DE2037905A1

DE2037905A1 - Vitamin b2 prodn - from yeast pichia guilliermondii

Info

Publication number: DE2037905A1
Application number: DE19702037905
Authority: DE
Inventors: Tadashi Prof. Hiroshima; Nishio Naomichi Tottori; Kamikubo (Japan)
Original assignee: Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha, Osaka (Japan)
Priority date: 1970-07-24
Filing date: 1970-07-24
Publication date: 1972-02-03

Abstract

The yeast Pichia guilliermondii Wickerham or a mutant is cultivated in a culture medium contg. hydrocarbons (pref. 10-18C) as C source so as to accumulate vitamin B2 (as riboflavin, flavine mononucleotide or flavine adenine dinucleotide) in the medium, and recovering the vitamin B2 accumulated. Costs of the process are low (cheap hydrocarbons used as C-source) and yields of vitamin B2 are good. The yeast cells constitute a useful byproduct, since they can be used as a vitamin B2-enriched nutrient for feedstuffs.

Description

Verfahren zur Erzeugung von Vitamin B2 Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Vitamin b2 oder Riboflavin. Method of Producing Vitamin B2 The present invention relates to a process for the production of vitamin b2 or riboflavin.

Vitamin B;2 kann von zahlreiciien Mikroorganismen produziert werden, z.B. von Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen, darunter solchen Schimmelpilzen wie Eremothecium ashbyii und Ashbya gossypii und solche anaeroben Bakterien wie Clostridium butyricum und Clostridium acetobutyricum, die in ausgezeichneter Weise imstande sind, Vitamin B2 zu produzieren, und daher zur industriellen Produktion von Vitamin BS angewendet worden sind. Bei Anwendung dieser Mikro organismen wurden jedoch bischer Vitamin B2 produziert, indem man sie anaerob oder aerob in Züchtungsmedien züchtete, die sauerstof haltige Kohlenhydrate wie Zucker enthielten.Vitamin B; 2 can be produced by numerous microorganisms E.g. from bacteria, yeasts and molds, including such molds as Eremothecium ashbyii and Ashbya gossypii and such anaerobic bacteria as Clostridium butyricum and Clostridium acetobutyricum, which do an excellent job are to produce vitamin B2, and therefore to the industrial production of vitamin BS have been applied. When using these micro-organisms, however, were a little bit more Produces vitamin B2 by growing it anaerobically or aerobically in growing media, which contained oxygenated carbohydrates such as sugar.

Kohlenhydrate wie Dextrose, andere Zucker und Stärke sind Jedoch wichtige Nährstoffe. Die Verwendung solcher Kohlenhydrate ist daher in Anbetracht der steigenden Bevölkerungszahlen und der Nahrungsmittelknappheit keineswegs günstig; die Kosten solcher Kohlenhydrate werden unvermeidlichen erhöht. Die Kosten der Produkte der Fermentationsindustrie, für die diese Kohlenhydrate als Ausgangsmaterialien verwendet werden, erhöhen sich damit auch, Dies trifft beispielsweise für die Erzeugung von Vitamin B0 zu.However, carbohydrates like dextrose, other sugars, and starches are important ones Nutrient. The use of such carbohydrates is therefore increasing in view of the Population numbers and the Food shortages by no means cheap; the cost of such carbohydrates will inevitably increase. The cost of the products the fermentation industry for which these carbohydrates are used as raw materials are used, thus also increase, This applies, for example, to generation of vitamin B0 too.

Vitamin B2 für Arzneimittel und Nährstoffe ist bisher im allgemeinen durch chemische Synthese oder durch enzymatisene Verfahren erzeugt worden; in den USA, in denen Vitamin B2 als Nährstoff für Futtermittel angewendet wird, ist Vitamin 32 jedoch im allgemeinen durch ein Fermentationsverfahren erzeugt worden. Aus allen diesen Gründen ist es erwünscht, andere billige und stabile Kohlenstoffquellen als Kohlenhydrate zu finden, um keine Nahrungsmittel für die Fermentationsveriahren zu verbrauchen, Gemäss der vorliegenden Erfindung wird Vitamin B2 durch Züchtung einer Hefeart, die im Rahmen der Erfindung aus Boden isoliert und als Pichia guilliermondii Wickerham ( Centraalbureau voor Schimmelcultures, Yeast Division, Delft, Julianalaan 67A, Nieder-' lande ) identifiziert worden ist, sowie einer Variation davon unter aeroben Bedingunn in einem Züchtungsmedium unter Verwendung von Erhöl-Kohlenwasserstoffen, die keinene Sauerstoff enthal ten, als Kohlenstoffquelle produziert. Vitamin B2 for medicines and nutrients has been generally used so far produced by chemical synthesis or by enzymatic processes; in the USA, where vitamin B2 is applied as a nutrient for feed, is vitamin However, 32 has generally been produced by a fermentation process. From all For these reasons it is desirable to use cheap and stable carbon sources other than Finding carbohydrates to avoid fermentation foods To consume, According to the present invention, vitamin B2 is obtained by breeding a yeast species isolated from soil within the scope of the invention and called Pichia guilliermondii Wickerham (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Yeast Division, Delft, Julianalaan 67A, Netherlands) has been identified, as well as a variation of it under aerobic conditions in a culture medium using increase hydrocarbons, which do not contain any oxygen are produced as a carbon source.

Es ist bekannt, dass, wenn Hefen auf einem Züchtungsmedium, das Kohlenshydrate enthält, gezüchtet werden, Vitamin B2 in den Hefezellen produziert wird. Verschiedene Mengen an Vitamin EB2 werden durch Züchtung von verschiedenen Arten und Mengen von Hefen produziert, und zwar im Bereich von 37,1 µg/g bei Candida prusei bis zu 101,4 µg/g bei Rhodotorula genus.It is known that when yeasts on a culture medium, the carbon hydrates contains, are grown, vitamin B2 is produced in the yeast cells. Different Amounts of vitamin EB2 are obtained by breeding different types and amounts of Yeasts are produced, ranging from 37.1 µg / g in Candida prusei to 101.4 µg / g for Rhodotorula genus.

Als Als Hefen, die Vitamin B2 durch Fermentationsverfahren unter Ver-Wendung von Erdöl-Kohlenwasserstoffen, welche keinen Sauerstoff enthalten, produzieren, sind andererseits nur Eremothecium ashbyl und die Hefe Pichi miso Mogi bekannt; die Erzeugung von Vitamin B durch Züchtung der erfindungsgemäss isolierten Pichia guilliermondii Wickerham unter Verwendung eines Züchtungsmediums mit Erd-Öl-Kohlenwasserstoffen ist bischer nicht bekannt gewessen.As yeasts, the vitamin B2 by fermentation process under use of petroleum hydrocarbons that do not contain oxygen, on the other hand only Eremothecium ashbyl and the yeast Pichi miso Mogi are known; the production of vitamin B by breeding the Pichia isolated according to the invention guilliermondii Wickerham using a petroleum hydrocarbon growing medium is little known.

