CN111778170A - 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用。本发明中贝莱斯芽孢杆菌Lpl‑wx的保藏编号为CGMCC No.17045。该菌株可应用于虾青素酯酶的制备，由于贝莱斯芽孢菌属于原核生物，发酵过程快，产酶效率高，可快速高效地得到虾青素酯酶。该菌株可进一步应用于虾青素单体的制备，可以有效降解虾青素酯并得到虾青素单体，提供了一种绿色高效、副产物少的催化途径，为虾青素单体的制备与推广提供了技术基础。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用。
背景技术
虾青素(Astaxanthin，又称3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β-胡萝卜素) 是胡萝卜素的含氧衍生物，结构式C40H52O4，分子量596.86，分子结构中含有非常长的共轭双键和α-羟基酮，广泛存在于生物体内，特别是虾、蟹、藻类和鱼类等水生生物。雨生红球藻中提取的虾青素主要以三种状态存在：游离虾青素单体仅占5％，虾青素单酯占70％，虾青素双酯占25％，提取物中的脂肪酸组成主要有长链饱和与不饱和脂肪酸形式，包括C16:0(7％)，C18:0(7％)，C19:0(7％)，C20:0(7％) 及C18:1(56％)，主要以油酸为主，与橄榄油混合物结构比较相似。
大量研究发现，虾青素具有良好的生物学功能，如极强的抗氧化活性和抗癌能力、增强机体免疫、抗衰老、预防动脉硬化及相关疾病等，是天然的生物着色剂，在水产养殖、医药和化妆品工业都有着广泛的应用。雨生红球藻作为虾青素的主要来源，虾青素含量高，但主要以虾青素酯的形式存在，游离虾青素含量极少。虾青素酯成分复杂，在生物体内不容易被吸收利用，需水解得到虾青素单体。虾青素酯转化工艺最常用的方法是是碱皂化法，但虾青素单体和酯在碱性条件不稳定，虾青素单体极易被氧化，而且皂化成本高、副产物多、回收虾青素单体困难、对环境污染严重，因此不利于工业生产；利用生物催化剂-脂肪酶，不仅转化效率高，而且无污染。
脂肪酶(Triacylglycerol acylhydrolase Lipase，EC3.1.1.3)是一类重要的甘油酯键水解酶，可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油，具有多种催化功能。同时，脂肪酶作为一种友好的生物催化剂，还具有反应温和、稳定性好、底物特异性高，适合于催化虾青素酯的水解。脂肪酶来源丰富，广泛存在于动物、植物和微生物中。相比动植物源脂肪酶，微生物中脂肪酶种类最多，具有更广泛的作用 pH、作用温度范围和底物专一性，酶学性质优异，便于获得高纯度制剂，具有更大的开发潜力和优势。因此，筛选得到能够特异性水解虾青素酯获得虾青素单体的微生物源虾青素酯酶产生菌株具有现实意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用。
本发明提供以下技术方案：
本发明首先提供了一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) Lpl-wx，该菌株于2018年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.17045，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明进一步提供了一种上述贝莱斯芽孢杆菌的筛选方法，取土样进行富集培养后得到富集培养液，所述富集培养液通过罗丹明B选择性培养基进行初筛，再通过橄榄油选择性培养基进行复筛后得到。
所述土样来源于云南省昆明市滇池湖区。
从自然界中分离筛选得到具有某种特性的产虾青素酯酶菌株已有大量的报道，在已报道过的中英文文献中，筛选虾青素酯酶高产菌时，培养基中的油脂大部分采用橄榄油，少数采用其他植物油。由于本发明希望应用于虾青素单体的制备中，最终作用的底物为虾青素酯，鉴于虾青素酯与橄榄油的结构在一定程度上相似，本发明培养基中添加的油脂选用橄榄油。培养基中的碳源、氮源、无机盐等则按照常规使用添加，保证菌体在培养基中能够正常生长。
