WO2004070021A1 - Procedimiento para la obtención de células del alga verde muriellopsis ricas en luteína, mediante su cultivo en estanques a la intemperie - Google Patents

Procedimiento para la obtención de células del alga verde muriellopsis ricas en luteína, mediante su cultivo en estanques a la intemperie Download PDF

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José Moreno Fernández
Joaquín RIVAS FLORIDO
Miguel GARCÍA GUERRERO
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor

Definitions

  • the object of the present invention is a process for obtaining lutein-rich biomass from the Muriellopsis microalgae, for use as a pigment of biological origin in animal feed (chickens, fish, etc.).
  • the lutein obtained by the present procedure can be used as a component of functional foods for humans in the prevention and treatment of various pathologies, such as cancer, cardiovascular and degenerative diseases associated with age (cataracts, macular degeneration, etc.), as well as in cosmetics.
  • microalgae cultivation For large-scale microalgae cultivation, different open air systems have been designed and used, including ponds of various types.
  • the cultivation of microalgae in an open system combines typical characteristics of agricultural crops (extensive use of the land, water and nutrients, as well as dependence on climate and solar radiation) with other characteristics of industrial processes for the cultivation of microorganisms, such as the possibility of operation in continuous, with nutrient supply at optimum concentration and control of the most important process parameters.
  • the generation of products of commercial interest (pigments, antioxidants, vitamins, fatty acids, etc.) is a central aspect of microalgae biotechnology.
  • microalgae compounds among which carotenoids, phycobiliproteins, lipids or polysaccharides, from very few strains of microalgae, such as Spirulina, Chlorella, Dunaliella, Haematococcus or Porphyridium.
  • carotenoids which can occur in substantial amounts in the cells of certain microalgae, organisms that represent an ideal and almost exclusive biological source of some of these pigments.
  • the Carotenoids are fat-soluble isoprenoid pigments, with accessory paper in photosynthesis, whose coloration varies from yellow to red.
  • the two general groups of carotenoids are xanthophylls and carotenes, which differ from each other because only the former contain oxygen.
  • the increasingly restrictive regulations on the use of synthetic dyes in the food industry have stimulated research and development in the production and use of pigments of biological origin as an additive in foods, as well as in cosmetics.
  • Aquaculture one of the areas of greatest current development in the field of food production, also demands increasing amounts of carotenoids.
  • clinical trials are showing beneficial properties of some carotenoids in the prevention and treatment of various diseases, such as cancer, cardiovascular and age-related degenerative diseases, such as cataracts or macular degeneration.
  • various diseases such as cancer, cardiovascular and age-related degenerative diseases, such as cataracts or macular degeneration.
  • cataracts or macular degeneration Among the more than 600 known carotenoids, only a few have commercial use.
  • xanthophylls such as astaxanthin or lutein are also used as feed additives to increase pigmentation of shellfish, salmonids and other fish, as well as chicken and egg yolks.
  • Muriellopsis algae has considerable levels of lutein, with information on physiological and biochemical aspects of this microalgae, and its cultivation under conditions controlled in laboratory and in closed reactors (Del Campo et al. J. Biotechnol. (2000) 76, 51-59 and (2001) 85, 289-295), although until now its behavior in culture in open system to the outdoor.
  • patents related to the production of ⁇ -carotene carotenoid in open culture systems using Dunaliella algae JP57159484, IL54881, CN1044200, among others).
  • the object of the present invention is a method for obtaining Muriellopsis cells rich in lutein, by means of outdoor cultivation in open ponds with agitation and comprising the steps of: a) introduction into the ponds of a Muriellopsis cell suspension with a density between 1 and 4 x 10 6 cells mi "1. b) circulation of the cell suspension through the tank at a speed between 0.20 and 0.55 ms " 1 for a period preferably between 1 and 30 days, which period may be extended more than 30 days, without temperature control and subject to the usual solar irradiance of the area.
  • the culture system is outdoors, the source of illumination is sunlight, the temperature is not controlled at any time during the process, and the pH value of the culture is between 6.5 and 10.
