DE1792724B2

DE1792724B2 - Verwendung eines fermentationsmediums zur gewinnung von nicotinamidadenin-dinucleotid

Info

Publication number: DE1792724B2
Application number: DE19671792724
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara Nakayama (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-07-29
Filing date: 1967-07-28
Publication date: 1973-07-26
Also published as: DE1792724C3; DE1642710A1; FR1552856A; DE1642710B2; US3705081A; DE1792724A1; DE1642710C3; GB1165809A

Description

Die Erfindung besteht in der Verwendung eines durch aerobes Züchten von Brevibacterium ammo- j niagenes ATCC 6 872 in einem wäßrigen Pantothensäure. ,/'-Alanin oder Coenzym A enthaltendem Nährmedium bei üblichen Bedingungen erhaltenen Fermentationsmediums zur Gewinnung von Nicotinamid-adenin-dinucleotid.

Es ist bereits bekannt. Brevibacterium ammoniagenes ATCC 'S 872 in einem Pantothensäure, /i-Alanin oder Coenzym A enthaltenden Nährmedium bei üblichen Bedingungen zu züchten (siehe z. B. die französischen Patentschriften 1395 940 und 1439 879). Bisher wurde diese Fermentation zur Herstellung von 5'-Xanthylsäure bzw. \on 5'-Purinnucleotiden auf biotechnischem Wege angewendet. Die Gewinnung von Nicotinamid-adenin-dinucleotid aus einem solchen Fermentationsmedium ist bisher nicht vorgeschlagen worden.

Ein Verfahren zur Herstellung von Codehydrase I mit hoher Reinheit aus Hefe wird in der schweizerischen Patentschrift 408 841 vorgeschlagen. Dieses Verfahren trägt den Charakter eines Reinigungs-Verfahrens und ist dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige, Codehydrase I enthaltende Lösung, die durch Extraktion von Hefe erhalten wurde, durch ein schwach-basisches Anionenaustauscherharz in der Salzform geschickt, wodurch eine farblose, Codehydrase I enthaltende Lösung erhalten wird, daß die Lösung zu einem pH von 2 bis 3 angesäuert, die entstehende Lösung durch ein stark saures Kationen austauscherharz mit Sulfonsäuregruppen als aktiven Gruppen in der Wasserstofform geschickt, die Harzschicht mit einem sauren Puffer mit einem pH von 2 bis 3 gewaschen und die adsorbierte Codehydrase I mit einem schwach-sauren oder neutralen Puffer mit einem pH von 4 bis 7 eluiert und die Codehydrase Γ aus dem Eluat gewonnen wird.

Nach diesem Verfahren wird ein weißes Pulver mit einer Reinheit von 80 bis 90°/o erhalten.

Nicotinamid-adenin-dinucleotid findet sich in Hefen, Schimmelpilzen, Bakterien usw. Ein Verfahren zur Gewinnung dieser Substanzen durch Extraktion von Hefezellen und Reinigung derselben ist bekannt. Nicotinamid-adenin-dinucleotid spielt bei biochemischen Reaktionen eine wichtige Rolle.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß, wenn Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6 872 in einem Pantothensäure, /5-Alanin oder Coenzym A enthaltenden Fermentationsmedium aerob bei üblichen Bedingungen gezüchtet wird, Nicotinamid-adenindinucleotid in der Fermcntationsflüssigkeit erhalten wird, so daß die Verwendung eines solchen Fermentationsmediums zur Gewinnung von extrazellulärem Nicotinamid-adenin-dinucleotid geeignet ist.

Das Fermentationsmedium besteht entweder aus einem synthetischen oder einem natürlichen Nährmedium, das die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6S72 enthält.

Ein solches Fermentaüonsmedium enthält gewöhnlich eine Kohlenstoffquelle, wie Kohlehydrate, sowie andere einschlägig bekannte Nährstoffe, z. B. eine Stickstoffquelle,"" anorganische Verbindungen und ähnliche, die von dem verwendeten Mikroorganismus nutzbar gemacht werden.

Die Kohlehydrate, die verwendet werden können, sind z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat, Melasse u. dgl. Kleine Mengen anderer geeigneter Kohlenstoffquellen, wie Glycerin. Mannit, Sorbit, organische Säuren, Kohlenwasserstoffe usw., können bei der Fermentation zusammen mit den Kohlehydraten verwendet werden. Die Kohlehydrate können entweder einzeln oder in Mischungen von zwei oder mehreren verwendet werden. und~ jede geringe Menge von anderen Kohlenstoffquellen kann auch einzeln oder in Mischung!, η von zwei oder mehreren vorhanden sein.

Die anorganischen Verbindungen, die im Fermentationsmedium gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind anorganische Phosphate, z. B. Kaliumphosphat, Ammoniumphosphat usw. und andere anorganische Stoffe, wie Magnesiumsulfat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Kaliumchlorid. Magnesiumchlorid. Calciumchlorid usw.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen verwendet werden, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat. Ammoniumphosphat usw. oder eine oder mehr als eine Aminosäure im Gemisch miteinander, oder natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Bouillon. Caseinhydrolysate, Fischpreßsäfte. Reiskleieextrakt usw. Diese Substanzen können auch verwendet werden, entweder einzeln oder in Verbindung von zwei oder mehreren. Brevibacterium ammoniagens ATCC 6872 benötigt Biotin zum Wachstum.

