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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fruktose durch Isomerisieren von Glukose. Insbesondere wird durch die Erfindung ein Verfahren der vorstehend angegebenen Art geschaffen, bei dem eine Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung eingesetzt wird, in der mindestens ein Teil des Glukoisomerase-Enzyms extrazellularen Ursprungs ist.
Das Isomerisieren von Glukose zu Fruktose durch die Einwirkung von wässerigem Alkali ist schonseit langem bekannnt. Solche Katalysatoren, wie z. B Natriumhydroxyd, Natriumcarbonat, Kalziumhydroxyd, Erdalka- licarbonate, Alkaliionenaustauscher, Ammoniak, Pyridin usw., wurden zum Isomerisieren von Glukose benutzt. DieAusbeute an hiebei gebildeter Fruktose beläuft sich jedoch höchstens auf 20 bis 3ífF/a d. Th., wodurch dieses Verfahren unwirtschaftlich wird. Ferner kann die allenfalls erwünschte Isolierung von Fruktose aus dem Reaktiongemisch nur mit grosser Schwierigkeit und mit beträchtlichen Verlusten durchgeführt werden.
Bei Versuchen zur Verbesserung dieses Verfahrens wurde eine Anzahl von Isomerisierungsverfahren vorge schlagen, welche auf der Wirkung von Enzymen beruhten. Diese Vorschläge waren als für die Technik unbrauchbar befunden worden, weil folgende Nachteile vorhanden waren : schlechte Ausbeute, langsame Reaktion, Schwierigkeiten bei der gewünschten Enzymzubereitung, die Unmöglichkeit, den Fruktosebestandteil als solchen zu gewinnen, u. a.
Insbesondere waren derartige Enzymverfahren bisher an die Verwendung von intrazellularen Enzymsystemen
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aber zeitraubend und mitunter schwierig durchzuführen und verursacht merklich erhöhte Produktionskosten.
Es erschien daher aussichtsreich zu versuchen, bei der Herstellung von Fruktose eine Glukoisomerase-Zubereitung anzuwenden, welche einen hohen Grad an extrazellularer Enzymaktivität aufweist. Wenn eine solche Zubereitung auch noch ohne die zusätzliche lästige Stufe der Zellaufbrechung erhalten werden könnte, würde dies einen beträchtlichen technischen Fortschritt für die Herstellung von Fruktose darstellen.
Eine Enzymzubereitung mit hohem extrazellularen Gehalt ist aus verschiedenen Gründen anzustreben ; So ist allgemein bekannt, dass intrazellulare Enzyme ihre spezifischen Wirkungen langsamer ausüben als die extrazellularen. Extrazellulares Enzymmaterial wird allgemein sowohl zur Erzielung eines höheren Isomerisierungsgrades als auch zur Gewinnung höherer prozentueller Ausbeuten in kürzerer Zeit gegenüber intrazellularen Medien für wirksamer gehalten. Bis jetzt jedoch wurde noch keine Glukoisomerase-Zubereitung gefunden, in wel cher das Enzym ausschliesslich im extrazellularen Zustand vorliegt oder auch nur eine Zubereitung, welche einen beachtlichen Teil an extrazellularer Enzymaktivität zusätzlich zur intrazellularen aufgewiesen hätte.
Die Erfindung ermöglicht es, das Isomerisieren von Glukose zu Fruktose mittels einer Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung auszuführen, welche einen hohen Grad an extrazellularer Aktivität aufweist.
Beim erfindungsgemässen Verfahren können sogar Glukoisomerase-Zubereitungen hergestellt und beim Isome- risieren von Fruktose eingesetzt werden, welche ihre Enzymaktivität nur im extrazellularen Anteil der Kulturflüssigkeit enthalten, d. h. dass die Kulturflüssigkeit ohne die Zellenreste zum Einsatz gelangt.
Die Erfindung ermöglicht es ferner, dass das zu Fruktose führende Isomerisierungsverfahren dem Arbeiten mit hohen Konzentrationen an Glukosesubstrat angepasst werden kann und auch ausgezeichnete Ausbeuten an Fruktose in verhältnismässig kurzen Zeiten liefert.
Ausserdem gestattet es das erfindungsgemässe Glukoisomerisierungsverfahren, Fruktose in Mengen zu erzeu gen, welche an durch Gleichgewichtsbedingungen bestimmte theoretische Grenzen heranreichen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Fruktose durch Isomerisieren von Glukose besteht in seinem Wesen darin, dass man eine Glukoisomerase-Zubereitung durch Züchten einer Streptomycesart, die imstande ist, dieses Enzym bei extrazellularer Enzymaktivität zu erzeugen, in einem eine geeignete Kohlenstoff quelle enthaltenden Kulturmedium herstellt, gegebenenfalls die flüssige Phase von den Zellen abtrennt und dass man Glukose der Einwirkung der gesamten Enzym-Zubereitung oder einer aus den abgetrennten Teilen gewonne- nen Zubereitung unterwirft.
Die die extrazellulareEnzymaktivität enthaltende Flüssigkeit kann von denZellresten durch Filtration oder andere einfache Methoden leicht abgebaut werden. Um weite Aktivität aus den Zellen freizumachen und extrazellular anzureichern, muss man die Zellwände durch physikalische oder chemische Methoden zerreissen.
Besonders bevorzugte Spezies unter den Streptomycesarten sind Streptomyces venezuelae und Streptomy ces olivochromogenes. Kulturen von einem Stamm jeder dieser Organismen wurden in der American Type Cul- tureCollection von Mikroorganismen niedergelegt. Sie haben die folgenden Bezeichnungen erhalten : Streptomyces venezuelae = ATCC Nr. 21113 ; Streptomyces olivochromogenes =ATCC Nr. 21114. Diese Stämme erzeugen Glukoisomerase, welche zum grossen Teil extrazellular vorliegt, wie dies bisher noch nicht bekannt war.
Das gewünschte Enzym wird in der üblichen Weise hergestellt. Ein Impfmaterial, hergestellt beispielsweise auf einemAgar-Substrat, wird zum Impfen eines Kolbens benutzt, welcher ein geeignetes Nährmedium enthält.
So wird z. B. eine Kultur, welche einen geeigneten Streptomyces-Stamm enthält, dazu verwendet, ein Substrat zu impfen, welches eine geeignete Kohlenstoffquelle enthält. Hier lässt man den Organismus wachsen, wobei das gewünschte Enzym erzeugt wird. Die Inkubationszeit kann über einen weiten Zeitbereich, inAbhän-
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gigkeit von der Art des Mikroorganismus und dem benutzten Kulturmedium, schwanken. Im allgemeinen wird die Inkubationszeit etwa 4 bis48 h dauern. Üblicherweise wird nur ein aliquoter Teil oder die gesamte Organs- musmasse dann dazu benutzt, ein grösseres Volumen an Nährstoff zu impfen. Dies kann ein oder mehrere Male wiederholt werden.
Die Endkultur wird, mit oder ohne Reinigungsverfahren, weiterverwendet, um die Isomerisierung von Glukose zu Fruktose durchzuführen.