  • the cell suspension circulates at a speed between 0.20 and 0.55 ms "1 , by means of a rotating wheel drive provided with vanes.
  • the cell suspension is maintained at a depth between 5 and 20 cm, and preferably at 10 cm.
  • the lutein content of the biomass produced by this procedure is between 0.4 and 1% of the dry weight.
  • the object of the present invention is a process for obtaining biomass of the lutein-rich Muriellopsis algae, by means of its outdoor cultivation in open shallow pond systems, with control of agitation, cell density, depth and pH of the process, and comprising the steps of: a) introduction into the ponds of a suspension of Muriellopsis cells in culture medium, with a density between 1 and 4 x 10 6 cells mi "1 , the height of the liquid column being between 5 and 20 cm, and preferably 10 cm.
  • This microalgae has the ability to grow in a wide range of pH, being able to develop at pH values between 6.5 and 10.
  • the pH is kept close to its default value by injecting CO through of a porous tube, located at the bottom of the pond, which supplies the gas in small bubbles that diffuse in the liquid medium.
  • the flow of CO 2 supplied is regulated with flow meters and its supply can be controlled by the operation of a solenoid valve connected to a detector system of a parameter of interest, such as solar irradiance or pH.
  • the lutein content of the biomass produced by the present invention is between 0.4 and 1% of the dry weight.
  • the ponds are oblong, their curved ends are devoid of edges, and they are constructed with fiberglass reinforced polyester (GRP), their dimensions being 2.8 m in maximum length, 1, 2 m in maximum width and 0.3 m high, being divided transversely into two halves (channels) by a longitudinal partition of 1, 6 m, which leaves free spaces of about 0.6 m at each end.
  • GRP fiberglass reinforced polyester
  • the rotating wheel with the three vanes is located in one of the channels of the pond, with its axis close to one of the ends, the vanes having the maximum possible width with respect to the section of the channel, also reaching the bottom of the pond, being These relevant conditions for consideration in the design of larger ponds.

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Abstract

El objeto de la presente invención es un procedimiento para la obtención de biomasa de la microalga Muriellopsis rica en luteína mediante su cultivo a la intemperie en un sistema de estanque abierto con agitación. Mediante el procedimiento de la invención se alcanzan elevados valores de productividad, tanto de biomasa como del carotenoide luteína. Este sistema posibilita la ampliación del proceso de cultivo a extensiones mayores, permitiendo consecuentemente obtener elevadas cantidades de biomasa rica en luteína, manteniendo la composición y calidad del producto.

Description

TÍTULO
Procedimiento para la obtención de células del alga verde Muriellopsis ricas en luteína, mediante su cultivo en estanques a la intemperie.
SECTOR DE LA TÉCNICA
Acuicultura. El objeto de la presente invención es un procedimiento para la obtención de biomasa rica en luteína de la microalga Muriellopsis, para su utilización como pigmento de origen biológico en alimentación animal (pollos, peces, etc.). Asimismo, la luteína obtenida mediante el presente procedimiento puede ser utilizada como componente de alimentos funcionales para humanos en la prevención y tratamiento de diversas patologías, tales como cáncer, enfermedades cardiovasculares y degenerativas asociadas a la edad (cataratas, degeneración macular, etc.), así como en cosmética.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Para el cultivo de microalgas a gran escala se han diseñado y empleado distintos sistemas abiertos al aire, que incluyen estanques de varios tipos. El cultivo de microalgas en sistema abierto combina características típicas de cultivos agrícolas (uso extensivo del terreno, agua y nutrientes, así como dependencia del clima y la radiación solar) con otros propios de procesos industriales para el cultivo de microorganismos, tales como posibilidad de operación en continuo, con suministro de nutrientes a concentración óptima y control de los parámetros más importantes del proceso. La generación de productos de interés comercial (pigmentos, antioxidantes, vitaminas, ácidos grasos, etc.) constituye un aspecto central de la biotecnología de microalgas. Pocos son los sistemas establecidos industrialmente para la obtención de compuestos de microalgas, entre los que destacan carotenoides, ficobiliproteínas, lípidos o polisacáridos, provenientes