CN111778227B - 一种虾青素酯酶及虾青素单体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种虾青素酯酶及虾青素单体的制备方法。所述虾青素酯酶由贝莱斯芽孢杆菌Lpl‑wx发酵即得，所述贝莱斯芽孢杆菌Lpl‑wx的保藏编号为CGMCC No.17045。本发明提供了一种绿色高效的虾青素酯酶，并通过对该酶的制备过程的优化，进一步提高了其对虾青素酯的降解作用，使得降解率达到98.2％的同时，虾青素单体得率达到43.2％。

Description

一种虾青素酯酶及虾青素单体的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种虾青素酯酶及虾青素单体的制备方法。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)，又名虾黄素、虾黄质，是从河鳌虾外壳和鲑鱼中发现的一种红色的天然类胡萝卜素含氧衍生物，化学名称为 3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β-胡萝卜素。虾青素不仅具有极强的抗氧化活性，同时还具有抗癌、增强免疫及着色等多方面功能，广泛应用于功能食品、医药、化妆品和饲料等的生产中。
虾青素在环境中主要以游离态的虾青素单体和虾青素酯两种形式存在。游离态的虾青素单体极不稳定，易被氧化；虾青素酯相对稳定，在生物体内多以虾青素酯的形式存在。雨生红球藻作为虾青素规模化生产的主要来源，对虾青素的积累量和积累速率远高于其它绿藻类，所含虾青素主要以虾青素酯形式存在，游离虾青素含量极少。虾青素酯在生物体内的吸收和功能不如游离的虾青素单体，因此，探索将虾青素酯转化为游离虾青素的工艺，有利于提高虾青素应用的生物效价，并且为开发具有新的生理功能的虾青素衍生物奠定基础。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种虾青素酯酶及其制备方法和应用。
本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种虾青素酯酶的制备方法，由贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillusvelezensis)Lpl-wx发酵即得，所述贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx于2018年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(保藏单位全称及简称)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 17045。
本发明采用生物方法发酵制酶，制备过程绿色高效，副产物少。尤其是本发明所采用的贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx属于原核生物，发酵过程快速高效，降低了时间成本，更有利于推广。
作为优选，发酵过程中使用的发酵培养基中包括以下质量百分比的组分：葡萄糖0.2％～1.2％和/或Mg2+0.05％～0.3％。
针对于本发明中的贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx，在使用上述含量的葡萄糖和Mg2+进行发酵后所得到的虾青素酯酶的性能更优，在应用于虾青素单体制备时，会对虾青素单体的得率具有较大的协同提升作用。其他常见碳源则不具有这种协同效果，其中，果糖的使用甚至会降低虾青素单体得率。同样的，其他金属离子(如Cu2+、Mn2+、Fe2+等) 的使用也会降低这种协同效果进而影响虾青素单体得率。
作为优选，所述发酵培养基中还包括酵母浸粉；优选所述酵母浸粉的添加量为0.2％-1.0％。
在上述方案的基础上，酵母浸粉的选用会进一步增强虾青素酯酶的性能，进而提升虾青素单体得率，其他常见氮源如胰蛋白胨、牛肉膏等的效果则远不如酵母浸粉。
所述发酵培养基的组分如下：葡萄糖0.5～1.0％、酵母浸粉 0.3～0.8％、无水硫酸镁0.1～0.2％、NH4SO4 0.05～0.20％、K2HPO4 0.05～0.20％。
优选为葡萄糖0.8％、酵母浸粉0.6％、无水硫酸镁0.125％、NH4SO4 0.10％、K2HPO40.10％。
使用上述发酵培养基时，对虾青素酯酶的性能提升达到最优。
作为优选，所述贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx的接种量为1～2％；优选为1.5％。
作为优选，装瓶量为30～50％；优选为30％。
作为优选，培养温度为32～40℃；优选为37℃。
作为优选，通过摇床进行发酵培养，所述摇床的转速为 180～220r/min；优选为200r/min。
本发明进一步提供上述方法制备而成的虾青素酯酶。
本发明进一步提供使用上述虾青素酯酶制备虾青素单体的方法，将所述虾青素酯酶加入含有虾青素酯的原料中进行水解反应即得；所述虾青素酯酶按2～10U/微克总类胡萝卜素添加；优选为4～6U/微克总类胡萝卜素。更优选为6U/微克总类胡萝卜素的情况下，虾青素得率最高。
优选地，所述含有虾青素酯的原料在水解反应前经过乳化剂乳化，所述乳化剂选用吐温-80；优选所述吐温-80与原料粗提物油剂按质量比1:1添加。