So kann man das gesamte Medium unmittelbar als Glukoisomerase-Zubereitung verwenden oder das Me- dium kann filtriert oder in anderer Weise behandelt werden. Das Filtrat oder Zentrifugat enthält gewöhnlich die extrazellulare Enzymzubereitung, welche dann unmittelbar verwendet oder noch weiter durch eineAnzahl bekannter Verfahren gereinigt werden kann. In gleicher Weise kann die intrazellulare Fraktion, welche übli- cherweise als eine feste Zellmasse zurückbleibt, entweder verworfen oder getrennt in der Glukoisomerisierungs- stufe benutzt werden. Aus wirtschaftlichen Gründen verwendet man normalerweise das gesamte Medium ohne weitere Trennung, wenn die Isomerisierung von Glukose zu Fruktose in grosstechnischem Massstab ausgeführt werden soll.
Man kann 2ffl/o der gesamten Glukoisomeraseaktivität bis zu etwa 60go oder sogar noch mehr der extrazel- lularen Aktivität zuordnen. Es sind jedoch nicht alle Streptomycesarten oder-Stämme in dieser Weise aktiv.
Die Erfindung soll aber trotzdem nicht auf die Verwendung eines besonderen Organismus oder Mikroorganismus beschränkt sein. Erkannt wurde dieF higkeit von speziellen Streptomyceserganismen, eine Enzymzubereitung zu erzeugen, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens einen beachtlichen Teil der Enzymaktivität extrazellular enthält. Wie bereits erwähnt, waren solche Enzymzubereitungen bisher unbekannt.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine besonders geeignete Kohlenstoffquel- le oder ein Nährstoff zur Züchtung der Streptomycesart benutzt. Diese Kohlenstoffquelle ist Stärke und Xylose lieferndes Material, z. B. eine Mischung aus Xylose und Stärke, welche als einzige Kohlenstoffquelle oder in
Kombination mit einer Vielzahl von andern Kohlenstoffquellen, wie z. B. Mannit, Glukonsäure, Galaktose, Glycerin, Sorbit, Glukose und andern reinen oder unreinen Quellen von Kohlenhydraten, verwendet werden kann. Diese Mischung aus Xylose und Stärke ist als ein Ganzes besser als Kulturmedium geeignet als einer der beiden Bestandteile in gleicher Menge. Die Nährstoffmischung erzeugt insbesondere eine aktivere Enzymzubereitung als Xylose, welche in grossem Umfang als Kohlenstoffquelle bei der Herstellung von Glukoisomerase benutzt wurde.
Auch Stärke allein ist als Kohlenstoffquelle weniger geeignet.
DerStärkenährstoff, welcher bei der Herstellung derGlukoisomerase-Zubereitung imRahmen des erfindungsgemässen Verfahrens benutzt werden kann, kann aus einer beliebigen pflanzlichen Quelle stammen, z. B. Mais, Weizen, Kartoffel, Tapioca, Reis, Sago und Sorghumkorn. Wachsstärken können ebenfalls verwendet werden. Die Bezeichnung "Stärke" wird hier ganz allgemein gebraucht und umfasst unmodifizierte Stärke und Rückstände sowie auch Stärke, welche durch Behandlung mit Säuren, Alkali, Enzymen oder Oxydationsmitteln modifiziert wurde. Lösliche oder teillösliche modifizierte Stärken, Dextrine, vorgelatinierte Produkte und Stärkederivate, z. B. gewisse kationische, anionische und nichtionische Stärkederivate, sind ebenfalls verwendbar. Typische hier brauchbare Stärken sind Mais- und Kartoffelstärke.
DerXyloseanteil des Materials kann Xylose selbst sein oder auch ihre nativen Formen, welche in den Zellwänden von fast allen Pflanzen in der Form von Xylanpolymeren vorkommen, die Xylosezucker als Hauptbestand- teilenthalten. Somit kann Xylose benutzt werden, so wie sie in unreiner Form in Stroh, Spreu, Holz, Maiskol- ben. Weizenkleie u. dgl., zugegenist. Üblicherweise werden die erwähnten oder andere Materialien mit Alkali behandelt, um die Hemizellulose aus den verschiedenen Abfallmaterialien, die als Medien benutzt werden, zu entfernen. Um die Monosaccharidxylose zu erhalten, wird die Hemizellulose üblicherweise hydrolysiert.
Somit soll unter dem hier verwendetenAusdruck"Xylose"verstanden werden, dass er sowohl das reine Material wie auch die unreinen, dieses Kohlenhydrat enthaltenden Quellen einschliesst.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Herstellung der Glukoisomerase-Zubereitung ist die Kohlenstoffmischung üblicherweise aus 25 bis 75% Stärke und 25 bis 751o Xylose, bezogen nur auf das gesamte Mischungsgewicht der Kohlenstoffquelle, zusammengesetzt. In anderer Weise ausgedrückt umfasst die Xylose und Stärke enthaltende Kohlenstoffquelle üblicherweise 0, 2 bis 10 und öfters 0, 5 bis 2 Gew.- des Kulturmediums.
Bei einer andern Ausführungsform der Erfindung enthält ein besonders erwünschtes Kulturmedium auch Maiseinweichwasser als Proteinquelle. Diese Kombination zusätzlich zu der vorstehend beschriebenen Mischungaus Xylose und Stärke als Kohlenstoffquelle ist besonders vorteilhaft. Üblicherweise macht die Maiseinweichflüssigkeit, angesetzt aus verschiedenen Aminosäuren, 0, 1 bis 5, 0 Gew.- ) des Kulturmediums aus.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäss eingesetzten Glukoisomerase-Zubereitung können das Impfmedium und die nachfolgendenZellwachstumsmedien zusätzlich zu den oben beschriebenen oder andern Kohlenstoffquellen gewünschtenfalls eine geeignete Stickstoffquelle, anorganische Salze, z. B. Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat usw., und andere Materialien enthalten. Üblicherweise wird die Kultur, z. B. Streptomyces venezuelae, bei einem PH im Bereich von etwa 7 bis etwa 9 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 400C gezüchtet.
Die Isomerisierung von Glukose zu Fruktose hängt von den Bedingungen ab, wie z. B. der Konzentration an
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Glukose, der Temperatur, der An- oder Abwesenheit anderer Enzymcofaktoren u. dgl., Sie kann im Hinblick auf die Zeit und Fruktoseausbeuten schwanken. Angemessene Ausbeuten werden üblicherweise innerhalb etwa 1 bis 36 h erhalten. Während dieser Stufe kann die Temperatur Raumtemperatur sein oder auf etwa 50 bis 70 C gesteigert werden. Üblicherweise wird der pH-Wert des der Isomerisierung unterworfenen Glukosesystems durch Verwendung geeigneter Puffersysteme, z. B. eines Phosphatpuffers, auf etwa 7 bis 9 eingestellt. Andere Aktivatoren, z. B. Magnesium-oder Manganionen, können auch anwesend sein.
Es kann mitunter möglich sein, Nebenreaktionen durch Zusatz von Inhibitoren, beispielsweise durchAnwendung vonNatriumarsenat, Natriumarsenit und Natriumfluorid, auf einem Mindestmass zu halten. Es wurde festgestellt, dass die Enzymaktivität durch Verwendung eines Enzymcofaktors, wie z. B. Kobalt in Form von Kobaltchlorid, auf ein Maximum erhöht werden kann.
Die Glukose selbst ist üblicherweise eine konzentrierte Lösung. Ausgezeichnete Ergebnisse wurden erhal-
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ebenso wie übersättigte Lösungen isomerisiert werden.
In den folgenden Beispielen sind Teile und Prozente als Gew.-Teile und Gew.-Prozente zu verstehen.