de muy pocas estirpes de microalgas, tales como Spirulina, Chlorella, Dunaliella, Haematococcus o Porphyridium. Entre estos compuestos con interés comercial sobresalen los carotenoides, que pueden presentarse en cantidades sustanciales en las células de determinadas microalgas, organismos que representan una fuente biológica idónea y casi exclusiva de algunos de estos pigmentos. Los carotenoides son pigmentos isoprenoides liposolubles, con papel accesorio en la fotosíntesis, cuya coloración varía del amarillo al rojo. Los dos grupos generales de carotenoides son xantofilas y carotenos, que se diferencian entre sí porque sólo los primeros contienen oxígeno. Las cada vez más restrictivas regulaciones del uso de colorantes sintéticos en la industria alimentaria han estimulado la investigación y desarrollo en la producción y empleo de pigmentos de origen biológico como aditivo en alimentos, así como en cosmética. La acuicultura, una de las áreas de mayor desarrollo actual en el campo de la producción alimentaria, demanda también cantidades crecientes de carotenoides. Por otra parte, ensayos clínicos están poniendo de manifiesto propiedades beneficiosas de algunos carotenoides en la prevención y tratamiento de diversas enfermedades, tales como cáncer, las cardiovasculares y las degenerativas asociadas a la edad, como cataratas o degeneración macular. De entre los más de 600 carotenoides conocidos, sólo unos pocos tienen uso comercial. Su empleo como colorante natural en alimentación se extiende a una gran variedad de productos, como mantequilla, margarina, quesos y otros derivados lácteos, bebidas refrescantes, pasta, etc. Algunas xantofilas, como astaxantina o luteína se emplean también como aditivos en piensos para incrementar la pigmentación de mariscos, salmónidos y otros peces, así como la de pollos y yemas de huevo.
A diferencia del caso del β-caroteno a partir de Dunaliella, no se ha autentificado todavía la operación de sistemas comerciales de producción de alguna xantofila de interés basado en microalgas en condiciones de cultivo abierto al exterior. Sin embargo, su gran interés determina que se estén dedicando considerables esfuerzos a este fin. La mayoría de los intentos giran alrededor de la estirpe Haematococcus pluvialis, perteneciente al orden Volvocales, que puede presentar niveles de astaxantina de hasta el 2% del peso seco. En lo referente a microalgas productoras de otras xantofilas de interés, tal como es la luteína, la información disponible es sumamente escasa. A este respecto, cabe señalar que el alga Muriellopsis tiene niveles considerables de luteína, disponiéndose de información sobre aspectos fisiológicos y bioquímicos de esta microalga, y de su cultivo en condiciones controladas de laboratorio y en reactores cerrados (Del Campo et al. J. Biotechnol. (2000) 76, 51-59 y (2001) 85, 289-295), aunque hasta ahora se desconocía su comportamiento en cultivo en sistema abierto a la intemperie. Por último, existen patentes relacionadas con la producción del carotenoide β- caroteno en sistemas de cultivo abierto empleando el alga Dunaliella (JP57159484, IL54881 , CN1044200, entre otras).
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es un procedimiento para la obtención de células de Muriellopsis ricas en luteína, mediante su cultivo a la intemperie en estanques abiertos con agitación y que comprende las etapas de: a) introducción en los estanques de una suspensión celular de Muriellopsis con una densidad comprendida entre 1 y 4 x 106 células mi"1. b) circulación de la suspensión celular por el estanque a una velocidad comprendida entre 0,20 y 0,55 m s"1 durante un periodo comprendido preferentemente entre 1 y 30 días, pudiendo prolongarse dicho periodo más de 30 días, sin control de temperatura y sometido a la irradiancia solar habitual de la zona. c) crecimiento de las células y mantenimiento del cultivo en régimen semicontinuo, recogiendo la biomasa de Muriellopsis contenida en los estanques, retirando parte del volumen de la suspensión celular y reemplazándolo por medio de cultivo libre de células para alcanzar una densidad celular mínima de 4 x 106 células mi"1. El sistema de cultivo se encuentra a la intemperie, la fuente de iluminación es la luz solar, la temperatura no se controla en ningún momento del proceso, y el valor de pH del cultivo esta comprendido entre 6,5 y 10. La suspensión celular circula a una velocidad comprendida entre 0,20 y 0,55 m s"1, mediante impulsión por rueda giratoria provista de paletas. La suspensión celular se mantiene a una profundidad comprendida entre 5 y 20 cm, y preferentemente a 10 cm.