本发明在筛选时所用的富集培养基中包括以下质量百分比的组分：蔗糖0-1％，酵母浸粉0-1％，氯化钠0-1％，磷酸氢二钠0-1％，硫酸铵0-1％，磷酸氢二钾0-1％，无水硫酸镁0-0.5％，橄榄油乳化液 1％-3％。所述橄榄油乳化液是用三倍体积的2％(w/v)的聚乙烯醇乳化一倍体积的橄榄油而制得。
作为优选，富集培养基包括下列各组分：蔗糖0.02％，酵母浸粉 0.02％，氯化钠0.05％，磷酸氢二钠0.35％，硫酸铵0.15％，磷酸氢二钾0.15％，无水硫酸镁0.05％，橄榄油乳化液1％。
作为优选，本发明在进行初筛、复筛和纯化时的培养条件为 32℃-40℃、150-250r/min条件下，摇床培养18-36h。
作为优选，所述罗丹明B选择性培养基包括以下质量百分比的组分：胰蛋白胨0-2％，酵母浸粉0-1％，无水硫酸镁0-0.5％，磷酸氢二钾0-0.5％，磷酸二氢钾0-0.5％，罗丹明B 0-2％，橄榄油乳化液1％-3％，琼脂1％-3％。所述橄榄油乳化液是用三倍体积的2％(w/v)的聚乙烯醇乳化一倍体积的橄榄油而制得。
作为优选，所述罗丹明B选择性培养基包括下列各组分：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，无水硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.05％，磷酸二氢钾0.05％，罗丹明B 1％，橄榄油乳化液1％，琼脂2％。
作为优选，橄榄油选择性培养基包括以下质量百分比的组分：胰蛋白胨0-2％，酵母浸粉0-1％，无水硫酸镁0-0.5％，磷酸氢二钾0-0.5％，磷酸二氢钾0-0.5％，橄榄油乳化液1％-3％，琼脂1％-3％。所述橄榄油乳化液是用三倍体积的2％(w/v)的聚乙烯醇乳化一倍体积的橄榄油而制得。
作为优选，所述橄榄油选择性培养基的组分为：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，无水硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.05％，磷酸二氢钾 0.05％，橄榄油乳化液1％，琼脂2％。
作为优选，富集培养液进行初筛时需要稀释，稀释倍数为 10-6-10-10。
本发明进一步提供了上述贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx在制备虾青素酯酶中的应用。
作为优选，所述贝莱斯芽孢杆菌通过发酵得到所述虾青素酯酶；发酵培养基包括以下质量百分比的组分：葡萄糖0.2％～1.2％和/或 Mg2+0.05％～0.3％。
针对于本发明中的贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx，在使用上述含量的葡萄糖和Mg2+进行发酵后所得到的虾青素酯酶的性能更优，在应用于虾青素单体制备时，会对虾青素单体的得率具有较大的协同提升作用。其他常见碳源则不具有这种协同效果，其中，果糖的使用甚至会降低虾青素单体得率。同样的，其他金属离子(如Cu2+、Mn2+、Fe2+等) 的使用也会降低这种协同效果进而影响虾青素单体得率。
本发明同时提供了使用贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx发酵得到虾青素脂肪酶的方法。
作为优选，所述发酵培养基中还包括酵母浸粉；优选所述酵母浸粉的添加量为0.2％-1.0％。
在上述方案的基础上，酵母浸粉的选用会进一步增强虾青素酯酶的性能，进而提升虾青素单体得率，其他常见氮源如胰蛋白胨、牛肉膏等的效果则远不如酵母浸粉。
所述发酵培养基的组分如下：葡萄糖0.5～1.0％、酵母浸粉 0.3～0.8％、无水硫酸镁0.1～0.2％、NH4SO4 0.05～0.20％、K2HPO4 0.05～0.20％。
优选为葡萄糖0.8％、酵母浸粉0.6％、无水硫酸镁0.125％、NH4SO4 0.10％、K2HPO40.10％。
使用上述发酵培养基时，对虾青素酯酶的性能提升达到最优。
作为优选，所述贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx的接种量为1～2％；优选为1.5％。
