims

pat entansprüche :

1« Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosid-5¹-triphosphaten durch Permentation mit Hilfe des Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in Gegenwart einer organischen Säure, eines organischen Lösungsmittels, eines oberflächeny aktiven Mittels, eines Derivats einer organischen Base oder eines Gemisches dieser Substanzen durchführt»

2_e Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als organische Säure eine Carbonsäure verwendet wird,

3« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel ein Alkohol, Ester, Keton, Äther oder aromatischer Kohlenwasserstoff verwendet wird.

4· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Base ein Purin ist·

5* Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosid-5¹-triphosphaten, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart einer organischen Säure, eines organischen Lösungsmittels, eines oberflächenaktiven Hittels, eines Derivata einer organischen Baae oder einee Gemisches dieser Substanzen züchtet.

• «

009811/1533 bad original

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß als organische Säure eine Carbonsäure verwendet wird«

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel ein Alkohol, Ester, Keton, Äther oder aromatischer Kohlenwasserstoff verwendet wird»

8. Verfahren nach Anspruch 5_f dadurch gekennzeichnet, daß die organische Base ein Purin ist,

9« Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als organische Säure Gitronsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Phthalsäure oder Weinsäure verwendet wird,

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel Xylol, Toluol, Benzol, Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Methyläthylketon, Dioxan, Isopropanoi oder Isoamylalkohol verwendet wird.

11· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Purinbase 8-AzQdenin, 8-Chlorxanthin, 2-Thioadenin oder 2-Thio-6-hydroxypurin verwendet· wird.

12, Verfahren zur Herstellung von Adenosin-5'-triphosphat, dadurch gekennzeichnet, daß »an den Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthält, unter

«P8«11/1533

1593853

aeroben Bedingungen in Gegenwart von Adenin oder Adenosin sowie einer Carbonsäure, eines organischen Lösungsmittels, eines oberflächenaktiven Mittels, eines Derivats einer Purinbase oder eines Gemisches dieser Bubstanzen züchtet.

13· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872, ATCC 15750 oder ATCC 15751 gezüchtet wird·

14· Verfahren zur Herstellung von Guanosin-5'-triphosphat, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes in einem wäßrigen Nährmedium, das Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von Guanin oder Guanosin sowie einer Carbonsäure, eines organischen Lösungsmittels, eines oberflächenaktiven Kittels, eines Derivats einer Purinbase oder eines Gemisches dieser Substanzen züchtet«

15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872, ATCC 15750 oder ATCC 15751 züchtet·

K 659
Dr.U/Wr

BAD ORiGiNAL.

009811/1533