Beispiel l : Extrazellulare Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen wurden aus zwei Spezies, nämlich S. venezuelae ATCC Nr. 21113 und S. olivochromogenes ATCC Nr. 21114, hergestellt und die Enzymzubereitungen wurden zum Isomerisieren von Glukose-Mustern verwendet.
Das bei diesem Versuch benutzte Kulturmedium hatte folgende Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Xylose <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> löslich <SEP> gemachte
<tb> Kartoffelstärke <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Pepton <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Fleischextrakt <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g
<tb> Kobaltchlorid <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g
<tb>
Der PH-Wert des Kulturmediums wurde vor der Impfung auf etwa 7, 0 eingestellt.
Nach dem Sterilisieren und Abkühlen auf 250C wurden 100 ml Proben des vorstehenden Xylose-Stärke-Mediums mit der vorstehend erwähnten Spezies beimpft. Die Beimpfungen wurden in spezifischer Weise durch Beimpfen des Mediums mit drei Ösen voll an Zellen aus Xylose-Stärke-Agarztichtung durchgeführt. Nach 48stün- diger Inkubation bei28 C auf einem Shaker zum Lüften der Kultur wurden Zellen durch Zentrifugieren des Kulturmediums mit10 000 Umdr/min während 10 min geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit 0, 85%oigerSalzlö- sung gewaschen und in 5 ml von 0, 05 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7, 5) suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann in einem wassergekühlten Schalloszillator während 20 min bei j.
O KC behandelt und dann nochmals mit 12000 Umdr/min während 30 min geschleudert. Die überstehende Flüssigkeit wurde als eine Rohquelle von intrazellularer Glukoisomerase-Enzym-Lösung verwendet.
Rohe extrazellulare Glukoisomerase wurde hergestellt durch Aussalzen von 50 ml Kulturzentrifugatmittels Ammoniumsulfat von 60% Sättigung. Nach dem Zentrifugieren wurde die partiell gereinigte extrazellulare Enzymlösung erhalten durch Auflösen der Ausfällung in 4 ml von 0, 05 molarer Phosphatpufferlösung (PH 7, 5) und Dialysieren der Lösung gegen den Puffer während eines Tages bei 5 C.
Die Isomerisierung selbst wurde durchgeführt durch Zubereitung einer 1, 6 molaren wässerigen Lösung von Glukose, welche auch 0, 05 molaren Phosphatpuffer, 0, 2 molares Magnesiumsulfat und 0,05 molares Kobaltchlorid enthielt. 2 ml der oben erwähnten Enzymlösungen wurden zu 2 ml der Glukoselösung zugesetzt.
Nach einer Inkubation von 3 h bei 600C wurden 0, 5 ml der Reaktionsmischung abgezogen in 4, 5 ml von 0, 5n-Perchlorsäurelösung. Die Menge an in dem aliquoten Teil gebildeter Fruktose wurde nach der CysteinCarbazol-Methode bestimmt, wiesieinJ. Biol. Chem., 192 [ 1951]. S. S83, beschrieben ist. In diesem Test wurde Farbintensität während 10 min bei 600C nach dem Zusatz der Reagenzien entwickelt. Die Intensität wurde dann in einem Spektrophotometer bei 560 mIJ abgelesen und die Menge an vorhandener Fruktose aus Standardwerten berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse folgen. Enzymaktivitäten sind berechnet, um die Aktivität/ml an ursprünglichem Kulturmedium zu zeigen.
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Tabelle I
EMI4.1
<tb>
<tb> Intrazellulare <SEP> Glukoisomeraseaktivität
<tb> % <SEP> gebildeter <SEP> mg <SEP> Fruktose/ml <SEP> % <SEP> Fruktose/ml
<tb> Mikroorganismus <SEP> Fruktose <SEP> Kulturflüssigkeit <SEP> Kulturflüssigkeit <SEP>
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d)
<tb> S. <SEP> olivochromogenes <SEP> 38, <SEP> 9 <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 97 <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> 37, <SEP> 5 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP>
<tb> Extrazellulare <SEP> Glukoisomeraseaktivität
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d)
<tb> S. <SEP> olivochromogenes <SEP> 5,6 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> 24, <SEP> 8 <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 99 <SEP>
<tb>
Beispiel 2 : Hier wurde die Wirkung der Kulturperiode auf die Isomeraseaktivitätvon S. venezuelae ATCC Nr. 21113 untersucht.
Das Kulturmedium und die andern Bedingungen waren die gleichen wie in Beispiell beschrieben, mit der Abänderung, dass 10 ml einer Vorkulturbruhe als eine Impfung zu dem 100 ml Hauptkulturgemisch zugesetzt waren. Sowohl Zellen wie Kulturfiltrat wurden nach 16,20, 24,48, 72 und 168 hInkubation geerntet und als Glukoisomeraselösungen benutzt. Die Ergebnisse folgen in Tabelle 2.
Wie ersichtlich, zeigte die intrazellulare Enzymaktivität aus S. venezuelae Höchstaktivität nach nur 16 Kulturstunden und behielt diese Aktivität im wesentlichen auf einer konstanten Höhe während etwa 7 Tagen. Die intrazellulare Glukoisomerase-Enzym-Aktivität von S. venezuelae nahm allmählich zu und blieb im allgemeinen nach etwa 2 Tagen konstant. Somit ist ersichtlich, dass eine stark bevorzugte Enzym-erzeugende Spezies S. venezuelae für die Zwecke der Erfindung ist, infolge der hervorragenden Aktivität im Erzeugen sowohl erheblicher Mengen von extrazellular-und intrazellular-derivierter Aktivität.
Tabelle II
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<tb>
<tb> Intrazellulare <SEP> Glukoisomerase-Enzym-Aktivität
<tb> Kulturperiode <SEP> % <SEP> gebildeter <SEP> mg <SEP> Fruktose/ml <SEP> % <SEP> Fruktose/ml
<tb> Mikroorganismus <SEP> (h) <SEP> Fruktose <SEP> Kulturmedium <SEP> Kulturmedium
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d) <SEP> (e) <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> 16 <SEP> 39, <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 98 <SEP>
<tb> 20 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 24 <SEP> 39, <SEP> 9 <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 48 <SEP> 36. <SEP> 4 <SEP> 5. <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 91 <SEP>
<tb> 72 <SEP> 38, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 95 <SEP>
<tb> 168 <SEP> 38, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 95 <SEP>
<tb> Extrazellulare <SEP> Glukoisomerase-Enzym-Aktivität
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d) <SEP> (e) <SEP>
<tb> S.
<SEP> venezuelae <SEP> 16 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP>
<tb> 24 <SEP> 17, <SEP> 3 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 69 <SEP>
<tb> 48 <SEP> 19, <SEP> 6 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP>
<tb> 72 <SEP> 19, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 79 <SEP>
<tb> 168 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 64 <SEP>
<tb>
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3 :nutzt, Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, lieferte das Stärkexylose enthaltende Medium eine höhere Fruktose bilden- deAktivität im Vergleich zurXylose, und insbesondere in bezug auf die Lieferung von intrazellularer Glukoiso- merase -Enzym -Aktivität.