Gemäss der Erfindung kann also Vitamin B2 auf vorteilhafte Weise durch Züchtung der bisher noch nicht verwendeten Hefeart Pichia guilliermondii Wickerham produziert werden, und zwar in einem Züchtungsmedium, welches einen Erdöl-Kohlenwasserstoff enthält, der ständig verfügDar und wesentlich billiger als Kohlehydrate ist. Das erfindungsgemässe Züchtungsmedium enthält nach der Fermentation mehr als doppelt soviel Vitamin B2 als bei Verwendung der oben erwähnten Pichia niso l!logi, und die erfindungsgemäss gezüchtete Hefe enthält mehr als fünfmal soviel Vitamin B2 als bei Verwendung von Rhodotorula, mit der bei den bisher verwendeten, Kohlenhydrate enthaltenden Züchtungsmedien die bisher oesten Ergebnisse erzielt wurden. According to the invention, vitamin B2 can therefore be used in an advantageous manner by cultivating the previously unused yeast Pichia guilliermondii Wickerham can be produced in a growing medium which is a petroleum hydrocarbon which is always available and much cheaper than carbohydrates. That The culture medium according to the invention contains more than twice after fermentation as much vitamin B2 as when using the above-mentioned Pichia niso l! logi, and the yeast grown according to the invention contains more than five times as much vitamin B2 than when using Rhodotorula, with the previously used carbohydrates containing culture media the most recent results have been achieved.

Vitamin B2 ( oder Riboflavin ) ist eine gelbliche, kristalline Verbindung mit der chemischen Bezeichnung 6,7-Dirnethyl-9-(11-D ribityl)-isoalloxatin. Ferner sind Riboflavin-5'-phosphorsäure (Flavinmonomukleotid, abgekürzt FMN) mit einer Phosphorsäuregruppe in der 5'-Stellung der Ribitylgruppe und p1-Adenosin-51-p²-riboflavin-5'-pyrophosphorsäure (Farvinadenindinukleotid, abgekürzt FAD) mei einer Adenosingruppe gebunden an das Flavinmononukleotid als Coenzylformen des Vitamins B2 bekannt ( bioaktive Typen). Die Bezeichnung "Vitamin B2" umfasst gemäss der Er-# findung auch die Coenzymformen, und durch geeignete Regelung der # Betriebsbedigungen für das erfindungagemässe Verfahren, kann das Verhältnis der oben angegebenen Formen des Vitamins B2 ad libitum geregelt werden.Vitamin B2 (or riboflavin) is a yellowish, crystalline compound with the chemical name 6,7-dirnethyl-9- (11-D ribityl) -isoalloxatin. Further are riboflavin-5'-phosphoric acid (flavin monomucleotide, abbreviated FMN) with a Phosphoric acid group in the 5'-position of the ribityl group and p1-adenosine-51-p²-riboflavin-5'-pyrophosphoric acid (Farvinadenine dinucleotide, abbreviated to FAD) with an adenosine group attached to the Flavin mononucleotide known as coenzyl forms of vitamin B2 (bioactive types). According to the invention, the term "vitamin B2" also includes the coenzyme forms, and through suitable regulation of the operating conditions for the invention Method, the ratio of the above forms of vitamin B2 can ad libitum be managed.

Alle Arten von Erdöl-Kohlenwasserstoffen können erfindungsgemäss verwendet werden, jedoch sollten vorzugsweise flüssige Kohlenwasserstoffe mit 10 bis 18 Kohlenstoffatomen wie Decan, Undecan, Dodecan, Tridecan, Tetradecan, Pentadecan, Hexadecan, Heptadecan und Octadecan verwendet werden. Sie können einzeln oder im Gemisch verwendet werde. Weiterhin können die erfindungsgemäss angewenaliphatische Kohlenwasserstoffe in einem solchen Masse enthalten, dass die Ziele der Erfindung nicht beeingträchtigt werden.All types of petroleum hydrocarbons can be used in the present invention however, liquid hydrocarbons containing 10 to 18 carbon atoms should preferably be used such as decane, undecane, dodecane, tridecane, tetradecane, pentadecane, hexadecane, heptadecane and octadecane can be used. They can be used individually or in a mixture. Furthermore, the aliphatic hydrocarbons used according to the invention can be used in contain such a mass that the objects of the invention are not impaired will.

Als Kohlenstoffquelle werden für das erfindungsgemässe Züchtungsmedium die obigen kettenförmigen Kohlenwasserstoffe angewendet, ferner werden bekannte Stickstoffquellen, anorganische Materialien usw. hinzugefügt. Als Stickstoffquelle können Ainmoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumdihydrogenphosphat, Harnstoff und Gemische davon und als anorganische Materialien können Kaliumdihydrogenphos phat, Dinatriumhydrogenphosphat und Magnesiumsulfat verwendet werden. As a carbon source for the growth medium according to the invention the above chain hydrocarbons are used, and known ones are also used Nitrogen sources, inorganic materials, etc. added. As a nitrogen source can ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium dihydrogen phosphate, urea and Mixtures of these and as inorganic materials can be potassium dihydrogen phosphate, Disodium hydrogen phosphate and magnesium sulfate can be used.

Weiterhin ist es zur Erhöhung der Ausbeute an Vitamin )2 günstig, dem Züchnurigsmedium Hefeextrakte oder Gasaminosäuren zuzusetzen, Die Ausbeute kann auf diese Weise auf das Doppelte des Wertes erhöht werden, der ohne e eine solche Zugabe erhalten wird, wie in Tabelle 1 gezeigt wird. Furthermore, it is favorable to increase the yield of vitamin) 2, add yeast extracts or gas amino acids to the culture medium, the yield can be in this way can be increased to twice the value without e such Addition is obtained as shown in Table 1.

Der zu dem Züchtungsmedium hinzuzufügende Mengenanteil an Kohlenwasserstoffen betragt vorzugsweise 0,5 bis 12 Gew.-;,; die Sticksstoffverbindung wird vorzugsweise in einer solchen Menge zugesetzt, dass sich ein Verhältnisvon Kohlenstoff zu Stickstoff von 2 bis 20, bezogen auf den obigen Kohlenwasserstoff, ergibt. Die Menge I des oben angegebenen organischen Materials ist recht gering und beträgt gewöhnlich 0,8 bis 1,6 Gew.-% bezogen auf den Kohlenwasserstoff. The proportion of hydrocarbons to be added to the growth medium is preferably 0.5 to 12 wt .-; the nitrogen compound is preferred added in such an amount that there is a ratio of carbon to nitrogen from 2 to 20 based on the above hydrocarbon. The amount I of the organic material given above is quite small and is usually 0.8 up to 1.6% by weight based on the hydrocarbon.