El contenido en luteína de la biomasa producida por el presente procedimiento esta comprendido entre el 0,4 y el 1 % del peso seco. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es un procedimiento para la obtención de biomasa del alga Muriellopsis rica en luteína, medíante su cultivo a la intemperie en sistemas abiertos de estanques poco profundos, con control de agitación, densidad celular, profundidad y pH del proceso, y que comprende las etapas de: a) introducción en los estanques de una suspensión de células de Muriellopsis en medio de cultivo, con una densidad comprendida entre 1 y 4 x 106 células mi"1, siendo la altura de la columna líquida entre 5 y 20 cm, y preferentemente de 10 cm. b) agitación mediante una rueda giratoria provista de paletas que giran a una velocidad suficiente para provocar la circulación de la suspensión celular por el estanque a una velocidad comprendida entre 0,20 y 0,55 m s"1, durante un periodo comprendido entre 1 y 30 días, siendo también posible prolongar el cultivo más de 30 días, sin control de temperatura, siendo la fuente de iluminación la radiación solar habitual de la zona. c) recogida de la biomasa de Muriellopsis contenida en los estanques, retirando parte del volumen de la suspensión celular y reemplazándolo por medio de cultivo libre de células para alcanzar una densidad celular mínima de 4 x 106 células mi"1, ya que el proceso se realiza en régimen semicontinuo.
Esta microalga tiene la capacidad de crecer en un amplio margen de pH, siendo capaz de desarrollarse a valores de pH comprendidos entre 6,5 y 10. Durante el proceso, el pH se mantiene próximo a su valor prefijado mediante la inyección de CO a través de un tubo poroso, situado en el fondo del estanque, que suministra el gas en pequeñas burbujas que difunden en el medio líquido. El caudal de CO2 suministrado se regula con medidores de flujo y su suministro puede controlarse mediante la operación de una electroválvula conectada a un sistema detector de un parámetro de interés, tal como la irradiancia solar o el pH. El contenido en luteína de la biomasa producida por la presente invención esta comprendido entre el 0,4 y el 1 % del peso seco. EJEMPLO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma. Elementos de los estanques Los cultivos de Muriellopsis sp. se llevan a cabo a la intemperie en estanques abiertos de 3 m2 de superficie, dotados de un sistema de agitación compuesto por una rueda giratoria con tres paletas en ángulo de 120°, impulsada por un motor eléctrico, para provocar la mezcla continua de la suspensión celular. Este sistema permite obtener una velocidad lineal del fluido de 0,30 m s"1 cuando las paletas giran a 10 rpm y de 0,55 m s"1 cuando giran a 20 rpm. Los estanques son de forma oblonga, siendo sus extremos curvos y desprovistos de aristas, y están construidos con poliéster reforzado con fibra de vidrio (PRFV), siendo sus dimensiones de 2,8 m de longitud máxima, 1 ,2 m de anchura máxima y 0,3 m de altura, estando divididos transversalmente en dos mitades (canales) por un tabique longitudinal de 1 ,6 m, que deja espacios libres de unos 0,6 m a cada uno de los extremos. La rueda giratoria con las tres paletas está situada en uno de los canales del estanque, con su eje cercano a uno de los extremos, teniendo las paletas el máximo ancho posible respecto a la sección del canal, llegando asimismo hasta el fondo del estanque, siendo estas condiciones relevantes para su consideración en el diseño de estanques de mayor dimensión.