Tabelle III
EMI5.2
<tb>
<tb> Intrazellulare <SEP> Glukoiso- <SEP> Extrazellulare <SEP> Glukoiso- <SEP>
<tb> Mikroorganismus <SEP> Kohlenstoffquelle <SEP> merase-Enzym-Aktivität <SEP> merase-Enzym-Aktivität
<tb> 0/0 <SEP> gebildeter <SEP> % <SEP> gebildeter
<tb> Fruktose <SEP> Fruktose
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> Xylose-39, <SEP> 3 <SEP> 5,0
<tb> ATCC <SEP> 21113 <SEP> Stärke
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> Xylose <SEP> 24,5 <SEP> 3,5
<tb> ATCC <SEP> 21113
<tb> S. <SEP> olivochromo- <SEP> Xylose-26, <SEP> 6 <SEP>
<tb> genes <SEP> Stärke
<tb> ATCC <SEP> 21114
<tb> S. <SEP> olivochromo- <SEP> Xylose <SEP> 14, <SEP> 9
<tb> genes
<tb> ATCC <SEP> 21114
<tb>
Es ist nicht ganz aufgeklärt worden, welche besondere Wirkung Stärke aufdieFruktosegewinnunghat, wenn als Kulturmedium verwendet.
Es wird jedoch angenommen, dass die Stärke in irgendeiner Weise das Wachstum des Mikroorganismus veranlasst und aktiviert und infolgedessen die sich darauf ergebende Enzymaktivität vergrössert.
Beispiel 4 : In einer weiteren Versuchsreihe wurde die Enzym erzeugende Aktivität von S. venezuelae über verschiedene Kulturzeiten verfolgt. Wie im nachstehenden gezeigt, wurde die intrazellulare Glukoisomerase-Aktivität wieder auf einer im wesentlichen konstanten Höhe sogar während 7 Tagen beibehalten. Die extrazellulare Enzymaktivität dieses Species nahm zu während der ganzen Wachstumsperiode und erreichte ein konstantes Maximum nach etwa 5 Kulturtagen. Da während des Verlaufes dieser Zeit die intrazellulare Enzymaktivität nicht proportional verringert wurde, betont dies insbesondere die Tatsache, dass die extrazellulare Aktivität sich nicht ableitet aus intrazellularer Enzymaktivität, die aus Zellautolyse freigesetzt wurde.
Bei der Ausführung dieser Untersuchungen wurden die folgenden Wachstumsmedien für die Kultur von
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tenden Medien als eine Stickstoffquelle schien die Glukoseisomerisierung weiter zu begünstigen. Es folgt die Zusammensetzung der beiden benutzten Kulturmedien :
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<tb>
<tb> Medium <SEP> mit <SEP> Maiseinweich- <SEP> Medium <SEP> ohne <SEP> Maiseinweichflüssigkeit <SEP> g <SEP> flüssigkeit <SEP> g
<tb> Xylose <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Xylose <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Kartoffelstärke <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Kartoffelstärke <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Maiseinweich <SEP> - <SEP>
<tb> flüssigkeit <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> Pepton <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Pepton <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Fleischextrakt <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Fleischextrakt <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Hefeextrakt <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0,
<SEP> 25 <SEP> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> Kobaltchlorid <SEP> 0, <SEP> 0024 <SEP>
<tb> Kobaltchlorid <SEP> 0, <SEP> 0024 <SEP>
<tb>
Das PH dieser Medien war in beiden Fällen 7, 2.
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Tabellen IV und V zeigen die Ergebnisse dieser verschiedenen Untersuchungen. Tabelle IV bezieht sich auf Enzymaktivität von S. venezuelae, welche aus einem Maiseinweichflüssigkeit enthaltenden Medium bestand. Tabelle V zeigt die Aktivität aus einem Maiseinweichflüssigkeit nicht enthaltenden Medium stammenden En- zym. Etwas bessere Ergebnisse wurden erhalten, wenn Maiseinweichflüssigkeit einen Teil des Nährmediums bildete.
Tabelle IV
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<tb>
<tb> Zeit
<tb> h <SEP> Tage
<tb> 16 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> 30 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 10
<tb> PH <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 9 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 8 <SEP> 8, <SEP> 9 <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Intrazellulare
<tb> Enzymaktivität
<tb> % <SEP> gebildeter
<tb> Fruktose <SEP> 44, <SEP> 4 <SEP> 43, <SEP> 8 <SEP> 45,9 <SEP> 40, <SEP> 8 <SEP> 43, <SEP> 8 <SEP> 42, <SEP> 8 <SEP> 45, <SEP> 2 <SEP> 45, <SEP> 2 <SEP> 30, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Extrazellulare
<tb> Enzymaktivität
<tb> % <SEP> gebildeter
<tb> Fruktose <SEP> 4,4 <SEP> 9,6 <SEP> 8,9 <SEP> 9,5 <SEP> 13,9 <SEP> 13,6 <SEP> 17,8 <SEP> 16,8 <SEP> 15,1
<tb>
Tabelle V
EMI6.2
<tb>
<tb> Zeit
<tb> h <SEP> Tage <SEP>
<tb> 16 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> 30 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP>
<tb> PH <SEP> 7,
<SEP> 3 <SEP> 7,6 <SEP> 7, <SEP> 75 <SEP> 8, <SEP> 1 <SEP> 8,2 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> 9,0 <SEP> 9,0
<tb> Intrazellulare
<tb> Enzymaktivität
<tb> % <SEP> gebildeter
<tb> Fruktose <SEP> 39, <SEP> 3 <SEP> 40, <SEP> 3 <SEP> 41, <SEP> 2 <SEP> 37,0 <SEP> 40, <SEP> 3 <SEP> 40, <SEP> 8 <SEP> 32, <SEP> 2 <SEP> 40, <SEP> 3 <SEP> 34, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Extrazellulare
<tb> Enzymaktivität
<tb> % <SEP> gebildeter
<tb> Fruktose <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 4, <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 5,0 <SEP> 11, <SEP> 6 <SEP> 14, <SEP> 6 <SEP> 13, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Beispiel 5: Auch hier wurden verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet für die Gewinnung eines Glukoisomerase-Enzyms, in diesem Fall einer intrazellularen Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung.
Wie aus den Werten der folgenden Tabelle VI entnehmbar, war die Xylose-Stärke-Nährstoffmischung deutlich überlegen in der Erzeugung von aktiveren Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen im Vergleich zu Xylose oder Stärke allein als Nährstoffmedium.
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Tabelle VI
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<tb>
<tb> Fruktose <SEP> mg <SEP> Enzym/ml
<tb> Mikroorganismus <SEP> Kohlenstoffquelle <SEP> *) <SEP> % <SEP> Reaktionsgemisch <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae, <SEP> Xylose-Stärke
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 21113 <SEP> (Mischung <SEP> 50 <SEP> : <SEP> 50 <SEP> Gew.. <SEP> i1fo) <SEP> 35,5 <SEP> 12,5
<tb> S. <SEP> venezuelae
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 21113 <SEP> Xylose <SEP> 9,2 <SEP> 6,8
<tb> S. <SEP> venezuelae
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 21113 <SEP> Stärke <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 21113 <SEP> Glukose <SEP> 0 <SEP> 13, <SEP> 5
<tb>
*) Die Gesamtmenge an verwendetem Nährstoff war die gleiche in allen Fällen.
Beispiel 6 : Hier wurde eine Anzahl von Variablen untersucht mit Bezug auf die Gewinnung von extrazellularen und intrazellularen Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen durch die S. venezuelae Species ATCC Nr. 21113.
