JP2663039B2 - スクアレンの微生物による製造法及び微生物 - Google Patents
スクアレンの微生物による製造法及び微生物Info
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- microorganisms
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はスクアレンの製造法に関し、さらに詳細には
微生物を用いたスクアレンの製造法に関する。スクアラ
ンは化粧品のベースオイル等に使用されるスクアレンの
原料である。スクアレンはC30H50であらわされる不飽和
の炭化水素でこのスクアレンを水素添加することにより
スクアランを得ることができる。またスクアレンは健康
食品としても利用されている。
微生物を用いたスクアレンの製造法に関する。スクアラ
ンは化粧品のベースオイル等に使用されるスクアレンの
原料である。スクアレンはC30H50であらわされる不飽和
の炭化水素でこのスクアレンを水素添加することにより
スクアランを得ることができる。またスクアレンは健康
食品としても利用されている。
（従来技術および発明が解決しよとする問題点） スクアレンはアイザメ、タロウザメなどの深海鮫の肝
臓より製造されるサメ肝油より抽出精製しているが鮫は
自然界より捕獲されるので、その漁獲高は極めて不安定
であり、したがって、スクアレンの供給不安および価格
の大幅な変動が避けられなかった。また、日本近海で捕
獲される鮫では海洋汚染の影響により精製不能の化学物
質が鮫肝油中にふくまれているため使用できないといわ
れている。
臓より製造されるサメ肝油より抽出精製しているが鮫は
自然界より捕獲されるので、その漁獲高は極めて不安定
であり、したがって、スクアレンの供給不安および価格
の大幅な変動が避けられなかった。また、日本近海で捕
獲される鮫では海洋汚染の影響により精製不能の化学物
質が鮫肝油中にふくまれているため使用できないといわ
れている。
そこで、天然物を原料としないスクアレンの製造法が
望まれ、微生物によるスクアレンの生産方法が考案され
ている。その一つはモルテイエレラ属の糸状菌による方
法（特公昭59−20356）であるが、糸状菌のスクアレン
含有量は最高19.3mg/g菌体と低くまたは培養の点でも生
産性が低いという欠点があった。他の方法として、細菌
による方法（特開昭61−212290）が提案されているが、
これも細菌の菌体あたりの含有量が最高1.48mg/g菌体と
低く実用化されていない。
望まれ、微生物によるスクアレンの生産方法が考案され
ている。その一つはモルテイエレラ属の糸状菌による方
法（特公昭59−20356）であるが、糸状菌のスクアレン
含有量は最高19.3mg/g菌体と低くまたは培養の点でも生
産性が低いという欠点があった。他の方法として、細菌
による方法（特開昭61−212290）が提案されているが、
これも細菌の菌体あたりの含有量が最高1.48mg/g菌体と
低く実用化されていない。
（問題点を解決するための手段） 本発明は、このような技術の現状に鑑みてなされたも
のであって、スクアレンの工業的製法を確立する目的で
なされたものである。
のであって、スクアレンの工業的製法を確立する目的で
なされたものである。
上記目的達成のために各方面から検討した結果、深海
鮫等天然物からの抽出については原料供給の面及び天然
資源保護の面から適当でないと判断し、工業的にスクア
レンを大量生産するには微生物を利用する方法が適当で
あると判断するに至った。
鮫等天然物からの抽出については原料供給の面及び天然
資源保護の面から適当でないと判断し、工業的にスクア
レンを大量生産するには微生物を利用する方法が適当で
あると判断するに至った。
そこで、本発明者らは微生物によりスクアレンを生産
しようとして、代謝経路を調べたところスクアレンはカ
ビ、酵母等の真核生物の中間代謝物として広く生物体内
に存在するという知見を得た。
しようとして、代謝経路を調べたところスクアレンはカ
ビ、酵母等の真核生物の中間代謝物として広く生物体内
に存在するという知見を得た。
そしてこの知見に基づき、スクアレンを菌体内で変換
する酵素スクアレンエポキシダーゼの活性の低下もしく
は喪失した微生物を変異誘発することによりスクアレン
が菌体内に蓄積する微生物を得、このような微生物を大
量培養した後、該微生物を回収し、回収微生物菌体内よ
りスクアレンを抽出することにより、問題点を解決する
こととした。
する酵素スクアレンエポキシダーゼの活性の低下もしく
は喪失した微生物を変異誘発することによりスクアレン
が菌体内に蓄積する微生物を得、このような微生物を大
量培養した後、該微生物を回収し、回収微生物菌体内よ
りスクアレンを抽出することにより、問題点を解決する
こととした。
そして各種微生物についてスクリーニングをくり返し
た結果、本発明者らはスクアレンの菌体あたり含有量が