作为优选，装瓶量为30～50％；优选为30％。
作为优选，培养温度为32～40℃；优选为37℃。
作为优选，通过摇床进行发酵培养，所述摇床的转速为 180～220r/min；优选为200r/min。
作为优选，所得的发酵产物在8000～10000r/min条件下离心10～15 min，收集发酵上清液。
作为优选，采用滴定法对所得的虾青素酯酶进行酶活测定，并对筛选得到的菌株进行形态学和分子生物学鉴定。
本发明进一步提供上述方法制备而成的虾青素酯酶。
本发明进一步提出了上述贝莱斯芽孢杆菌或虾青素酯酶在制备虾青素单体中的应用。
本发明进一步提供使用上述虾青素酯酶制备虾青素单体的方法，将所述虾青素酯酶加入含有虾青素酯的原料中进行水解反应即得；所述虾青素酯酶按2～10U/微克总类胡萝卜素添加；优选为4～6U/微克总类胡萝卜素。更优选为6U/微克总类胡萝卜素的情况下，虾青素得率最高。
优选地，所述含有虾青素酯的原料在水解反应前经过乳化剂乳化，所述乳化剂选用吐温-80；优选所述吐温-80与原料粗提物油剂按质量比1:1添加。
优选原料乳化物的浓度为250μg/mL时，水解反应得到的虾青素单体得率最高。
虾青素酯酶是一种具有界面活性的酶，需对底物进行前处理，添加乳化剂进行乳化，制备乳化物。
优选地，所述含有虾青素酯的原料来源于水生动物、水产品的废弃物、雨生红球藻或红发夫酵母。
优选地，水解反应的条件为：150-200r/min转速下28℃-35℃反应 4-6h，反应体系为pH 6.0-8.0的磷酸缓冲液。
优选反应温度为30℃，反应体系为pH 7.0的0.1M磷酸缓冲液时，对虾青素制备最有利。
优选地，所述方法还包括色素的提取及高效液相色谱(HPLC) 检测：定时取水解产物进行色素的提取，并通过HPLC对虾青素单体的含量进行检测。
作为优选，通过HPLC对虾青素单体含量进行检测，最佳检测条件为：色谱柱为反相C18柱；流动相为乙腈：乙酸乙酯：水＝63:30:7；流速为1mL/min；检测波长为474nm；检测柱温为35℃。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种贝莱斯芽孢菌，应用于虾青素酯酶的制备时，由于贝莱斯芽孢菌属于原核生物，发酵过程快，产酶效率高，可快速高效地得到虾青素酯酶；进一步应用于虾青素单体的制备时，可以高效降解虾青素酯并得到虾青素单体，提供了一种绿色高效、副产物少的催化途径，为虾青素单体的制备与推广提供了技术基础。
附图说明
图1为虾青素酯酶高产菌株的革兰氏染色；
图2为虾青素酯酶高产菌株的芽孢染色图；
图3为虾青素酯酶高产菌株的系统发育树；
图4为底物水解前的HPLC检测图；
图5为底物水解后的HPLC检测图；
图6为对比例1底物水解后的HPLC检测图；
图7为对比例2底物水解后的HPLC检测图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
虾青素酯酶高产菌株的筛选
称取1g土样，加入至10mL 0.9％无菌生理盐水中，在200r/min 的条件下充分振荡，静置后取1mL上清液于50mL富集培养基中，37℃、200r/min恒温振荡培养24h，取1mL转接于新的富集培养基中进行第二次富集，在同等条件下培养24h后进行第三次富集，得到富集菌液。
富集培养基包括下列各组分：蔗糖0.02％，酵母浸粉0.02％，氯化钠0.05％，磷酸氢二钠0.35％，硫酸铵0.15％，磷酸氢二钾0.15％，无水硫酸镁0.05％，橄榄油乳化液1％。
将富集菌液按梯度稀释至10-6倍浓度，菌液均匀涂布于罗丹明B 选择培养基上进行初筛，37℃恒温振荡培养3-4d，观察菌落周围是否有荧光圈，荧光圈直径越大则表明菌株产虾青素酯酶能力越强。
罗丹明B选择性培养基包括下列各组分：胰蛋白胨1％，酵母浸粉 0.5％，无水硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.05％，磷酸二氢钾0.05％，罗丹明B 1％，橄榄油乳化液1％，琼脂2％。
