DE1642710B2 - Biotechnisches verfahren zur herstellung von nicotinamid-adenin-dinucleotid - Google Patents

Biotechnisches verfahren zur herstellung von nicotinamid-adenin-dinucleotid

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DE1642710B2 DE19671642710 DE1642710A DE1642710B2 DE 1642710 B2 DE1642710 B2 DE 1642710B2 DE 19671642710 DE19671642710 DE 19671642710 DE 1642710 A DE1642710 A DE 1642710A DE 1642710 B2 DE1642710 B2 DE 1642710B2
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Description

haltende Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Bouillon, Caseinhydrolysate, Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt usw. Diese Substanzen können einzeln oder zu mehreren verwendet werden.
Pantothensäure, ^-Alanin oder Coenzym A können dem Medium als Verbindungen selbst oder als geeignete Salze dieser Verbindungen zugesetzt oder in Form von natürlich vorkommenden Substanzen, die diese Verbindungen enthalten, zugeführt werden. Wenn diese Verbindungen kombiniert verwendet werden, ist die Menge jeder zugesetzten Verbindung proportional kleiner und abhängig von der jeweiligen Kombination.
Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, z. B. unter aerobem Schütteln der Kultur, durch Rühren einer submersen Kultur bei einer Inkubationstemperatur von etwa 20 bis 40° C und einem bevorzugten pH-Wert von etwa 5 bis 9 durchgeführt. Man findet bemerkenswert große Mengen von NAD in der Kulturflüssigkeit angereichert.
Andere Temperatur- und pH-Wert-Bedingungen können verwendet werden, aber mit geringerer Ausbeute.
Nach Abschluß der Fermentation kann das NAD aus der Kulturflüssigkeit auf übliche Weise abgetrennt werden, wie z.B. durch Behandlung mit Ionenaustauscherharz, durch Fällung mit Metallsalzen, Extraktionsmethoden, herkömmliche Adsorptionsmethoden, Chromatographie u. dgl.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung. Wenn nichts anderes vermerkt, sind alle Angaben in Gewichtsprozent gegeben.
Beispiel
welches vorher in einem Autoklav bei 1 kg/cm2 10 Minuten lang sterilisiert wurde, hinzugesetzt.
Die Züchtungseinsaat wird dem Fermentationsmedium in einer Menge von etwa 10 Volumenprozent desselben eingeimpft. Die Mischung von Medien wird dann in Anteilen von 20 ml in einzelne 250 ml fassende konische Kolben gegossen. Dem Fermentationsmedium werden verschiedene Mengen von CaI-ciumpantothenat, ^-Alanin oder Coenzym A zugesetzt. Nach Sterilisation unter Druck wird die Züchtung durchgeführt unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30° C. Nach einer Züchtungszeit von 48 Stunden werden dem Medium Adenin und Nicotinamid zugesetzt, um eine Konzentration von 2 mg/ml zu erreichen. Nach einer weiteren Züchtungszeit von 48 Stunden wird in der Kulturflüssigkeit NAD erzeugt. Das NAD wird dann aus der Kulturflüssigkeit durch eine Ionenaustausch-Behandlung gewonnen. Die folgende Tabelle zeigt, welche Mengen NAD erzeugt werden, wenn verschiedene Mengen an CaI-cium-Pantothenat, /?-Alanin oder Coenzym A dem Medium zugesetzt werden. Diese Ergebnisse werden mit dem Fall verglichen, wenn kein Zusatz dieser Verbindungen zum Fermentationsmedium vorliegt.
Die Menge an erzeugten NAD wird in Tabelle 1 wiedergegeben.
Tabelle 1
35
Corynebacterium sp. ATCC 21 084 wird als Einsaatbacterium verwendet. Es wird bei 30° C 24 Stunden lang in einem Züchtungsmedium, das 2% Glucose, 1 % Pepton, 1 % Hefeextrakt, 0,3 % Natriumchlorid und 0,03 mg/1 Biotin enthält, gezüchtet.
Das verwendete Züchtungsmedium hat folgende Zusammensetzung:
100 g Glucose, 6 g Harnstoff,
1OgK2HPO4,
10 g KH2PO4,
10 g MgSO4 · 7H2O,
2 g Fleischextrakt, 0,03 mg Biotin/Liter Züchtungsmedium.
1 ml einer 12%igen Harnstofflösung wird getrennt sterilisiert und zu 19 ml des Fermentationsmediums,
Zusatz zum Grundmedium Menge an
produziertem
NAD (mg/ml)
Kein Zusatz
Calciumpantothenat 12 mg/1
/5-Alanin 7,5 mg/1
Coenzym A 30 mg/1
0,7
2,1
2,0
1,8
Beispiel 2
Dieses Beispiel folgt dem gleichen Arbeitsgang wie Beispiel 1, außer daß der verwendete Mikroorganismus Arthrobacter sp. ATCC 21 085 ist. Die Menge an erzeugtem NAD wird in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Zusatz zum Grundmedium Menge an
produziertem
NAD (mg/ml)
Kein Zusatz
Calciumpantothenat 12 mg/1 .
^-Alanin 7,5 mg/1
Coenzym A 30 mg/1
0,6
2,1
1,6
1,8