Condiciones óptimas para el cultivo de Muríellopsis
No se conocen experiencias previas del cultivo de Muríellopsis al exterior en estanques abiertos. Por ello, se ha verificado el crecimiento de la microalga y se han definido las condiciones óptimas para su cultivo en el sistema que aquí se presenta, considerando diversas variables, tales como densidad celular, velocidad de circulación, profundidad y pH para los valores de temperatura e irradiancia ambientales de la zona. La influencia de los factores antes mencionados (densidad celular, profundidad, velocidad de circulación y pH) se han ensayado en distintas épocas del año. Se han conseguido valores de productividad de biomasa y luteína del orden de 12 y 0,07 g m"2 día"1, respectivamente, durante la primavera con una irradiancia solar media de alrededor de 10 MJ m"2 día"1. Estos valores se han obtenido para una profundidad de la suspensión celular de 10 cm, manteniendo una densidad de población mínima de 4 x 106 células mi"1 y un valor de pH en torno a 8, con una velocidad de flujo de la suspensión de 0,45 m s" . A valores inferiores de velocidad de flujo y más elevados de profundidad o densidad celular, disminuía la productividad, tanto de biomasa como de luteína. Las células de Muriellopsis obtenidas en estas condiciones poseen luteína como carotenoide mayoritario, que representa al menos el 65% del total de carotenoides, entre los que también se encuentran β-caroteno y violaxantina, aunque en inferior proporción.
El trabajo se ha desarrollado utilizando la microalga Muriellopsis proveniente de la marisma del Empordá.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Procedimiento para la obtención de células de Muríellopsis ricas en luteína, mediante su cultivo a la intemperie caracterizado por la utilización de estanques abiertos al aire y que comprende las etapas de: a) introducción en los estanques de una suspensión celular de Muríellopsis con una densidad comprendida entre 1 y 4 x 106 células mi"1. b) circulación de la suspensión celular por los estanques a una velocidad comprendida entre 0,20 y 0,55 m s" durante un periodo comprendido preferentemente entre 1 y 30 días sin control de temperatura y con la irradiancia solar habitual de la zona. c) crecimiento de las células y mantenimiento del cultivo en régimen semicontinuo, recogiendo la biomasa de Muríellopsis contenida en los estanques, retirando parte del volumen de la suspensión celular y reemplazándolo por medio de cultivo libre de células para alcanzar una densidad celular mínima de 4 x 106 células mi"1.
2.- Procedimiento para la obtención de células de Muríellopsis ricas en luteína según la reivindicación 1 , caracterizado porque el sistema de cultivo se encuentra a la intemperie y la fuente de iluminación es la luz solar.
3.- Procedimiento para la obtención de células de Muríθllopsis ricas en luteína según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la suspensión celular circula a una velocidad comprendida entre 0,20 y 0,55 m s"1.
4.- Procedimiento para la obtención de células de Muriellopsis ricas en luteína según las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la circulación de la suspensión celular se realiza mediante impulsión por rueda giratoria provista de paletas.
5.- Procedimiento para la obtención de células de Muriellopsis ricas en luteína según las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la temperatura no se controla en ningún momento del proceso.
6.- Procedimiento para la obtención de células de Muríellopsis ricas en luteína según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la suspensión celular se mantiene circulando por los estanques durante un periodo comprendido preferentemente entre 1 y 30 días.
7.- Procedimiento para la obtención de células de Muríellopsis ricas en luteína según las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la suspensión celular se mantiene circulando por los estanques durante un periodo superior a 30 días.
8.- Procedimiento para la obtención de células de Muríellopsis ricas en luteína según las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el valor de pH de dicho cultivo está comprendido entre 6,5 y 10.
9.- Procedimiento para la obtención de células de Muriellopsis ricas en luteína según las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque la suspensión celular se mantiene a una profundidad comprendida entre 5 y 20 cm, y preferentemente a 10 cm.
10.- Procedimiento para la obtención de células de Muríellopsis ricas en luteína según las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el contenido en luteína de la biomasa producida por dicho procedimiento está comprendido entre el 0,4 y el 1% del peso seco.
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