挑取荧光圈较大的菌株于发酵培养基中进行培养，37℃培养24h 后，取等体积等OD值的菌液于橄榄油选择性培养基上进行复筛，37℃恒温振荡培养3-4d，观察菌落周围是否有透明圈，透明圈直径越大则表明菌株产虾青素酯酶能力越强。
所述橄榄油选择性培养基的组分为：胰蛋白胨1％，酵母浸粉 0.5％，无水硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.05％，磷酸二氢钾0.05％，橄榄油乳化液1％，琼脂2％。
挑取透明圈较大的菌株于发酵培养基中，37℃培养24h后，在平板上进行划线纯化，挑取单菌落在发酵培养基中发酵培养。
实施例2
高产虾青素酯酶菌株的酶活测量
本实施例酶活测量采用的方法为滴定法。
将橄榄油乳化液作为反应的底物。向反应体系中加入50mL磷酸缓冲液、40mL橄榄油乳化液，混匀后于40℃水浴反应5min后取出，向反应体系中加入10mL离心后的发酵上清液，混匀后于40℃水浴反应15min后取出，加入15mL 95％无水乙醇终止反应，加入1％酚酞指示剂两滴，用0.05mmol/L氢氧化钠标准溶液进行滴定，直至微红色并保持30s不褪色为滴定终点，记录消耗0.05mmol/L氢氧化钠标准溶液的体积。
x＝(Vt–V0)·N/Vm·t
式中x为样品的酶活力，单位为U/mL；Vt为滴定样品时消耗氢氧化钠的体积，单位为mL；V0为滴定空白时消耗氢氧化钠的体积；N 为稀释倍数；Vm为所添加上清液的体积；t为反应的时间。
实施例3
高产虾青素酯酶菌株的形态学鉴定
取实施例1中筛选得到的菌株少量在发酵培养基中发酵培养，37℃培养24h稀释后涂布于固体平板上，37℃培养，观察单菌落形态、大小、边缘、表面、透明度等，并对其进行革兰氏染色，观察光学显微镜下菌株的形态特征。
菌落形态特征：圆形齐整，光滑湿润菌落，稍隆起。菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性，形成芽孢，不膨大。革兰氏染色见图1，芽孢染色见图2。
实施例4
菌株的分子生物学鉴定
对菌株进行DNA的提取，提取后，以菌株总DNA为模板，利用正向引物27f和反向引物1492r进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为 (30μL)：mix 15μL、上下引物各1μL、模板2μL、ddH2O 11μL。 PCR反应的条件为：95℃预变性10min，95℃变性40s，50℃退火40s， 72℃延伸90s，进行30个循环，72℃终延伸10min。PCR反应后产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳在标准条件下进行检测并测序。
将测序结果与GenBank中收录的其他菌种的序列进行比对分析。利用NCBI进行检索对比，将所测序菌株的16S rDNA序列与GenBank 数据库中已知菌种的16S rDNA序列进行同源性比较，寻找与该菌株基因序列同源性最高的已知的菌种，从GenBank数据库中，提取已知的菌属标准菌株的16S rDNA基因序列，与目的菌株的16S rDNA序列一起，利用MEGA7.0软件在进化水平上对菌株进行分析，以确定菌种分类并绘制系统发育树。系统发育树见图3，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，并命名为Lpl-wx。
实施例5
贝莱斯芽孢杆菌LPL-WX发酵产虾青素酯酶
一种虾青素酯酶的制备方法，将贝莱斯芽孢杆菌LPL-WX(保藏编号为CGMCCNo.17045)接种于发酵培养基中，接种量为1.5％，装瓶量为30％，摇床培养，200r/min，37℃培养36h，发酵结束后在10000 r/min条件下离心10min收集上清液，用滴定法测定其酶活力为32.54U /mL。
上述发酵培养基主要成分为：葡萄糖0.8％、酵母浸粉0.6％、无水硫酸镁0.125％、NH4SO4 0.10％、K2HPO4 0.10％，上述各组分的百分比均为质量百分比。
实施例6
虾青素酯的水解反应