Zuerst wurden die extrazellularen und intrazellularen Enzymaktivitäten untersucht in bezug auf die Wirkung des PH. Die Umwandlungsreaktion aus dem extrazellularen Typ erreichte ein Optimum bei einem PH von etwa 9, 0. Die intrazellulare Aktivität war auch optimal bei einem pH von etwa 9, 0.
Auch wurden verschiedene Versuche durchgeführt, um festzustellen, welche Wirkung die Temperatur auf die Aktivitäten von extrazellularen und intrazellularen Enzymen von S. venezuelae hinsichtlich der Begünstigung der Umwandlung besitzt. Die intrazellulare Aktivität nahm linear über einen Temperaturbereich von 40 bis zu etwa 700C bei Reaktionszeiten von 1 und 3 h zu. Das Optimum wurde bei etwa 700C gefunden. Bei einer halbstündigen Reaktionszeit war die optimale Temperatur 800C. Wenn die Reaktionszeit über etwa 1 h dauert, nimmt die intrazellulare Aktivität oberhalb einer Temperatur von etwa 700C ab.
Die gleiche Einwirkung der Temperatur wurde auch auf dieextrazellulare Aktivität festgestellt, mit der Ausnahme, dass Inaktivierung bei einer etwas höheren Temperatur auftritt.
Bei einer andern Reihe von Untersuchungen wurden 0, 5-, 1, 0-, 2, 0-, 3, 0-, und 4, 0 molarer Konzentrationen von Glukose sowohl mit extrazellularen als auch intrazellularen Glukoisomerase-Enzymen von S. venezuelae behandelt. Es wurde gefunden, dass sogar bei der aussergewöhnlich hohen Konzentration von4, 0 Mol Glukose/l, fast eine gesättigte Lösung, sowohl die intrazellulare wie die extrazellulare Enzymreaktion fortschritt und sich dem theoretischen Gleichgewicht näherte, wenn die Reaktionszeit ausgedehnt wurde. Somit ist ersichtlich, dass die Erfindung geeignet war, sogar hochkonzentrierte Glukoselösungen zu isomerisieren, was sie noch reizvoller für ein technisch ausführbare Verfahren macht.
In einer noch ändern Versuchsreihe wurde die Isomerisierungsreaktion während einer verhältnismässig langen Zeit durchgeführt, um einen annähemdenGleichgewichtszustand zu bestimmen. In bezug auf Intraumwand- lung unter Verwendung intrazellularen Enzyms aus S. venezuelae erreichte der Fruktosegehalt etwa 48% des zugesetzten Zuckers unter Ausgehen von Glukose. Anderseits, wennFruktose das Substrat war, war der schliess- liche Fruktosegehalt etwa 50%. Somit scheint es, dass der Gleichgewichtspunkt in der Nachbarschaft von etwa 48 bis 50%. Intraumwandlung liegt.
Beispiel 7 : Es wurde bei Laboruntersuchungen festgestellt, dass, während eine Anzahl von Streptomyces-Species extrazellular-derivierte Glukoisomeraseaktivität entfaltet, eine überraschende Anzahl keine Glukoisomerase-Enzym-Aktivität extrazellularen Charakters besitzt. Untersuchungen, wie im allgemeinen in Beispiel 1 angegeben, wurden mit einer sehr grossen Anzahl von Streptomyces-Species durchgeführt. Die Ergebnisse bei einigen wenigen von diesen folgen in der Tabelle VII.
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Tabelle VII
EMI8.1
<tb>
<tb> Extrazellulare <SEP> Glukoisomerase-Aktrivität
<tb> mg <SEP> Fmktose/mI <SEP> % <SEP> Fmktose/m1 <SEP>
<tb> Mikroorganismus <SEP> Kulturflüssigkeit <SEP> Kulturflüssigkeit
<tb> 8. <SEP> aureus <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> flaveolus <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> coelicolor <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> parvus <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP>
<tb> S. <SEP> roseochromogenus <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> purpurascens <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> S. <SEP> scabies <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP>
<tb> S. <SEP> vinaceus <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP>
<tb> S. <SEP> tanashiensis <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP>
<tb>
Während die Erfindung an besonderen Ausführungsbeispielen beschrieben wurde, ist es selbstverständlich, dass sie weiterer Abwandlungen fähig ist.
Sie umfasst alle Abwandlungen, Verwendungen oder Anpassungen, wobei sie grundsätzlich benutzt wird und schliesst, solche Abweichungen von der vorstehenden Offenbarung ein,
EMI8.2
:net, dass man eine Glukoisomerase-Zubereitung durch Züchten einer Streptomycesart, die imstande ist, dieses Enzym bei extrazellularer Enzymaktivität zu erzeugen, in einem eine geeignete Kohlenstoffquelle enthaltenden Kulturmedium herstellt, gegebenenfalls die flüssige Phase von den Zellen abtrennt und dass man Gluko- se der Einwirkung der gesamten Enzym-Zubereitung oder einer aus den abgetrennten Teilen gewonnenen Zubereitung unterwirft.
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The invention relates to a process for the production of fructose by isomerizing glucose. In particular, the invention provides a method of the type indicated above, in which a glucoisomerase enzyme preparation is used, in which at least part of the glucoisomerase enzyme is of extracellular origin.
The isomerization of glucose to fructose by the action of aqueous alkali has been known for a long time. Such catalysts, such as. B sodium hydroxide, sodium carbonate, calcium hydroxide, alkaline earth carbonates, alkali ion exchangers, ammonia, pyridine, etc., were used to isomerize glucose. The yield of fructose formed in this way, however, amounts to a maximum of 20 to 3 fF / a d. Th., Making this process uneconomical. Furthermore, any desired isolation of fructose from the reaction mixture can only be carried out with great difficulty and with considerable losses.
In attempts to improve this process, a number of isomerization processes have been suggested which relied on the action of enzymes. These proposals had been found to be unsuitable for the art because of the following disadvantages: poor yield, slow reaction, difficulties in the desired enzyme preparation, the inability to obtain the fructose component as such, and the like. a.
In particular, such enzyme methods have heretofore been based on the use of intracellular enzyme systems
EMI1.1
but time consuming and sometimes difficult to perform and causes markedly increased production costs.
It therefore seemed promising to try to use a glucoisomerase preparation in the production of fructose which has a high degree of extracellular enzyme activity. If such a preparation could also be obtained without the additional onerous step of cell disruption, it would represent a considerable technical advance for the production of fructose.
An enzyme preparation with a high extracellular content is desirable for various reasons; It is well known that intracellular enzymes exert their specific effects more slowly than the extracellular ones. Extracellular enzyme material is generally believed to be more effective against intracellular media both for achieving a higher degree of isomerization and for obtaining higher percentage yields in a shorter time. Up to now, however, no glucoisomerase preparation has been found in which the enzyme is exclusively present in the extracellular state or even only a preparation which would have exhibited a considerable amount of extracellular enzyme activity in addition to the intracellular one.
The invention enables the isomerization of glucose to fructose to be carried out by means of a glucoisomerase enzyme preparation which has a high degree of extracellular activity.
In the method according to the invention, even glucoisomerase preparations can be produced and used in the isomerization of fructose, which contain their enzyme activity only in the extracellular portion of the culture fluid, ie. H. that the culture liquid is used without the cell debris.