Der pH-Wert des Züchtungsmediums wird auf 4 bis 7, vorzugsweise 6,5 eingestellt, Im Rahmen der Erfindung wurde weiterhin gefunden, dass die Produkt tion von Vitamin B2 durch Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels gefördert werden kann. Als oberflächenaktive Mittel für diese Zwecke haben sich nichtionsche oberflächenaktive Mittel als vorteilhaft erwiessen, und die Menge des oberflächenaktiven Mittels beträgt vorzugsweise 0,01 bis 0,1 Gew.-%. The pH of the culture medium is set to 4 to 7, preferably 6.5 set, In the context of the invention it was also found that the product tion of vitamin B2 can be promoted by adding a surface-active agent can. Surfactants that have proven useful for this purpose are nonionic surfactants Agents found advantageous, and the amount of surfactant is preferably 0.01 to 0.1 wt%.

Bei der Praxis der Erfindung wird Pichia guilliermondii Wickerham in das Züchtungsmedium, das die oben angegebenen Bestandteile enthält, eingeimpft und nerob 5 bis 10 Tage lang bei 25 bis 35°C vorzugsweise im Dunkeln gezüchtet.In the practice of the invention, Pichia guilliermondii becomes Wickerham inoculated into the growth medium containing the above ingredients and nerobically for 5 to 10 days at 25 to 35 ° C preferably in the dark bred.

Die erfindungsgemäss angewendete Hefeart wurde im Rahmen der Errindung aus Boden isoliert und im Hinblick auf die Fähigkeit, Kohlenwasserstoffe zu assimilieren und Vitamin B2 zu produzieren, ausgewählt, und als Pichia guilliermondii Wickerham identifiziert. The yeast type used according to the invention was used in the context of the invention isolated from soil and in terms of the ability to assimilate hydrocarbons and to produce vitamin B2, selected, and as Pichia guilliermondii Wickerham identified.

Die Gattung Piohia besitzt eiförmige oder schlanke Form, und der Ascus wird durch Isogamie oder Heterogamie oder auch parthenogenetisch erzeugt und enthält 1 bis 4 Ascosporen. Die Spore ist # halbkreisförmig oder eckig und hat eine glatte Oberfläche. Bei der Züchtung in Flüssigkeiten wird eine Öberflächenmembran zusammen mit der ausgefällten Masse der liefe gebildet. Die Oxydationswirkung ist hoch, und eine alkoholische Fermentation istselten. The genus Piohia has egg-shaped or slender shape, and the Ascus is produced by isogamy or heterogamy or also parthenogenetically and contains 1 to 4 ascospores. The spore is # semicircular or angular and has a smooth surface. When grown in liquids, a surface membrane is used formed together with the precipitated mass of the run. The oxidizing effect is high, and alcoholic fermentation is rare.

Zahlreiche Hefen, die zur Gattung Pichia gehören, sind isoliert und identifiziert worden, und mehr als 40 Arten davon sind bekannt List of Preserved Microorganisms, erstellt 1963 von Fermentation Research Institute ). Die erfindungsgemäss verwendete Pichia # guilliermondii Wickerham ist eine solche Art. Es können auch sol-! che Variationen der Hefe erfindungsgemäss verwendet werden, die bis zu einem solchen Masse variiert sind, dass die erfindungsgemüsse Wirksamkeit nicht vermindert wird.Numerous yeasts belonging to the genus Pichia are isolated and has been identified, and more than 40 species of which are known to be List of Preserved Microorganisms, created 1963 by Fermentation Research Institute). According to the invention used Pichia # guilliermondii Wickerham is one such species. It can also Sol-! che variations of the yeast according to the invention are used, up to one are varied to such an extent that the effectiveness according to the invention is not reduced will.

Folgendes Züchtungsverfahren wird gemäss der Erfindung durchgeführt: Pichia guilliermondii Wickerham wird in ein Kohlanwasserstoff-Zuchtungsniedium ( das z.B. aus 1,0 g des Kohlenwasserstoffes, 0,50 g Ammoniumnitrat, 0,25 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,25 g Dikaliumhydrogenphosphat, 0,10 g Magnesiumsulfat, 0,05 g Tween 20 und 100 ml Wasser besteht und einen pH-Wert von 4 bis 7 aufweist ) in grossen Reagenzgläsern (mit einem Durchmesser von 22 mm und einer Länge von 200 mm) eingeimpft, und die Hefe wird 5 5 bis 10 Tage lang bei konstanter Temperatur von 25 bis 35° C im Dunkeln unter Schütteln oder mit Belütung gezüchtet. Die Hefe zellen können nach der ZUchtung leicht durch Filtrieren oder Zentrfugieren gewonnen werden, wodurch die Hefe von der Kultur-' flussigkeit abgetrennt werden kann.The following breeding process is carried out according to the invention: Pichia guilliermondii Wickerham is grown in a hydrogen carbonate breeding medium ( the e.g. from 1.0 g of the hydrocarbon, 0.50 g ammonium nitrate, 0.25 g potassium dihydrogen phosphate, 0.25 g dipotassium hydrogen phosphate, 0.10 g magnesium sulfate, 0.05 g Tween 20 and 100 ml of water and has a pH value of 4 to 7) in large test tubes (with a diameter of 22 mm and a length of 200 mm) inoculated, and the Yeast is grown for 5 5 to 10 days at a constant temperature of 25 to 35 ° C in the dark bred with shaking or with aeration. The yeast cells can after breeding can easily be obtained by filtration or centrifugation, which removes the yeast from the culture 'liquid can be separated.

Die so gewonnene Hefe wird getrocknet und als Nährstoff für Futtermittel, die Vitamin 92 enthalten sollen, verwendet. Aus der abgetrennten, konzentrierten, gelben Kulturflüssigkeit kann Vitamin B2 als gereinigte Lösung oder in Form von Kristallen gewonnen werden, und zwar mit Hilfe einer oder einer Kombination der folgenden Arbeitsweisen: Extraktion unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wie Butanol, Ausfällung, wobei das Vitamin B2 mit einem Reduktionsmittel zu einem schwach wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Material reduziert wird, oder Adsorption mit einem Adsorptionsmittel wie Diatomeenerde. The yeast obtained in this way is dried and used as a nutrient for animal feed, which should contain vitamin 92 is used. From the separated, concentrated, yellow culture fluid can contain vitamin B2 as a purified solution or in the form of Crystals can be obtained using one or a combination of the following working methods: Extraction using an organic solvent like butanol, precipitation, whereby the vitamin B2 with a reducing agent to a slightly water-soluble or water-insoluble material is reduced, or adsorption with an adsorbent such as diatomaceous earth.