使用实施例5中制得的虾青素酯酶制备虾青素单体的方法如下：取0.1g雨生红球藻粗提物油剂于研钵中，其天然左旋虾青素可达5％，按质量比1:1添加吐温-80，研磨乳化，研磨过程中添加0.1M磷酸缓冲液(pH 7.0)，定容至10mL。按照每微克总类胡萝卜素加入6U虾青素酯酶的量添加虾青素酯乳化物与虾青素酯酶，混匀后于180r/min、 30℃条件下进行振荡培养7h。水解反应结束后，取少量水解产物于离心管中，加入与水解产物等体积丙酮振荡30s，使其充分混合后，加入等体积正己烷振荡30s，使其充分混合后，12000r/min离心1min，取上清液过滤后待用。
通过高效液相色谱法检测，图4为底物水解前的HPLC检测图；图 5为底物水解后的HPLC检测图；其中峰1为游离虾青素，峰2-13为虾青素酯；得到虾青素酯降解率为98.2％，虾青素单体得率为43.2％。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，使用等量果糖作为碳源。制得虾青素酯酶后，用滴定法测定其酶活力为5.84U/mL。
进而使用该酶通过与实施例2相同的方法制备虾青素单体，通过高效液相色谱法检测得到虾青素酯降解率为86.43％，虾青素单体得率为32.12％(图6)。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，使用等量Cu2+替换Mg2+。制得虾青素酯酶后，用滴定法测定其酶活力为7.43U/mL。
进而使用该酶通过与实施例2相同的方法制备虾青素单体，通过高效液相色谱法检测得到虾青素酯降解率为89.32％，虾青素单体得率为32.57％(图7)。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Lpl-wx的保藏编号为CGMCC No.17045。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，取土样进行富集培养后得到富集培养液，所述富集培养液通过罗丹明B选择性培养基进行初筛，再通过橄榄油选择性培养基进行复筛后得到。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，富集培养基中包括以下质量百分比的组分：蔗糖0-1％，酵母浸粉0-1％，氯化钠0-1％，磷酸氢二钠0-1％，硫酸铵0-1％，磷酸氢二钾0-1％，无水硫酸镁0-0.5％，橄榄油乳化液1％-3％；
所述罗丹明B选择性培养基包括以下质量百分比的组分：胰蛋白胨0-2％，酵母浸粉0-1％，无水硫酸镁0-0.5％，磷酸氢二钾0-0.5％，磷酸二氢钾0-0.5％，罗丹明B0-2％，橄榄油乳化液1％-3％，琼脂1％-3％；
所述橄榄油选择性培养基包括以下质量百分比的组分：胰蛋白胨0-2％，酵母浸粉0-1％，无水硫酸镁0-0.5％，磷酸氢二钾0-0.5％，磷酸二氢钾0-0.5％，橄榄油乳化液1％-3％，琼脂1％-3％。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备虾青素酯酶中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌通过发酵得到所述虾青素酯酶。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵培养基包括以下质量百分比的组分：Mg2+0.05％～0.1％和/或葡萄糖0.2％～0.6％。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的组分如下：葡萄糖0.8％、酵母浸粉0.6％、无水硫酸镁0.125％、NH4SO4 0.10％、K2HPO4 0.10％。
8.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备虾青素单体中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌制成虾青素酯酶之后，对虾青素酯乳化物进行水解反应得到虾青素单体。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述虾青素酯酶按4～9U/微克总类胡萝卜素添加；优选为6U/微克总类胡萝卜素。
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