Claims (2)

1 2 Bakterium Corynebacterium sp. ATCC 21 084 oder Patentansprüche: das Biotin zum Wachstum erfordernde Bakterium Arthrobacter sp. ATCC 21 085 in dem Nährmedium
1. Verfahren zur Herstellung von Nicotin- in Gegenwart von mindestens einem der Stoffe Panamid-adenin-dinucleotid durch aerobes Züchten 5 tothensäure, ^-Alanin oder Coenzym A züchtet.
von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nähr- Bei dem neuen Fermentationsverfahren wird die
medium bei hierfür üblichen Temperatur- und Menge an NAD durch die Pantothensäure, das
pH-Wert-Bedingungen und durch Gewinnung /?-Alanin bzw. das Coenzym A oder Gemische davon
des Nicotinamid-adenin-dinucleotids mit hierfür gesteigert. Der Mechanismus hierfür ist unbekannt; üblichen Methoden, dadurch gekenn- io die Anwesenheit dieser Verbindungen führt jedoch
zeichnet, daß man das Biotin zum Wachs- zu einem wesentlichen Unterschied hinsichtlich der
turn erfordende Bakterium Cornybacterium sp. erzeugten Menge an NAD, so daß die Wirkung die-
ATCC 21 084 oder das Biotin zum Wachstum ser Verbindungen nicht ein sekundärer Wirkungs-
erfordernde Bakterium Arthrobacter sp. ATCC effekt (etwa als Wachstumsfaktor für den verwen-21085 in dem Nährmedium in Gegenwart von 15 deten Mikroorganismus) ist.
mindestens einem der Stoffe Pantothensäure, Gegenüber dem Verfahren der schweizerischen
/?-Alanin oder Coenzym A züchtet. Patentschrift 408 841 bietet das hier vorgeschlagene
2. Verfahren nach Anspruch!, dadurch ge- Verfahren bedeutende Vorteile.
kennzeichnet, daß man pro Liter des Nährmedi- Nach der bekannten Lehre ist eine Extraktion des
ums die Pantothensäure in einer Menge von etwa 20 NAD aus den Hefezellen erforderlich. Das aus den 0,1 bis 20 mg, das ß-Alanin in einer Menge von Hefezellen extrahierte NAD wird anschließend dem etwa 0,3 bis 30 mg und das Coenzym A in einer erwähnten Reinigungsverfahren unterworfen. Dage-Menge von etwa 1 bis 50 mg einsetzt. gen sammelt sich erfindungsgemäß das NAD in der
Kulturflüssigkeit an und kann daraus auf dem Wege 25 von Ionenaustauscher-Behandlung gewonnen wer-
den. Während sich so ein Produkt mit einer Reinheit
von 98 % erzielen läßt, beträgt diese beim bekannten Verfahren nur 80 bis 90 %.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechni- Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung des erfin-
schen Herstellung von Nicotinamid-adenin-dinucleo- 30 dungsgemäßen Verfahrens setzt man pro Liter des tid (NAD) durch aerobes Züchten von Mikroorganis- Nährmediums die Pantothensäure in einer Menge men in einem wäßrigen Nährmedium bei hierfür üb- von etwa 0,1 bis 20 mg, das /?-Alanin in einer Menge liehen Temperatur- und pH-Wert-Bedingungen und von etwa 0,3 bis 30 mg und das Coenzym A in einer durch Gewinnung des Nicotinamid-adenin-dinucleo- Menge von etwa 1 bis 50 mg ein. tids mit hierfür üblichen Methoden. 35 Das Züchtungsmedium besteht entweder aus
NAD befindet sich in Hefen, Schimmelpilzen, einem synthetischen oder natürlichen Nährmedium, Bakterien usw. NAD spielt in der Biochemie eine das die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum wichtige Rolle, ζ. B. bei der alkoholischen Gärung der verwendeten Mikroorganismen enthält, usw. Ein solches Züchtungsmedium enthält gewöhnlich