Pantothensäure, ß-Alanin oder Coenzym A können dem Medium als solche oder in Form geeigneter Salze derselben zugesetzt oder in Form natürlich vorkommender Substanzen, welche diese Verbindungen enthalten, zugeführt werden. Vorteilhafterweise wird Pantothensäure dem Fermentationsmedium in einer Menge von ungefähr 0,1 bis 20 mg/1 zugesetzt; /?-Alanin in einer Menge von etwa 0,3 bis 30 mg/1 und Coenzym A in einer Menge von etwa 1 bis 50 mg/1. Wenn die Verbindungen kombiniert verwendet werden, ist die Menge jeder zugesetzten Verbindung proportional kleiner und hängt von der jeweiligen Kombination ab.

Medien der vorgenannten Art sind in den französischen Patentschriften 1 439 879 und 1 395 940 bereits beschrieben.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, z. B. unter aerobem Schütteln der Kultur, durch Rühren einer submersen Kultur bei einer Inkubationstemperatur von etwa 20 bis 40° C und einem bevorzugten pH-Wert von etwa 5 bis 9 durchgeführt. In den genannten französischen Patentschriften sind auch solche Fermentationsbedingungen bereits beschrieben.

Man findet bemerkenswert große Mengen von

Nicotinamid-adenin-dinucleotid in der Fennecta- ciumpantothenat, /i-Alanin oder Coenzym A oder tionsSüssigkeit angereichert. Mischlingen daraus zugesetzt. Nach Sterilisation

Andere Temperatur- und pH-Wert-Bedingungen unter Druck wird die Fermentation durchgeführt können verwendet werden, aber mit geringerer Aus- unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30° C. Nach beute. 5 einer Fermentationszeit von 48 Stunden werden dem

Nach Abschluß der Fermentation kann das Nico- Medium Adenin und Nicotinamid zugesetzt, um eine tinamid-adenin-dinucleotid aus der Fermentations- Konzentration von 2 mg/ml zu erreichen. Nach einer flüssigkeit auf übliche Weise abgetrennt werden, wie weiteren Fermentationszeit von 48 Stunden wird in z. B. durch Behandlung mit Ionenaustauscherharz, der Fermentationsflüssigkeit Nicotinamid-adenin-didurch Fällung mit Metallsalzen, Extraktionsmetho- io nucleotid erzeugt. Das Nicotinamid-adenin-dinucleoden, herkömmliche Adsorptionsmethoden, Chromato- tid wird dann — nach Entfernung der Zellen — aus graphie u. dgl. der Fermentationsflüsstgkeit durch eine Ionen-Aus-

Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern. tauschbehandlung gewonnen. Die folgende Tabelle Die Angaben beziehen sich, wenn nichts anderes zeigt, welche Mengen von Nicotinamid-adenin-dinuvermerkt ist, auf Gewichtsprozent. 15 cleotid erzeugt werden, wenn verschiedene Mengen

an Calciumpantothenat, /«-Alanin oder Coenzym A

Beispiel dem Medium zugesetzt werden. Diese Ergebnisse

werden mit dem FaJJ verglichen, daß kein Zusatz

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6 872 wird dieser Verbindungen zum Fermentationsmedium vorals Einsaatbakterium verwendet. Es wurde hierzu 20 liegt.

bei 30'C 24 Stunden lang in einem Medium, das Wie man leicht aus der Tabelle ersehen kann, ergibt

2°,'o Glucose, I⁰O Pepton. 1% Hefeextrakt, 0,3°/o sich eine wesentliche Mengenzunahme des erzeugten Natriumchlorid und 30 mcg/1 Biotin enthält, ge- Nicotinamid- adenin - dinucleotide, wenn Calciumzüchtet. pantothenat, /J-Alanin oder Coenzym A dem Fer-

Das verwendete Fermentationsmedium hat die 25 menJationsmedium zugesetzt worden sind,
folgende Zusammensetzung:

100 g Glucose, ^Tabdle

6 g Harnstoff, Zusatz zum Menge an produziertem Nicoi;in-

in ν xinr\ in Grundmedium amid-adenin-dinucleotid (mg ml) IU g lS..,rlr VJ₄, ^J

10 g KJH₂PO₄, ^Kein Zusatz 0,4

10 g MgSO₄ · 7 H₂O, Calciumpantothenat

2 g Fleischextrakt, 100 μg/l 2,9

30 meg Biotin pro Liter des Fermentations- 35 2 mg/1 3,1

mediums. 12 mg/1 4,3

20 mg/1 2.8

1 ml einer 12°/oigen Harnstofflösung wird getrennt ^-Alanin

sterilisiert und zu 19 ml des Fermentationsmediums, ^gQ ,j ^ j

welches vorher in einem Autoklav bei 1 kg/cm² 40 η 5 mg/l 38

10 Minuten lang sterilisiert wurde, hinzugesetzt. ^q'q * V4

Das Einsaatmedium wird dem Fermentationsmedium in einer Menge von etwa 10 Volumprozent Coenzym A

desselben eingeimpft. Die Mischung der Medien wird 1 mg/1 2,1

dann in Anteilen von 20 ml in einzelne 250 ml fas- 45 10 mg/1 3,5

sende konische Kolben gegossen. Dem Fermenta- 30 mg/1 3,5

tionsmedium werden verschiedene Mengen von CaI- 50 mg/1 2,1

Claims

Patentanspi uch:

Verwendung eines durch aerobes Züchten von Brevibacterium aramoniagenes ATCC 6 872 in einem wäßrigen Pantothensäure, ^-Alanin oder Coenzym A enthaltenden Nährmedium bei üblichen Bedingungen erhaltenen Fermentationsmediums zur Gewinnung von Nicotinamidadenin-dinucleotid.