The invention also makes it possible that the isomerization process leading to fructose can be adapted to work with high concentrations of glucose substrate and also provides excellent yields of fructose in relatively short times.
In addition, the gluco isomerization process according to the invention allows fructose to be produced in amounts which approach theoretical limits determined by equilibrium conditions.
The process according to the invention for the production of fructose by isomerizing glucose is essentially that a glucoisomerase preparation is produced by culturing a species of Streptomyces which is capable of producing this enzyme with extracellular enzyme activity in a culture medium containing a suitable carbon source, optionally separating the liquid phase from the cells and subjecting glucose to the action of the entire enzyme preparation or of a preparation obtained from the separated parts.
The fluid containing the extracellular enzyme activity can be easily broken down by the cell debris by filtration or other simple methods. In order to release wide activity from the cells and to enrich it extracellularly, one has to tear the cell walls by physical or chemical methods.
Particularly preferred species among the Streptomyces species are Streptomyces venezuelae and Streptomy ces olivochromogenes. Cultures from a strain of each of these organisms were placed in the American Type CultureCollection of microorganisms. They have been given the following names: Streptomyces venezuelae = ATCC No. 21113; Streptomyces olivochromogenes = ATCC No. 21114. These strains produce glucoisomerase, which for the most part is extracellular, as was not previously known.
The desired enzyme is prepared in the usual way. An inoculation material, prepared for example on an agar substrate, is used to inoculate a flask containing a suitable nutrient medium.
So z. B. a culture containing an appropriate Streptomyces strain is used to inoculate a substrate containing an appropriate carbon source. Here the organism is allowed to grow and the desired enzyme is produced. The incubation period can be over a wide time range, depending on
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depending on the type of microorganism and the culture medium used. Generally, the incubation time will be about 4 to 48 hours. Usually only an aliquot part or the entire organ mass is then used to inoculate a larger volume of nutrient. This can be repeated one or more times.
The final culture, with or without purification procedures, is used to carry out the isomerization of glucose to fructose.
Thus, the entire medium can be used directly as a glucoisomerase preparation, or the medium can be filtered or otherwise treated. The filtrate or centrifugate usually contains the extracellular enzyme preparation which can then be used immediately or further purified by a number of known methods. In the same way, the intracellular fraction, which usually remains as a solid cell mass, can either be discarded or used separately in the gluco-isomerization stage. For economic reasons, the entire medium is normally used without further separation if the isomerization of glucose to fructose is to be carried out on an industrial scale.
Up to about 60% or even more of the total glucoisomerase activity can be assigned to extracellular activity. However, not all Streptomyces species or strains are active in this way.
Nevertheless, the invention is not intended to be restricted to the use of a particular organism or microorganism. The ability of special Streptomyces organisms to produce an enzyme preparation which is characterized in that it contains at least a considerable part of the enzyme activity extracellularly was recognized. As already mentioned, such enzyme preparations were previously unknown.
According to a preferred embodiment of the invention, a particularly suitable carbon source or a nutrient is used to cultivate the Streptomyces species. This carbon source is starch and xylose material, e.g. B. a mixture of xylose and starch, which as the only carbon source or in
Combination with a variety of other carbon sources such as B. mannitol, gluconic acid, galactose, glycerin, sorbitol, glucose and other pure or impure sources of carbohydrates can be used. This mixture of xylose and starch as a whole is better suited as a culture medium than either of the two components in the same amount. In particular, the nutrient mixture produces a more active enzyme preparation than xylose, which has been used extensively as a carbon source in the production of glucoisomerase.
Starch alone is also less suitable as a carbon source.
The starch nutrient which can be used in the manufacture of the glucoisomerase preparation in the context of the process according to the invention can be derived from any plant source, e.g. B. corn, wheat, potato, tapioca, rice, sago and sorghum grain. Wax starches can also be used. The term "starch" is used very generally here and includes unmodified starch and residues as well as starch which has been modified by treatment with acids, alkali, enzymes or oxidizing agents. Soluble or partially soluble modified starches, dextrins, pregelatinized products and starch derivatives, e.g. B. certain cationic, anionic and nonionic starch derivatives are also useful. Typical starches that can be used here are corn and potato starch.
The xylose component of the material can be xylose itself or its native forms, which occur in the cell walls of almost all plants in the form of xylan polymers, which contain xylose sugar as the main component. Thus xylose can be used as it is in impure form in straw, chaff, wood, corn on the cob. Wheat bran u. like., present. Usually, the aforementioned or other materials are treated with alkali in order to remove the hemicellulose from the various waste materials which are used as media. In order to obtain the monosaccharide xylose, the hemicellulose is usually hydrolyzed.
Thus, the term "xylose" as used herein is intended to include both the pure material and the impure sources containing this carbohydrate.
In a preferred embodiment for producing the glucoisomerase preparation, the carbon mixture is usually composed of 25 to 75% starch and 25 to 7510 xylose, based only on the total mixture weight of the carbon source. In other words, the xylose and starch containing carbon source usually comprises 0.2 to 10 and more often 0.5 to 2 wt. Of the culture medium.
In another embodiment of the invention, a particularly desirable culture medium also contains corn steep water as a protein source. This combination in addition to the above-described mixture of xylose and starch as a carbon source is particularly advantageous. The corn steep liquor, made up of various amino acids, usually makes up 0.1 to 5.0 percent by weight of the culture medium.
In the preparation of the glucoisomerase preparation used according to the invention, the inoculation medium and the subsequent cell growth media, in addition to the above-described or other carbon sources, may, if desired, contain a suitable nitrogen source, inorganic salts, e.g. Magnesium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, etc., and other materials. Usually the culture, e.g. B. Streptomyces venezuelae, at a pH in the range of about 7 to about 9 and at a temperature of about 20 to about 400C.
The isomerization of glucose to fructose depends on the conditions such as: B. the concentration
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Glucose, temperature, the presence or absence of other enzyme cofactors and the like. Like. It can vary in terms of time and fructose yields. Adequate yields are usually obtained within about 1 to 36 hours. During this stage the temperature can be room temperature or it can be increased to about 50 to 70 ° C. Usually, the pH of the isomerized glucose system is adjusted by using suitable buffer systems, e.g. B. a phosphate buffer, set to about 7 to 9. Other activators, e.g. B. magnesium or manganese ions can also be present.
It may sometimes be possible to keep side reactions to a minimum by adding inhibitors, for example by using sodium arsenate, sodium arsenite and sodium fluoride. It has been found that the enzyme activity can be increased by using an enzyme cofactor such as e.g. B. cobalt in the form of cobalt chloride, can be increased to a maximum.
The glucose itself is usually a concentrated solution. Excellent results have been obtained
EMI3.1
just as supersaturated solutions are isomerized.
In the following examples, parts and percentages are to be understood as parts by weight and percentages by weight.
Example 1: Extracellular glucoisomerase enzyme preparations were made from two species, namely S. venezuelae ATCC No. 21113 and S. olivochromogenes ATCC No. 21114, and the enzyme preparations were used to isomerize glucose patterns.
The culture medium used in this experiment had the following composition:
EMI3.2
<tb>
<tb> Xylose <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> made soluble <SEP>
<tb> Potato starch <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> meat extract <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> yeast extract <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Magnesium sulfate <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g
<tb> cobalt chloride <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g
<tb>
The pH of the culture medium was adjusted to about 7.0 before inoculation.