Vitamin B2 konunt in der Natur in Form des freien Riboflavins, des Flavinmononukleotids und des Flavinadeninnukleotids vor, wobei der Verteilungsgrad urterschiedlich ist. Bei der Produktion von Vitamin B2, durch Züchtung von Mikroorganismen hängt die Verteilung derselben innerhalb und ausserhalb -der Hefe zellen von der Art der Mikroorganismen und den Züchtungsbedingungen ab.Vitamin B2 is common in nature in the form of free riboflavin, des Flavin mononucleotide and the flavin adenine nucleotide, with the degree of distribution is different. In the production of vitamin B2, through cultivation of microorganisms the distribution of the same inside and outside the yeast cells depends on the The type of microorganisms and the growing conditions.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wurde z.B. unter den in Beispiel 8 angegebenen Züchtungsbedigungen Vitamin B2 in einer Menge von 116,7 µg/1 ml der überstehenden Flüssigkeit, do durch Zentrifugieren des Züchtungsproduktes gewonnen w,orden war, oder 521 µg pro 1 g der Hefen produziert. Was die erteilung anbetrifft, sc enthielt die überstehende Flüssigekit 95,7 % des freien Vitamis B2 und 4,3 % Flavinmononukleotid, während die Hefe 85,3 % des freien Vitamins 32, 5,5 % Flavinmononukleotid und 9,2 ,; Flavin-I adeninnukleotid enthielt.In the method according to the invention, for example, among those in Example 8 specified breeding conditions vitamin B2 in an amount of 116.7 µg / 1 ml of the supernatant liquid obtained by centrifuging the cultivation product w, orden war, or 521 µg per 1 g of the yeasts produced. As for the grant, sc contained the supernatant liquid kit 95.7% of the free vitamin B2 and 4.3% Flavin mononucleotide, while yeast 85.3% of free vitamin 32, 5.5% flavin mononucleotide and 9.2,; Flavin-I contained adenine nucleotide.

Da die Komponenten für das erfindungsgemässe Züchtungsmedium fast ausschliesslich billige Kohlenwasserstoffe und anorganische Materialien sind, können die Vitamin B2-Kristalle aus der Fermentationsflüssigkeit bei niedrigen Kosten gewonnen werden, und ausser dem kann die gleichzeitig gewonnene Hefe als mit Vitamin B2 angereicherter Nährstoff i'Ur Futtermittel Verwendung finden.Since the components for the culture medium according to the invention almost are exclusively cheap hydrocarbons and inorganic materials the vitamin B2 crystals are obtained from the fermentation liquid at low cost and the yeast obtained at the same time can be enriched with vitamin B2 Find nutrients in feed use.

Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele erläutort, die jedoch nicht als Einschränkung aufzufassen sind Beispiel 1 Ein Teil einer Bodenprobe, die in der Nähe eine; Tankstelle oder einer petrochemischen Fabrik entkommen wordenwar, wurde in 5 ml eines Züchtungmediums [Kohlenwasserstoff (bestehend aus hauptsächlich 40 - 50 ; n-Tridecan, 30 - 42 " n-Tetradecan und 8 -n-Dodecan ) 7 g, Harnstoff 0,3) g, Dikaliumhydrogenphosphat 0,25g, Magnesiumsulfat 0,1 g, Wasser 100 mi] suspendiert. Der pH-Wert des Züchtungsmediums wurde auf 5,0 eingestellt. Das Gemisch wurde 2 bis 3 Tage lang bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Die gezüchteten Pilze wurden dann 3 Tage lang einer Plattenkultur auf demselben Züchtungsmedium, das 2 % Agar-Agar enthielt, unterworfen, und ausserdem wurden die isolierten Pilze einer mehrfach wiederholten Züchtung auf Platten unterworfen, wodurch die Pilze als Reinkulturen isoliert wurden. Auf diese Weise wurden 63 Pilze, die Kohlenwasserstoffe gut assimilieren, in Reinkultur gewonnen. The invention is further illustrated by the following examples, however, these should not be interpreted as a limitation Example 1 a Part of a soil sample that is near a; Gas station or a petrochemical Was escaped from the factory was dissolved in 5 ml of a growth medium [hydrocarbon (consisting mainly of 40-50; n-tridecane, 30-42 "n-tetradecane and 8 -n-dodecane) 7 g, urea 0.3) g, dipotassium hydrogen phosphate 0.25 g, magnesium sulfate 0.1 g, water 100 ml]. The pH of the culture medium became 5.0 set. The mixture was cultured with shaking at 30 ° C for 2 to 3 days. The cultured mushrooms were then plate-cultured on the same for 3 days Culture medium containing 2% agar-agar, subjected, and also the isolated mushrooms subjected to repeated cultivation on plates, whereby the mushrooms were isolated as pure cultures. In this way, 63 mushrooms were that Assimilate hydrocarbons well, obtained in pure culture.

Beispiel 2 In jeweils ein grosses Reagenzglas mit einem Innendurchmesser von 22 mm und einer Länge von 2000 mm wurden je 10 ml der vier unten angegebenen Arten von Kohlenwasserstoff-Züchtungsmedien A, B, C : una D eingebracht. In jedes der Versuchsröhrchen wurde eine Impfose der in Beispiel 1 isolierten, Kohlenwasserstoffe assimilierenn den Pilzarten eingeimpft, und nachdem die Pilzarten 6 Tage lang bei 270 C im Dunkeln unter Schütteln ( Amplitude 22 nun, 190 Wiederholungen pro Minute) kultiviert worden waren, wurde die Vitamin B2-Produktivität gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass unter den 63 im obtgen Beispiel isolierten Pilzarten 13 Stämme die Fähigkeit zur Produktion von Vitamin B2 bessasen (7 davon waren Hefen), und insbesondere lieferte der Stamm B-11 (temporäre Bezeichnung) ausgezeichnete Ergebnisse, d.h. er produzierte 19,5 µg Vitamin B2/10 ml im Züchtungsmedium A, und 29,0 µg Vitamin B2 pro 10 ml des Züchtungsmediums B. Example 2 In each case a large test tube with an inner diameter of 22 mm and a length of 2000 mm were each 10 ml of the four given below Types of hydrocarbon growing media A, B, C: and D introduced. In each the test tube was an inoculation bottle of the hydrocarbons isolated in Example 1 assimilate the mushroom species inoculated, and after the mushroom species with for 6 days 270 C in the dark with shaking (amplitude 22 now, 190 repetitions per minute) were cultured, vitamin B2 productivity was measured. The results showed that among the 63 species of fungus isolated in the example above, 13 strains the Bessase ability to produce vitamin B2 (7 of which were yeast), and in particular strain B-11 (temporary designation) gave excellent results, i. it produced 19.5 µg vitamin B2 / 10 ml in culture medium A, and 29.0 µg vitamin B2 per 10 ml of growth medium B.

In den Züchtungsmedien C und D wurde bei Verwendung dieses Pilzes eine geringfügige Menge an Vitamin B2 produziert. Der Stamm B-ll wurde nach mikrobiologischen Untersuchungen als Pichia guilllermondii Wickerham identifiziert. Im Beispiel 3 und in den nachfolgenden Beispielen wurden dieser Pilz und das unten angegebene Züchtungsmedium B verwendet. In the cultivation media C and D when using this fungus produces a negligible amount of vitamin B2. The strain B-II was microbiological Investigations identified as Pichia guilllermondii Wickerham. In example 3 and in the examples below, this fungus and that given below were identified Growing medium B used.