优选原料乳化物的浓度为250μg/mL时，水解反应得到的虾青素单体得率最高。
虾青素酯酶是一种具有界面活性的酶，需对底物进行前处理，添加乳化剂进行乳化，制备乳化物。
优选地，所述含有虾青素酯的原料来源于水生动物、水产品的废弃物、雨生红球藻或红发夫酵母。
优选地，水解反应的条件为：150-200r/min转速下28℃-35℃反应 4-6h，反应体系为pH6.0-8.0的磷酸缓冲液。
优选反应温度为30℃，反应体系为pH7.0的0.1M磷酸缓冲液时，对虾青素制备最有利。
优选地，所述方法还包括色素的提取及高效液相色谱(HPLC) 检测：定时取水解产物进行色素的提取，并通过HPLC对虾青素单体的含量进行检测。
本发明有益效果如下：本发明提供了一种绿色高效的虾青素酯酶的制备方法，并通过对该酶的制备过程的优化，进一步提升了该酶的性能，进而提高了其对虾青素酯的降解作用，使得降解率达到98.2％的同时，虾青素单体得率达到43.2％。
附图说明
图1为底物水解前的HPLC检测图；
图2为底物水解后的HPLC检测图；
图3为对比例1底物水解后的HPLC检测图；
图4为对比例2底物水解后的HPLC检测图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一种虾青素酯酶的制备方法，将贝莱斯芽孢杆菌LPL-WX(保藏编号为CGMCCNo.17045)接种于发酵培养基中，接种量为1.5％，装瓶量为30％，摇床培养，200r/min，37℃培养36h，发酵结束后在10000 r/min条件下离心10min收集上清液，用滴定法测定其酶活力为32.54U /mL。
上述发酵培养基主要成分为：葡萄糖0.8％、酵母浸粉0.6％、无水硫酸镁0.125％、NH4SO4 0.10％、K2HPO4 0.10％，上述各组分的百分比均为质量百分比。
实施例2
使用实施例1中制得的虾青素酯酶制备虾青素单体的方法如下：
取0.1g雨生红球藻粗提物油剂于研钵中，其天然左旋虾青素可达 5％，按质量比1:1添加吐温-80，研磨乳化，研磨过程中添加0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)，定容至10mL。按照每微克总类胡萝卜素加入6 U 虾青素酯酶的量添加虾青素酯乳化物与虾青素酯酶，混匀后于180 r/min、30℃条件下进行振荡培养7h。水解反应结束后，取少量水解产物于离心管中，加入与水解产物等体积丙酮振荡30s，使其充分混合后，加入等体积正己烷振荡30s，使其充分混合后，12000r/min离心1min，取上清液过滤后待用。
通过高效液相色谱法检测，图1为底物水解前的HPLC检测图；图 2为底物水解后的HPLC检测；其中峰1为游离虾青素，峰2-13为虾青素酯；得到虾青素酯降解率为98.2％，虾青素单体得率为43.2％。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，使用等量果糖作为碳源。制得虾青素酯酶后，用滴定法测定其酶活力为5.84 U/mL。
进而使用该酶通过与实施例2相同的方法制备虾青素单体，通过高效液相色谱法检测得到虾青素酯降解率为86.43％，虾青素单体得率为32.12％(图3)。
对比例2
本对比例本对比例与实施例1的区别在于，使用等量Cu2+替换 Mg2+。制得虾青素酯酶后，用滴定法测定其酶活力为7.43 U/mL。
进而使用该酶通过与实施例2相同的方法制备虾青素单体，通过高效液相色谱法检测得到虾青素酯降解率为89.32％，虾青素单体得率为32.57％(图4)。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种虾青素酯酶的制备方法，其特征在于，由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Lpl-wx发酵结束后收集上清液即得，所述贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx的保藏编号为CGMCC No.17045。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵采用的发酵培养基中还包括酵母浸粉。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酵母浸粉的添加量为0.2％-0.6％。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分如下：葡萄糖0.8％、酵母浸粉0.6％、无水硫酸镁0.125％、NH4SO4 0.10％、K2HPO4 0.10％。
5.根据权利要求1、2、3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx的接种量为1～2％。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx的接种量为1～2％。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx的接种量为1.5％。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌Lpl-wx的接种量为1.5％。
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