CN101195813A - 一种单细胞微生物的高效破壁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效快速的单细胞微生物的破壁方法，该方法首先将细胞制备成10～30％的细胞悬液通入高压均质机中，对于原核单细胞微生物而言，设置压力为60～90MPa，对于真核单细胞微生物，则设置压力为90～150MPa，流速5～80升/小时，循环1～4次，即可对细菌或酵母实现100％的破壁。本发明方法可有效地应用于发酵工程产物提取工艺，节约时间，提高生产效率，并且无需任何化学药物辅助，尤其适用于发酵工业。

Description

一种单细胞微生物的高效破壁方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及单细胞微生物的细胞破碎方法。
背景技术
微生物发酵在工业中发挥着巨大的作用，很多抗生素、酶类、有机酸、色素等均通过微生物发酵获得。特别是构建基因工程菌株，高效表达目的产物，已经成为人们大量获取有益产物的途径。由于微生物细胞壁组成和厚度差异很大，还没有一个对细菌和真菌通用的方法进行细胞破碎。通常采用酸碱破壁会造成污染，且易破坏拟提取的产物，化学法破壁对环境不友好，现有的压力破壁机(FrenchPress)效率极低，只限实验室使用，  且不适于酵母菌的破壁。而一些酵母菌需要采用蜗牛酶或纤维素酶辅助破壁，对一些壁厚的酵母菌作用不显著，常常需要根据情况混合不同的酶液，调整酶解条件，花费大，效率低，不适于大规模生产使用。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的在于针对上述不足提供一种高效快速的细胞破壁方法，既可达到100％破壁，又便于胞内产物的提取。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明的技术方案是采用高压匀质机对细胞悬液直接进行破碎。其包括步骤：首先将细胞制备成10～30％的细胞悬液通入高压均质机中，对于原核单细胞微生物而言，设置压力为60～90Mpa，对于真核单细胞微生物，则设置压力为90～150Mpa，流速为5～80升/小时，循环1～4次。当然，也可以将发酵罐中的发酵液直接加入高压匀质机，按照上述条件进行破壁。
具体地说，对于原核单细胞微生物，优选将其制备成20～30％的细胞悬液，通入高压匀质机，选择压力80Mpa，采用流速为7升/小时的高压均质机，循环2次，即可100％破壁。
对于真核单细胞微生物，优选将其制备成20～30％的细胞悬液，通入高压匀质机，选择压力120Mpa，采用流速为50-70升/小时，循环2-3次，即可100％破壁。
(三)有益效果
本发明建立了直接快速的单细胞破壁方法，发酵罐中培养的细胞直接进入破壁程序，无需经过离心-再悬浮混匀的过程，并且可保证目标物完好无损，破碎的细胞粗提液即可直接进入产物纯化的过程，减少了生产环节，节约了工作时间。本发明适用于所有单细胞微生物的破壁环节，其能够在发酵工业中提高工作效率，并且该方法无需任何化学药物辅助，显著降低生产成本，同时对环境无排放污染，可以广泛推广使用，经济效益不可估量。
附图说明
图1：磁螺菌破壁效果检测(60Mpa，20％细胞液，循环2次破壁后光学显微镜照片(×1000))；
图2：法夫酵母破壁图(120Mpa，30％细胞液，循环2次破壁后光学显微镜照片(×400))。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实验设备及其参数：
型号：NCJJ-7/200         型号：NCJJ-75/150
流量(L/H)：7             流量(L/H)：75
最大压力(Mpa)：200       最大压力(Mpa)：150
额定压力(Mpa)：180       额定压力(Mpa)：120
功率(KW)：0.75           功率(KW)：7.5
最大投入粒径(μm)：10    最大投入粒径(μm)：50
实施例1原核单细胞生物的细胞破碎
本例采用单细胞模式微生物趋磁螺菌(Magnetospirillumgryphiswaldense)为代表菌株，将发酵后的趋磁细菌从发酵罐中直接以管道通入高压均质机，设定好压力，流速为7L/h，循环2次后，细胞全部破碎，提取磁小体，经电镜观察，磁小体颗粒均匀，外膜完整，质量完好。表1是磁螺菌在不同条件下的破壁效果。图1是20％细胞液，在60Mpa压力下破碎后，经结晶紫染色后的结果。细胞破碎率达90％。
表1磁螺菌在不同条件下的破壁效果
细胞浓度(W/V) 压力  流量L/h  循环次数   破壁率
10％ 60Mpa  7  2   100％
10％ 80Mpa  7  2   100％
20％ 60Mpa 7 2 90％
20％ 80Mpa  7  2   100％
30％ 60Mpa  7  2   90％
30％ 80Mpa  7  2   100％
实施例2真核单细胞生物的细胞破碎
本例采用单细胞微生物法夫酵母(Phaffia rhodozyma)为代表菌株，分别配制成10％、20％和30％的细胞悬液，通入高压均质机，在不同条件下进行破壁。结果如表2所示。
表2法夫酵母在不同条件下的破壁效果
细胞浓度(W/V) 压力(Mpa)  流量L/h  循环次数  破壁率
10％ 90  7-10(下同)  1  87％
10％ 120  7  2  100％
20％ 100  7  2  95％
20％ 120  7  2  100％
30％ 120  7  2  95％
30％ 150  7  2  100％
由上表可以看出10％的细胞悬液在90Mpa的压力处理破壁率即可达到87.7％，在120Mpa，150Mpa的处理能彻底的使细胞壁破碎，色素提取率近100％。因此我们选择120Mpa为法夫酵母破壁的最适压力，并大规模的应用于生产。图2是30％细胞悬液，经120Mpa压力破壁后的细胞400倍光学显微镜照片。视野中仅有少量完整细胞，95％以上的细胞已经被破碎。法夫酵母破壁后虾青素提取率高于其他破壁方法。
实施例3大流量高压均质机对细菌和酵母的破壁效果
表3在不同条件下的破壁效果
细胞浓度(W/V) 压力(Mpa) 流量L/h 循环次数 破壁率
20％磁螺菌 80  75  2  100％
30％磁螺菌 80  75  2  99％
20％法夫酵母 140  75  3  100％
30％法夫酵母 140  75  4  98％
表3显示大流量高压均质机对磁螺菌和法夫酵母的破壁效果，采用80-140Mpa的工作压力，在流量为75升/h，循环2-4次，均可达到98％-100％破壁效果。

Claims (6)

1.一种单细胞微生物破壁方法，其包括步骤：首先将细胞制备成10～30％的细胞悬液通入高压均质机中，对于原核单细胞微生物而言，设置压力为60～90Mpa，对于真核单细胞微生物，则设置压力为90～150Mpa，流速为5～80升/小时，循环1～4次。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，破壁对象为真核单细胞微生物则设置细胞悬液浓度为20～30％，压力120Mpa。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，破壁对象为原核微生物设置细胞悬液浓度为20～30％，压力80Mpa。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的原核单细胞微生物为趋磁细菌。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的真核单细胞微生物为法夫酵母。
6.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞悬液为发酵培养的发酵液。
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