Zuchtungmedium A: 1,5 g eines Kohlenwasserstoffgemisches. ( 40-50 n-Tridecan, 50 - 42 ß n-Tetradecan, 8 - 22 # n-Dodecan ), 0,50 g Ammoniumnitrat, 0,25 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,25 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,10 g Magnesiumsulfat, 200,05 g Tween, 0,10 g Hefeextrakt, und 100 ml Wasser; pH = 5-,0 und 7,0. Growing medium A: 1.5 g of a hydrocarbon mixture. (40-50 n-tridecane, 50 - 42 ß n-tetradecane, 8 - 22 # n-dodecane), 0.50 g ammonium nitrate, 0.25 g potassium dihydrogen phosphate, 0.25 g disodium hydrogen phosphate, 0.10 g magnesium sulfate, 200.05 g Tween, 0.10 g yeast extract, and 100 ml water; pH = 5, 0 and 7.0.

Züchtungsmedium B: 1,0 g eines Kohlenwasserstoffgemisches ( 40-50% n-Tridecan, 30 - 42 % n-Tetradecan, 8 - 22 % n-Dodecan ), 0,50 g Ammoniumnitrat, 0,25 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,25 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,10 g Magnesiumsulfat, 200,05 g Tween, und 100 ml Wasser; PH @ 5,0 und 7,0 Züchtungsmedium C: 5 ml eines Kohlenwasserstoffgemisches (40-50 % n-Undenan, 25- 35 % n-Dodecan und 15 - 23 % n-Decan), # 0,38 g Harnstoff, 0,35 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,25 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,05 g Natriumchlorid, 0,10 g Magnesiumsulfat und 100 ml Wasser, Züchtungsmedium D: 3,5 g eines Kohlenwasserstoffgemisches (29% n-Tridecan, 28,1 % n-Tetradecan, 14,4% n-Pentadecan und 12,9 % n-Dodecan ), 0>55 g Ammoniumnitrat, 0,25 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,10 Magnesiumsulfat und 100 ml Wasser; pH = 5,0 und 7,0.Growing medium B: 1.0 g of a hydrocarbon mixture (40-50% n-tridecane, 30-42% n-tetradecane, 8-22% n-dodecane), 0.50 g ammonium nitrate, 0.25 g potassium dihydrogen phosphate, 0.25 g disodium hydrogen phosphate, 0.10 g magnesium sulfate, 200.05 g Tween, and 100 ml water; PH @ 5.0 and 7.0 Culture Medium C: 5 ml of one Hydrocarbon mixture (40-50% n-undenane, 25- 35% n-dodecane and 15-23% n-decane), # 0.38 g urea, 0.35 g potassium dihydrogen phosphate, 0.25 g disodium hydrogen phosphate, 0.05 g sodium chloride, 0.10 g magnesium sulfate and 100 ml water, culture medium D: 3.5 g of a hydrocarbon mixture (29% n-tridecane, 28.1% n-tetradecane, 14.4% n-pentadecane and 12.9% n-dodecane), 0> 55 g ammonium nitrate, 0.25 g potassium dihydrogen phosphate, 0.10 magnesium sulfate and 100 ml water; pH = 5.0 and 7.0.

Beispiel 3 In ein grosses Reagenzglas wurden 100 ml des Züchtungsmediums B gemäss Beisplel 2 eingefüllt, una eine Platindrahtöse von einer Vorratskultur der Hefe Pichia guilliermondii Wickerham wurde eingeimpft. Nachdem die Kultur 48 Stunden lang im Dunkeln bei 270 C geschüttelt worden war, wurden die Hefe zellen durch Zentrifugieren t (3000 x X, 10 Minuten) gewonnen und einmal mit sterilem Wasser waschen das Produkt wurde mit Wasser so verdunr£t, dass die Durch lässigkeit der Zellsuspension sich bei der Messung im Photometer bei 570 mµ zu 14 % ergab, um eine Kultur zum Einimpfen zu erhalten. Ähnliche Untersuchungen wurden durchgeführt unter Verwendung von 0,5 % (Gew.-/Vol) Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumdihydro-# genphosphat, oder Natriumacetat anstelle von Ammoniumnitrat im # Züchtungsmedium B als Stickstoffquelle. Nachdem Jeweils 10 ml des Züchtungsniediums (pH = 6,5) in grosse Reagenzgläser eingebracht und sterilisiert worden waren, wurden Jeweils 0,2 ml der wie oben! hergestellten Zellsuspensionen in das Züchtungsmedium eingeimpft, und nach 8 Tage langem Schütteln der Kulturen bei 270 C irn Dunkeln wurden die Ausbeuten an Hefezellen und Vitamin B2 bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.Example 3 100 ml of the culture medium were placed in a large test tube B filled in according to example 2, una a platinum wire loop from a stock culture the yeast Pichia guilliermondii Wickerham was inoculated. After the culture 48 For hours in the dark at 270 ° C had been shaken the yeast cells obtained by centrifugation t (3000 x X, 10 minutes) and once wash with sterile water the product was so evaporated with water that the Due to the permeability of the cell suspension, measured in the photometer at 570 mµ was 14% to obtain an inoculating culture. Similar research were carried out using 0.5% (w / v) urea, ammonium sulfate, Ammonium dihydrogen phosphate, or sodium acetate instead of ammonium nitrate in the # Cultivation medium B as a nitrogen source. After each 10 ml of the breeding medium (pH = 6.5) were placed in large test tubes and sterilized 0.2 ml each as above! cell suspensions produced in the culture medium inoculated, and after shaking the cultures at 270 ° C. for 8 days in the dark the yields of yeast cells and vitamin B2 were determined. The results are listed in the table below.

Tabelle 1 Einfluss der Stickstof.fqueUen - 1 1 N-Quelle Ausbeute des Pilzes Gesamt-Vitamin B2 (0,56/V-%) (getrocknet) (mg/10 ml) (µg/10 ml) Harnstoff 47,6 0,8 Ammoniumnitrat 55,8 60,9-Ammoniumsulfat 56,0 66,3 Ammoniumdihydrogenphosphat 70,5 70,1 Ammoniumacetat 40,2 0,4 Beispiel 4 Ähnliche Versuche wie in Beispiel 3 wurden mit einer oder zwei Stickstoffquellen durchgeführt, um den Einflüss der Stickstoffquelle zu ermitteln, wenn man die Konzentration der Kohlenwasser-# stoffe im Zilchtungsmedium B auf 5 co, (Gew./Vol) verändert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefassb. Table 1 Influence of the nitrogen source - 1 1 N source yield of the fungus Total vitamin B2 (0.56 / V-%) (dried) (mg / 10 ml) (µg / 10 ml) urea 47.6 0.8 ammonium nitrate 55.8 60.9 ammonium sulfate 56.0 66.3 ammonium dihydrogen phosphate 70.5 70.1 ammonium acetate 40.2 0.4 Example 4 Similar experiments as in Example 3 were performed with one or two nitrogen sources to avoid the influx of the nitrogen source to be determined by looking at the concentration of hydrocarbons in the breeding medium B changed to 5 co, (w / v). The results are summarized in the following table.