Aus der schweizerischen Patentschrift 408 841 ist 40 eine Kohlenstoff quelle, wie Kohlehydrate, sowie anein Verfahren zur Herstellung von Codehydrasel dere einschlägig bekannte Nährstoffe, z.B. eine (NAD) mit hoher Reinheit aus Hefe, wozu in den Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und Beispielen frische Bäckerpreßhefe genannt ist, be- ähnliche, die von den verwendeten Mikroorganismen kannt, bei dem eine wäßrige, Codehydrase I enthal- in spezieller Menge nutzbar gemacht werden, tende Lösung, die durch Extraktion von Hefe erhal- 45 Die Kohlehydrate sind z. B. Glucose, Fructose, ten wurde, speziellen Ionenaustauscherbehandlungen Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat, Mebei speziellen pH-Werten unterworfen wird. In »The lasse u. dgl. Kleine Mengen anderer geeigneter Koh-Journal of Biochemistry« 48. Band (I960), S. 579 bis lenstoffquellen, wie Glycerin, Mannit, Sorbit, organi-583, ist ein ähnliches Verfahren erwähnt, wonach sehe Säuren, Kohlenwasserstoffe usw. können bei der man aus 2 kg frischer Bäckerhefe etwa 500 bis 50 Züchtung zusammen mit den Kohlehydraten verwen-600 mg Codehydrase, entsprechend einer Ausbeute det werden. Die Kohlehydrate können entweder einvon 0,025 bis 0,03 %, bezogen auf das Heferohmate- zein oder in Mischungen von zwei oder mehreren rial, erhalten hat. Diese Verfahren haben den Nach- verwendet werden, desgleichen geringe Mengen anteil einer sehr geringen und daher unbefriedigenden derer Kohlenstoff quellen.
Ausbeute. Außerdem wird das NAD aus den Zellen 55 Die anorganischen Verbindungen, die im Züchgewonnen, was deren Extraktion erfordert. tungsmedium gemäß der vorliegenden Erfindung verAufgabe der Erfindung war die Entwicklung eines wendet werden können, sind anorganische Phosverbesserten biotechnischen Verfahrens zur Herstel- phate, z.B. Kaliumphosphat, Ammoniumphosphat lung von NAD in industriellem Maßstab, welches zu usw. und andere anorganische Stoffe, wie Magnesiumhohen Ausbeuten führt. 60 sulfat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Kalium-Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Her- chlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid usw. Stellung von Nicotinamid-adenin-dinucleotid durch Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem von anorganischen oder organischen Salzen oder wäßrigen Nährmedium bei hierfür üblichen Tempe- Verbindungen verwendet werden, wie z. B. Harnstoff ratur- und pH-Wert-Bedingungen und durch Gewin- 65 oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Amnung des Nicotinamid-adenin-dinucleotids mit hier- moniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosfür üblichen Methoden. Es ist dadurch gekennzeich- phat usw. oder eine oder mehrere Aminosäuren im net, daß man das Biotin zum Wachstum erfordernde Gemisch miteinander, oder natürliche Stickstoff ent-
DE19671642710 1966-07-29 1967-07-28 Biotechnisches verfahren zur herstellung von nicotinamid-adenin-dinucleotid Granted DE1642710B2 (de)

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