After sterilization and cooling to 250 ° C., 100 ml samples of the above xylose starch medium were inoculated with the above-mentioned species. The inoculations were specifically carried out by inoculating the medium with three loops full of cells from xylose starch agar seal. After incubation for 48 hours at 28 ° C on a shaker to aerate the culture, cells were harvested by centrifuging the culture medium at 10,000 rpm for 10 minutes. The cells were washed twice with 0.85% saline solution and suspended in 5 ml of 0.05 molar phosphate buffer solution (pH 7.5). The cell suspension was then in a water-cooled sound oscillator for 20 min at j.
Treated O KC and then spun again at 12000 rev / min for 30 min. The supernatant was used as a crude source of intracellular glucoisomerase enzyme solution.
Crude extracellular glucoisomerase was prepared by salting out 50 ml of culture centrifugate with ammonium sulfate at 60% saturation. After centrifugation, the partially purified extracellular enzyme solution was obtained by dissolving the precipitate in 4 ml of 0.05 molar phosphate buffer solution (pH 7.5) and dialyzing the solution against the buffer for one day at 5 C.
The isomerization itself was carried out by preparing a 1.6 molar aqueous solution of glucose which also contained 0.05 molar phosphate buffer, 0.2 molar magnesium sulfate and 0.05 molar cobalt chloride. 2 ml of the above-mentioned enzyme solutions were added to 2 ml of the glucose solution.
After an incubation of 3 hours at 60 ° C., 0.5 ml of the reaction mixture were drawn off in 4.5 ml of 0.5 N perchloric acid solution. The amount of fructose formed in the aliquot was determined by the cysteine carbazole method, as reported in J. Biol. Chem., 192 [1951]. S. S83. In this test, color intensity was developed for 10 minutes at 60 ° C. after the addition of the reagents. The intensity was then read in a spectrophotometer at 560 mIJ and the amount of fructose present was calculated from standard values. The results obtained follow. Enzyme activities are calculated to show the activity / ml on the original culture medium.
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Table I.
EMI4.1
<tb>
<tb> Intracellular <SEP> glucoisomerase activity
<tb>% <SEP> formed <SEP> mg <SEP> fructose / ml <SEP>% <SEP> fructose / ml
<tb> microorganism <SEP> fructose <SEP> culture fluid <SEP> culture fluid <SEP>
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d)
<tb> S. <SEP> olivochromogenic <SEP> 38, <SEP> 9 <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 97 <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> 37, <SEP> 5 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP>
<tb> Extracellular <SEP> glucoisomerase activity
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d)
<tb> S. <SEP> olivochromogenic <SEP> 5,6 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> 24, <SEP> 8 <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 99 <SEP>
<tb>
Example 2: Here the effect of the culture period on the isomerase activity of S. venezuelae ATCC No. 21113 was examined.
The culture medium and other conditions were the same as described in Example, with the modification that 10 ml of a preculture broth was added as an inoculation to the 100 ml main culture mixture. Both cells and culture filtrate were harvested after 16, 20, 24, 48, 72 and 168 hours of incubation and used as glucoisomerase solutions. The results are shown in Table 2.
As can be seen, the intracellular enzyme activity from S. venezuelae showed peak activity after only 16 hours of culture and maintained this activity essentially at a constant level for about 7 days. The intracellular glucoisomerase enzyme activity of S. venezuelae increased gradually and remained generally constant after about 2 days. Thus, it can be seen that a highly preferred enzyme-producing species is S. venezuelae for purposes of the invention, due to its excellent activity in producing both significant amounts of extracellular- and intracellular-derived activity.
Table II
EMI4.2
<tb>
<tb> Intracellular <SEP> glucoisomerase enzyme activity
<tb> Culture period <SEP>% <SEP> <SEP> formed <SEP> mg <SEP> fructose / ml <SEP>% <SEP> fructose / ml
<tb> microorganism <SEP> (h) <SEP> fructose <SEP> culture medium <SEP> culture medium
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d) <SEP> (e) <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> 16 <SEP> 39, <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 98 <SEP>
<tb> 20 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 24 <SEP> 39, <SEP> 9 <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 48 <SEP> 36. <SEP> 4 <SEP> 5. <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 91 <SEP>
<tb> 72 <SEP> 38, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 95 <SEP>
<tb> 168 <SEP> 38, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 95 <SEP>
<tb> Extracellular <SEP> glucoisomerase enzyme activity
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d) <SEP> (e) <SEP>
<tb> S.
<SEP> venezuelae <SEP> 16 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 11, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP>
<tb> 24 <SEP> 17, <SEP> 3 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 69 <SEP>
<tb> 48 <SEP> 19, <SEP> 6 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP>
<tb> 72 <SEP> 19, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 79 <SEP>
<tb> 168 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 64 <SEP>
<tb>
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EMI5.1
3: Uses As can be seen from Table 3, the medium containing starch exylose provided a higher fructose-forming activity compared to xylose, and in particular with respect to the delivery of intracellular gluco-merase enzyme activity.
Table III
EMI5.2
<tb>
<tb> Intracellular <SEP> glucoiso- <SEP> extracellular <SEP> glucoiso- <SEP>
<tb> microorganism <SEP> carbon source <SEP> merase enzyme activity <SEP> merase enzyme activity
<tb> 0/0 <SEP> educated <SEP>% <SEP> educated
<tb> fructose <SEP> fructose
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> Xylose-39, <SEP> 3 <SEP> 5.0
<tb> ATCC <SEP> 21113 <SEP> strength
<tb> S. <SEP> venezuelae <SEP> Xylose <SEP> 24.5 <SEP> 3.5
<tb> ATCC <SEP> 21113
<tb> S. <SEP> olivochromo- <SEP> xylose-26, <SEP> 6 <SEP>
<tb> genes <SEP> strength
<tb> ATCC <SEP> 21114
<tb> S. <SEP> olivochromo- <SEP> xylose <SEP> 14, <SEP> 9
<tb> genes
<tb> ATCC <SEP> 21114
<tb>
It has not been fully elucidated what particular effect starch has on fructose recovery when used as a culture medium.
It is believed, however, that the starch in some way induces and activates the growth of the microorganism and consequently increases the resulting enzyme activity.
Example 4: In a further series of experiments, the enzyme-producing activity of S. venezuelae was monitored over various culture times. As shown below, the intracellular glucoisomerase activity was again maintained at a substantially constant level even for 7 days. The extracellular enzyme activity of this species increased throughout the growth period and reached a constant maximum after about 5 days of culture. Since the intracellular enzyme activity was not proportionally decreased during the course of this time, this particularly emphasizes the fact that the extracellular activity is not derived from intracellular enzyme activity released from cell autolysis.
In carrying out these studies, the following growth media were used for the culture of
EMI5.3
Tending media as a nitrogen source appeared to further promote glucose isomerization. The following is the composition of the two culture media used:
EMI5.4
<tb>
<tb> medium <SEP> with <SEP> corn steeping <SEP> medium <SEP> without <SEP> corn steeping liquid <SEP> g <SEP> liquid <SEP> g
<tb> Xylose <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Xylose <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Potato starch <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Potato starch <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Corn steeping <SEP> - <SEP>
<tb> liquid <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> peptone <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Peptone <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> meat extract <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> meat extract <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> yeast extract <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> yeast extract <SEP> 0,
<SEP> 25 <SEP> magnesium sulfate <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> magnesium sulphate <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> cobalt chloride <SEP> 0, <SEP> 0024 <SEP>
<tb> cobalt chloride <SEP> 0, <SEP> 0024 <SEP>
<tb>
The PH of these media was 7, 2 in both cases.