Tabelle 2: Einfluss der Stickstoffquellen - 2 N-Quelle Ausbeute der Pilzen Gesamt Vitamin B2 0,5 % (C/V) (getrocknet) (mg/10 ml) (µg/10 ml) Harnstoff 78,0 1,4 Ammoniumnitrat 92,5 69,0 Ammoniumsulfat 86,2 156,3 Ammoniumdihydrogenphosphat 116,1 200,0 1 Ammoniumacetat 83>7 ,7 Ammoniumdihydrogenphosphat und Harnstoff 66,7 275,3 Ammoniumsulfat und Harnstoff 118,8 32,0 Ammoniumsulfat und Ammoniumdihydrogenphosphat 98,1 343,5 In Anbetracht der Ergebnisse der Beispiele 3 und 4 scheint ein Gemisch aus equivalenten Mengen von Ammoniumsulfat und Ammoniumdihydrogenphosphat die geeignetste Stickstoffquelle zu sein. Im folgenden Beispiel wird daher dieses Gemisch als Sti9kstoffquelle verwendet, Beispiel 5 Der Einfluss des ohlenstoff/Stfckstoff-verhältnisses auf die Produktionen von Vitamin B2 wurde durch Veränderung des Kohlenstoff-/Stickstoff-Verhältnisses zu 2, 10 und 20 untersucht, wobei die 2 Konzentration an Kohlenwasserstoffen im Züchtungsmedium B 1, 2,5, 7,5 bzw. 10 % betrug. Als die Konzentration der Kohlenwasserstoff 7,5 % (Gew/Vol) und das Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis 10 betrugen, wurden die besten Ergebnisse hinsichtlich der Produktion von Vitamin B2 erhalten. Diese Bedingungen wurden daher für die folgenden Beispiele angewendet. Table 2: Influence of nitrogen sources - 2 N source yield of the Mushrooms total vitamin B2 0.5% (C / V) (dried) (mg / 10 ml) (µg / 10 ml) urea 78.0 1.4 ammonium nitrate 92.5 69.0 ammonium sulfate 86.2 156.3 ammonium dihydrogen phosphate 116.1 200.0 1 ammonium acetate 83> 7, 7 ammonium dihydrogen phosphate and urea 66.7 275.3 ammonium sulfate and urea 118.8 32.0 ammonium sulfate and ammonium dihydrogen phosphate 98.1 343.5 In view of the results of Examples 3 and 4, it appears to be a mixture the most suitable from equivalent amounts of ammonium sulfate and ammonium dihydrogen phosphate To be a source of nitrogen. In the following example, therefore, this mixture is used as the source of nitrogen used, Example 5 The influence of the carbon / solid ratio on the Vitamin B2 productions were increased by changing the carbon / nitrogen ratio investigated to 2, 10 and 20, with the 2 concentration of hydrocarbons in the Growth medium B was 1, 2.5, 7.5 and 10%, respectively. As the concentration of hydrocarbon 7.5% (w / v) and the carbon / nitrogen ratio was 10, the obtained best results in terms of vitamin B2 production. These conditions were therefore used for the following examples.

8eispiel 6 Der Einfluss der Kohlenstoffquelle wurde mit n-Paraffinen mit 10 bis 18 Kohlenstoffatomen und Gemischen von drei Arten der n-Paraffine untersucht. Unter den angewendeten Versuchsbedingungen war n-Undecan die am wirksamsten von Pichia guilliermondii Wickerham ausgenutzte Kohlenstoffquelle, wobei die Ausbeute an Herei zellen 87,9 mg (trocken) pro 10 ml betrug. Ferner wurden n-Decan, # n-Tridecan und n-Tetradecan ebenfalls gut von der Hefe ausgenutzt Andererseits wurden n-Paraffine mit mehr Kohlenstoffen als n-Hexadecan nicht ausgenutzt. n-Dodecan ergab sogar eine Ausbeute an Vitamin B2 von 621 µg/10 ml. Ein Gemisch aus drei n-Paraffinen wurde ebenfalls gut ausgenutzt. Kohlenwasserstoffe, die im wesentlichen aus 29 % n-Tridecan, 28,1 % n-Tetradecan, 14,4 % n-Pentadecan und 12,9 ; n-Dodecan bestanden, ergaben die höchste Ausbeute an Vitamin B2, nämlich 664 µg/10 ml. Example 6 The influence of the carbon source was with n-paraffins with 10 to 18 carbon atoms and mixtures of three types of n-paraffins. Under the experimental conditions used, n-undecane was the most effective of Pichia guilliermondii Wickerham exploited carbon source, with the yield on Herei cells was 87.9 mg (dry) per 10 ml. In addition, n-decane, # n-tridecane and n-tetradecane also well utilized by yeast. On the other hand, n-paraffins have been used with more carbons than n-hexadecane not used. n-dodecane even gave one Yield of vitamin B2 of 621 µg / 10 ml. A mixture of three n-paraffins was also well used. Hydrocarbons, which essentially consist of 29% n-tridecane, 28.1% n-tetradecane, 14.4% n-pentadecane and 12.9; n-dodecane passed, resulted the highest yield of vitamin B2, namely 664 µg / 10 ml.

Beispiel 7 Gemäss der für die Beispiele 1 bis 6 beschriebenen Arbeitsweise wurden die Ausbeute an Hefezellen und die Wirkung auf die Produktion von Vitamin B2 bei Verwendung der folgenden 10 Arten von oberflächenaktiven Mitteln in Konzentrationen von 0,01, 0,05 und 0,10 % untersucht: Emal-O (Natriumlaurylsulfat, hergestellt von Kao Sekken K.K.), Emanol-3115 (Polyäthylenglykolmonostearat, hergestellt von Kao Sekken X.K.), Nonion 0-6 (Polyäthylenglykol-# monooleat, hergestellt von Nippon Yushi K.K.), Nonion S-6 (Polyäthylenglykolmonostearat, hergestellt von Nippon Yushi K.K.), Nonion ST-221 (Polyoxyäthylensorbitanmonostearat, hergestellt von Katayama Kagaku K.K.), Tween 20 (Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat, hergestellt von Katayama Kagaku K.K.), Tween 60 (Polyoxyäthylensorbitanmonostearat, , hergestellt von Katayama Kagaku K.K.), Nymine S-215 (Polyoxyäthylenalkylamin, hergestellt von Nippon Yushi K.K.), Cation PB-40 (Polymityltrimethylammoniumchlorid, hergestellt von Nippon Yushi K.K.), und CTAC (Cetyltrimethylammoniumchlorid, hergestellt von Tokyo Kasei K.K.).Example 7 According to the procedure described for Examples 1 to 6 were the yeast cell yield and the effect on vitamin production B2 using the following 10 types of surfactants in concentrations of 0.01, 0.05 and 0.10%: Emal-O (sodium lauryl sulfate, manufactured by Kao Sekken K.K.), Emanol-3115 (polyethylene glycol monostearate, manufactured by Kao Sekken X.K.), Nonion 0-6 (polyethylene glycol monooleate, manufactured by Nippon Yushi K.K.), Nonion S-6 (polyethylene glycol monostearate, manufactured by Nippon Yushi K.K.), Nonion ST-221 (polyoxyethylene sorbitan monostearate, manufactured by Katayama Kagaku K.K.), Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate, manufactured by Katayama Kagaku K.K.), Tween 60 (polyoxyethylene sorbitan monostearate, manufactured by Katayama Kagaku K.K.), Nymine S-215 (polyoxyethylene alkylamine, manufactured by Nippon Yushi K.K.), Cation PB-40 (Polymityltrimethylammonium chloride, manufactured by Nippon Yushi K.K.), and CTAC (cetyltrimethylammonium chloride, manufactured by Tokyo Kasei K.K.).