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Tables IV and V show the results of these various tests. Table IV refers to the enzyme activity of S. venezuelae, which consisted of a medium containing corn steep liquor. Table V shows the activity of enzyme derived from medium not containing corn steep liquor. Slightly better results were obtained when corn steep liquor formed part of the nutrient medium.
Table IV
EMI6.1
<tb>
<tb> time
<tb> h <SEP> days
<tb> 16 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> 30 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 10
<tb> PH <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 9 <SEP> 8, <SEP> 4 < SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 8 <SEP> 8, <SEP> 9 <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Intracellular
<tb> enzyme activity
<tb>% <SEP> educated
<tb> Fructose <SEP> 44, <SEP> 4 <SEP> 43, <SEP> 8 <SEP> 45,9 <SEP> 40, <SEP> 8 <SEP> 43, <SEP> 8 <SEP> 42 , <SEP> 8 <SEP> 45, <SEP> 2 <SEP> 45, <SEP> 2 <SEP> 30, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Extracellular
<tb> enzyme activity
<tb>% <SEP> educated
<tb> Fructose <SEP> 4.4 <SEP> 9.6 <SEP> 8.9 <SEP> 9.5 <SEP> 13.9 <SEP> 13.6 <SEP> 17.8 <SEP> 16 , 8 <SEP> 15.1
<tb>
Table V
EMI6.2
<tb>
<tb> time
<tb> h <SEP> days <SEP>
<tb> 16 <SEP> 20 <SEP> 24 <SEP> 30 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP>
<tb> PH <SEP> 7,
<SEP> 3 <SEP> 7.6 <SEP> 7, <SEP> 75 <SEP> 8, <SEP> 1 <SEP> 8.2 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP > 6 <SEP> 9.0 <SEP> 9.0
<tb> Intracellular
<tb> enzyme activity
<tb>% <SEP> educated
<tb> Fructose <SEP> 39, <SEP> 3 <SEP> 40, <SEP> 3 <SEP> 41, <SEP> 2 <SEP> 37.0 <SEP> 40, <SEP> 3 <SEP> 40 , <SEP> 8 <SEP> 32, <SEP> 2 <SEP> 40, <SEP> 3 <SEP> 34, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Extracellular
<tb> enzyme activity
<tb>% <SEP> educated
<tb> Fructose <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 4, <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 5,0 <SEP> 11, <SEP> 6 <SEP> 14, <SEP> 6 <SEP> 13, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Example 5: Here too, various carbon sources were used for the production of a glucoisomerase enzyme, in this case an intracellular glucoisomerase enzyme preparation.
As can be seen from the values in Table VI below, the xylose-starch nutrient mixture was clearly superior in the production of more active glucoisomerase enzyme preparations compared to xylose or starch alone as the nutrient medium.
<Desc / Clms Page number 7>
Table VI
EMI7.1
<tb>
<tb> fructose <SEP> mg <SEP> enzyme / ml
<tb> microorganism <SEP> carbon source <SEP> *) <SEP>% <SEP> reaction mixture <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae, <SEP> xylose starch
<tb> ATCC <SEP> No. <SEP> 21113 <SEP> (mixture <SEP> 50 <SEP>: <SEP> 50 <SEP> weight .. <SEP> i1fo) <SEP> 35.5 <SEP> 12.5
<tb> S. <SEP> venezuelae
<tb> ATCC <SEP> No. <SEP> 21113 <SEP> Xylose <SEP> 9.2 <SEP> 6.8
<tb> S. <SEP> venezuelae
<tb> ATCC <SEP> No. <SEP> 21113 <SEP> Strength <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP>
<tb> S. <SEP> venezuelae
<tb> ATCC <SEP> No. <SEP> 21113 <SEP> Glucose <SEP> 0 <SEP> 13, <SEP> 5
<tb>
*) The total amount of nutrient used was the same in all cases.
Example 6: Here a number of variables were examined relating to the recovery of extracellular and intracellular glucoisomerase enzyme preparations by the S. venezuelae species ATCC No. 21113.
First, the extracellular and intracellular enzyme activities were examined in relation to the effect of the PH. The conversion reaction from the extracellular type reached an optimum at a pH of about 9.0. Intracellular activity was also optimal at a pH of about 9.0.
Various experiments were also carried out to determine what effect temperature has on the activities of extracellular and intracellular enzymes of S. venezuelae in promoting conversion. The intracellular activity increased linearly over a temperature range from 40 up to about 700C with reaction times of 1 and 3 hours. The optimum was found at around 700C. With a half hour reaction time, the optimal temperature was 800C. If the reaction time is longer than about 1 hour, the intracellular activity decreases above a temperature of about 700C.
The same effect of temperature on the extracellular activity was also noted, except that inactivation occurs at a slightly higher temperature.
In another series of studies, 0, 5, 1, 0, 2, 0, 3, 0, and 4.0 molar concentrations of glucose were treated with both extracellular and intracellular glucoisomerase enzymes from S. venezuelae. It was found that even at the extraordinarily high concentration of 4.0 mol glucose / l, almost a saturated solution, both the intracellular and extracellular enzyme reactions progressed and approached theoretical equilibrium as the reaction time was extended. It can thus be seen that the invention was suitable for isomerizing even highly concentrated glucose solutions, which makes it even more attractive for a technically feasible process.
In yet another series of experiments, the isomerization reaction was carried out for a comparatively long time in order to determine an approximately equilibrium state. With regard to intra-conversion using intracellular enzyme from S. venezuelae, the fructose content reached about 48% of the added sugar, running out of glucose. On the other hand, if fructose was the substrate, the final fructose content was about 50%. Thus, it seems that the equilibrium point is in the neighborhood of about 48 to 50%. Intra-transformation lies.
Example 7: It has been found in laboratory studies that while a number of Streptomyces species display extracellular-derived glucoisomerase activity, a surprising number have no glucoisomerase enzyme activity of an extracellular character. Studies as indicated generally in Example 1 were carried out on a very large number of Streptomyces species. The results for a few of these follow in Table VII.
<Desc / Clms Page number 8>
Table VII
EMI8.1
<tb>
<tb> Extracellular <SEP> glucoisomerase activity
<tb> mg <SEP> Fmctose / mI <SEP>% <SEP> Fmctosis / m1 <SEP>
<tb> microorganism <SEP> culture fluid <SEP> culture fluid
<tb> 8. <SEP> aureus <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> flaveolus <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> coelicolor <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> parvus <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP>
<tb> S. <SEP> roseochromogenus <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S. <SEP> purpurascens <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> S. <SEP> scabies <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP>
<tb> S. <SEP> vinaceus <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP>
<tb> S. <SEP> tanashiensis <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP>
<tb>
While the invention has been described using particular exemplary embodiments, it is understood that it is capable of further modifications.
It includes all modifications, uses or adaptations, whereby it is generally used and includes such deviations from the above disclosure,
EMI8.2
: net that a glucoisomerase preparation is produced by culturing a species of Streptomyces which is capable of producing this enzyme with extracellular enzyme activity in a culture medium containing a suitable carbon source, optionally separating the liquid phase from the cells and that glucose is the Subject to the action of the entire enzyme preparation or of a preparation obtained from the separated parts.