Die Ergebnisse zeigten, dass die optimalen Ergebnisse erhalten wurden, wenn die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels i 0,0 % betrug und eines der Mittel Nonion ST-221, Tween 20 oder Tween 60 verwendet wurde Die Ausbeuten an Vitamin B2 betrugen 720, 605 bzw. 1108 µg/ml.The results showed that the optimal results were obtained when the concentration of the surfactant i was 0.0% and one of the Means Nonion ST-221, Tween 20 or Tween 60 was used The yields of vitamin B2 were 720, 605 and 1108 µg / ml, respectively.

Beispiel 6 Entpsrechend den in den Beispielen 1 bis 7 erhaltenen Ergebnissen I wurde die Züchtung unter Verwendung eines Mediums durchgeführt, das aus 7,5 g Kohlenwasserstoffen (29 % n-Tridecan, 28,1 % n-Tetradecan. 14,4 % n-Pentadecan, und 12,9 % n-Dodecan), 0,375 g Ammoniumsulfat, 0,375 g ammoniumdihydrogenphosphat, 0,25 g Dikaliumdihydrogenphosphat, 0,25 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,05 g Tween 60 und 100 ml Wasser bestand; pH = 6,5. Example 6 Corresponding to those obtained in Examples 1 to 7 Results I, cultivation was carried out using a medium which from 7.5 g hydrocarbons (29% n-tridecane, 28.1% n-tetradecane. 14.4% n-pentadecane, and 12.9% n-dodecane), 0.375 g ammonium sulfate, 0.375 g ammonium dihydrogen phosphate, 0.25 g dipotassium dihydrogen phosphate, 0.25 g potassium dihydrogen phosphate, 0.1 g magnesium sulfate, Consisted of 0.05 g of Tween 60 and 100 ml of water; pH = 6.5.

D.h., eine Subkultur wurde in dem Züchtungsmedium durchgeführt, um eine Zellsuspension zum Einimpfen zu gewinnen, die dann wie im Beispiel 3 eingeimpft und gezüchtet wurde. Anschliessend wurde die tiberstehende Flüssigkeit untersucht.That is, subculture was carried out in the culture medium to to obtain a cell suspension for inoculation, which is then inoculated as in Example 3 and was bred. The supernatant liquid was then examined.

Die Ergebnisse zeigten, dass 116,7 ,ig/ml und 52l,u/ml an Vltamin B2 in der Überstehend Flüssigkeit biw. in den Hefezellen gebildet worden waren, wobei im ersten Falls 95,7 % Vitamin B2 und 4,3 % Flavinmononukleotid und im letzteren Falle 85,3 % Vitamin B2, 5,5 Flavinmononukleotid und 9,2 % Flavinadenindinukleotid erhalten wurden. The results showed that 116.7 ig / ml and 52l, u / ml of Vltamin B2 in the supernatant liquid biw. were formed in the yeast cells, with 95.7% vitamin B2 and 4.3% flavin mononucleotide in the first case and in the latter Trap 85.3% vitamin B2, 5.5% flavin mononucleotide and 9.2% flavin adenine dinucleotide were obtained.

Beispiel 9 In den Beispielen 1 bis 8 waren die Versuche in grossen Reagenzgläsern durchgeführt worden. Für dieses Beispiel wurde ein Sakaguchi-Kolben für Schüttelkulturen mit einem Fassungsvermögen von 500 ml (100 ml eines Mediums) verwendet. Ein Grundmedium, enthaltend 7,5 g Kohlenwasserstoffe, 0,375 g Ammoniumdihydrogenphosphat, 0,375 g Ammoniumsulfat, 0,25 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,25 g Dikaliumhydrogenphosphat, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,05 g Tween 60 und 100 ml Leitungswasser, wurde verwendet. Der pH-Wert wurde auf 6,5 eingestellt. Example 9 In Examples 1 to 8, the experiments were large Test tubes have been carried out. For this example, a Sakaguchi flask was used for shaking cultures with a capacity of 500 ml (100 ml of a medium) used. A basic medium containing 7.5 g hydrocarbons, 0.375 g ammonium dihydrogen phosphate, 0.375 g ammonium sulfate, 0.25 g potassium dihydrogen phosphate, 0.25 g dipotassium hydrogen phosphate, 0.1 g magnesium sulfate, 0.05 g Tween 60 and 100 ml tap water, was used. The pH was adjusted to 6.5.

Die Züchtung wurde in grossen Reagenzgläsern durchgeführt ( 10 ml Medium). Eine vorbereitete Züchtung wurde zwei Tage lai,ig durchgeführt. Nach dem Zentrifugieren wurde das Medium in sterilem Wasser suspendiert,tie Durchlässigkeit auf 14 ç eingestellt, und 2 ß (Vol/Vol) der Hefe wunden eingeimpft. Die Züchtung wurde unter Schütteln (115 Bewegungen pro Minute) und unter Verwendung eines Sakaguchi-Kolbens von 500 ml Inhalt für Schüttelkulturen durchgeführt.The cultivation was carried out in large test tubes (10 ml Medium). Prepared cultivation was carried out for two days. After this Centrifugation, the medium was suspended in sterile water, low permeability adjusted to 14 ç, and 2 ß (vol / vol) of the yeast sore inoculated. Breeding was done with shaking (115 movements per minute) and using a Sakaguchi flask of 500 ml content for shake cultures.

Die Ergebnisse: 1) Zeitmässiger Verlauf der Vitamin B2-Produktion: Fig. 1 zeigt den Zeitverlauf der Vitamin B2-Produktion (in Tagen) bei ZUchtung in einem Sakaguchi-Koiben von 500 ml Inhalt für Schüttelkulturen. The results: 1) Temporal course of vitamin B2 production: Fig. 1 shows the time course of vitamin B2 production (in days) in the case of breeding in a Sakaguchi Koiben of 500 ml for shaking cultures.

Die Vermehrunf erreicht ein konstantes Stadium etwa vom 6. The increase reaches a constant stage from about the 6th

Tage an. Days on.

Die Bildung von Vitamin B2 erreicht ihr Maximum andererseits etwa am 10. Tag. On the other hand, the formation of vitamin B2 reaches its maximum on the 10th day.

2) Wirkung einer natürlichen Nährstoffquelle, Die erfindungsgernse Hefe schien keine organische Nährstoffquelle zu benötigen. In der Hoffnung, gute Ergebnisse hinsichtlich der Vermehrung der Hefe und der Produktion von VitamEn B2 zu erzielen, wurden Jedoch Untersuchungen durchgeführt um die Wirkung der Zugabe von organischen Nährstoffquellen zu ermitteln. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Die 5 verwendeten Arten von Nahrstoffquellen besassen sämtlich ein gute Wirkung auf die Vermehrung. Der Zusatz von 100 mg Casami nosäure pro 100 ml hatte einen günstigen Einfluss auf die -Bildung von Vitamin B2. 2) Effect of a natural source of nutrients, the invention Yeast did not seem to need an organic source of nutrients. Hoping good Results regarding yeast reproduction and the production of VitamEn B2 However, studies have been made on the effect of the addition of organic nutrient sources. The results are in table 3 shown. The 5 kinds of nutrient sources used all had a good one Effect on reproduction. The addition of 100 mg casamino acid per 100 ml had a favorable influence on the formation of vitamin B2.

Tabelle 3: Wirkung von natürlichen Nährstoffen auf das Wachstum und die Produktion von Vitamin B2 durch Pichia guilliermondii Wickersam Natürlicher Zugesetzt Menge pH der Hähr Zellausbeute Vit. B2 produ- Vit.B2 produ-Näherstoff lösung (g/Trocken- ziert in der ziert in den (mg/100 ml) gewicht/1) überstehenden Zellen Flüssigkeit (µg/g tr. Table 3: Effect of natural nutrients on growth and the production of vitamin B2 by Pichia guilliermondii Wickersam natural Added amount of pH of the Hähr cell yield Vit. B2 produ- Vit.B2 produ-nutrient solution (g / dry - adorned in the adorned in the (mg / 100 ml) weight / 1) supernatant Cell fluid (µg / g dry matter)

(mg/l) Zellen) Hefeextrakt 10 2,50 7,58 114,87 41,6 50 2,59 7,89 736,96 33,3 100 2,65 8,10 200,00 9,4 Casaminosäure 10 2,50 7,66 105,00 10,8 50 2,43 7,57 252,00 18,1 100 2,60 7,29 280,50 51,4 Polypepton 10 2,60 7,41 91,00 14,6 50 2,49 8,46 172,62 12,3 100 2,57 8,63 80,00 9,0 Malzextrakt 10 2,50 7,10 86,70 4,5 50 2,50 7,41 84,00 16,2 100 2,50 7,38 105,00 11,0 Fleischextrakt 1 2,30 7,54 103,20 17,8 10 2,42 7,74 126,00 7,6 ohne - 2,50 7,14 150,00 108,5 Die Züchtung wurde in einem Sakaguchi-Kolben bei 115 Bewegungen pro Minute 10 Tage lang durchgeführt; ein Kohlenwasserstoffgemisch wurde als Kohlenstoffquelle verwendet. (mg / l) cells) yeast extract 10 2.50 7.58 114.87 41.6 50 2.59 7.89 736.96 33.3 100 2.65 8.10 200.00 9.4 Casamino acid 10 2.50 7.66 105.00 10.8 50 2.43 7.57 252.00 18.1 100 2.60 7.29 280.50 51.4 Polypeptone 10 2.60 7.41 91.00 14.6 50 2.49 8.46 172.62 12.3 100 2.57 8.63 80.00 9.0 Malt extract 10 2.50 7.10 86.70 4.5 50 2.50 7.41 84.00 16.2 100 2.50 7.38 105.00 11.0 Meat extract 1 2.30 7.54 103.20 17.8 10 2.42 7.74 126.00 7.6 without - 2.50 7.14 150.00 108.5 The cultivation was carried out in performed a Sakaguchi flask at 115 strokes per minute for 10 days; a hydrocarbon mixture was used as the carbon source.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

1. A method for producing vitamin B2, characterized in that that you have a microorganism strain, the Pichia guilliermondii Wickerham or a Variation of this may be in a culture medium that uses hydrocarbons as Contains carbon source, grows to enrich vitamin B2 in the medium, and that one wins the so enriched vitamin 32.

. 2. The method according to claim 1, characterized in that 0.5 to 12% by weight of the hydrocarbons can be used as the carbon source.

3. The method according to claim 1, characterized in that as a carbon source liquid hydrocarbon having 10 to 18 carbon atoms can be used.

4. The method according to claim 3, characterized in that as a liquid Hydrocarbons chain hydrocarbons are used.

5. The method according to claim 1, characterized in that the hydrocarbons may contain aromatic hydrocarbons.

6. 6. The method according to claim 1, characterized in that a Nitrogen source used in a carbon / nitrogen ratio of 2 to 20 will.

7. The method according to claim 6, characterized in that the nitrogen source one of the compounds ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium dihyrogenic phosphate, Is urea or a mixture thereof.

8. The method according to claim 1, characterized in that an inorganic Material is added to the hydrocarbon medium in an amount of 0.8 to 1.6 weight percent will.

9. The method according to claim 8, characterized in that the inorganic Material potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate and 4; nesium sulfate be used.

10. The method according to claim 1, characterized in that a surface-active Funds is used.

11. The method according to claim 10, characterized in that the surface-active Agent is a nonionic surfactant.

12. The method according to claim 10, characterized in that the surfactant is used in an amount of from 0.01 to 0.10% by weight.

13. The method according to claim 1, characterized in that a natural Nutrient is added to the medium.

14. Method 13, characterized in that the natural nutrient Is casamino acid or a yeast extract.

15. The method according to claim 1, characterized in that the ZüchtunL at 25 to 35 C for 5 to 10 days.

16. The method according to claim 1, characterized in that the cultivation carried out in the dark by shaking the growth medium with aeration.

17 The method according to claim 1, characterized in that 'the extraction of the vitamin B2 produced by extraction with an organic solvent is carried out.

18. Verfanren according to Claim 1, characterized in that the Obtaining the produced vitamin B2 is carried out by precipitation, wherein the product is reduced with a reducing agent to a reduced form of the To precipitate vitamin B2.

19. The method according to claim 1, characterized in that the to the extraction of the produced vitamin D2 by means of an adsorption process Use of an adsorbent is carried out.

20. The method according to claim 19, characterized in that the Adsorbent is diatomaceous earth.

L e r s e i t e