飛躍的に高い微生物を変異誘発することに成功し、ここ
に本発明を完成するに至った。
た結果、本発明者らはスクアレンの菌体あたり含有量が
飛躍的に高い微生物を変異誘発することに成功し、ここ
に本発明を完成するに至った。
以下に本発明を詳述する。
スクアレンはカビ、酵母のような真核生物の菌体中で
はアセチル−CoAを基点としてメバロン酸を経由してス
クアレンに変換された最終的にはエルゴステロールに至
る代謝経路の中間生産物である。この代謝経路において
スクアレンは酵素スクアレンエポキシダーゼによりスク
アレンエポキシサイドに変換される。スクアレンエポキ
シダーゼの活性が低下もしくは喪失した微生物はその生
物のエルゴステロール要求量が満たされないためフィー
ドバック制御が行われず、結果的に多量のスクアレンが
蓄積することになる。
はアセチル−CoAを基点としてメバロン酸を経由してス
クアレンに変換された最終的にはエルゴステロールに至
る代謝経路の中間生産物である。この代謝経路において
スクアレンは酵素スクアレンエポキシダーゼによりスク
アレンエポキシサイドに変換される。スクアレンエポキ
シダーゼの活性が低下もしくは喪失した微生物はその生
物のエルゴステロール要求量が満たされないためフィー
ドバック制御が行われず、結果的に多量のスクアレンが
蓄積することになる。
本発明は、このような微生物、つまりスクアレンのパ
スウエイにおいて、スクアレンエポキシダーゼ（スクア
レンモノオキシゲナーゼ（1.14.99.7））活性を低下な
いし喪失せしめる等によって、スクアレンエポキシサイ
ド（2,3−オキシドスクアレン）への代謝経路が遮断及
び／又は抑制された微生物を使用するものである。本発
明においては、酵素スクアレンエポキシダーゼの阻害の
みでなく、スクアレンから2,3−オキシドスクアレンへ
の反応に必要な NADPH＋O2→NADP+ という補酵素の反応を阻害する等により、スクアレンエ
ポキサイドへのパスウエイが遮断及び／又は抑制せしめ
られた酵母や糸状菌等真核微生物であれば、適宜使用す
ることができる。
スウエイにおいて、スクアレンエポキシダーゼ（スクア
レンモノオキシゲナーゼ（1.14.99.7））活性を低下な
いし喪失せしめる等によって、スクアレンエポキシサイ
ド（2,3−オキシドスクアレン）への代謝経路が遮断及
び／又は抑制された微生物を使用するものである。本発
明においては、酵素スクアレンエポキシダーゼの阻害の
みでなく、スクアレンから2,3−オキシドスクアレンへ
の反応に必要な NADPH＋O2→NADP+ という補酵素の反応を阻害する等により、スクアレンエ
ポキサイドへのパスウエイが遮断及び／又は抑制せしめ
られた酵母や糸状菌等真核微生物であれば、適宜使用す
ることができる。
本発明に係る例えばスクアレンエポキシダーゼ活性の
低下もしくは欠失した微生物を得るためには、微生物の
変異誘発処理を行う。変異誘発処理としては、常法が使
用され、例えば紫外線、Ｘ線、γ線、温度変化といった
電磁波等物理的な方法のほか、ナイトロジェンマスター
ド等のクロルエチルアミン系化合物、エチレンイミン系
化合物、スルホン酸エステル系化合物、ジエポキシブタ
ン、コルヒチン、過酸化物、プリン系化合物といったア
ルキル化剤その他の薬剤を用いる化学的な方法が適宜使
用される。このような方法によって突然変異を誘発せし
め、目的とする微生物をスクリーニングするのである。
低下もしくは欠失した微生物を得るためには、微生物の
変異誘発処理を行う。変異誘発処理としては、常法が使
用され、例えば紫外線、Ｘ線、γ線、温度変化といった
電磁波等物理的な方法のほか、ナイトロジェンマスター
ド等のクロルエチルアミン系化合物、エチレンイミン系
化合物、スルホン酸エステル系化合物、ジエポキシブタ
ン、コルヒチン、過酸化物、プリン系化合物といったア
ルキル化剤その他の薬剤を用いる化学的な方法が適宜使
用される。このような方法によって突然変異を誘発せし
め、目的とする微生物をスクリーニングするのである。
これに対して、スクアレンエポキシダーゼ活性が低下
もしくは喪失していない自然のままの微生物にあって
は、スクアレンの菌体当りの含有量はきわめて低く、例
えば、Candida albicans 0.14mg/g菌体、Saccharomyces
cerevisiae 5.10mg/g菌体、Aspergillus niger 0.24mg
/g菌体であって、工業的に利用するにはあまりにも低く
すぎ、利用価値がないのである。
もしくは喪失していない自然のままの微生物にあって
は、スクアレンの菌体当りの含有量はきわめて低く、例
えば、Candida albicans 0.14mg/g菌体、Saccharomyces
cerevisiae 5.10mg/g菌体、Aspergillus niger 0.24mg
/g菌体であって、工業的に利用するにはあまりにも低く
すぎ、利用価値がないのである。
上記により変異誘発を行ってスクアレンを菌体内に著
量蓄積する微生物をスクリーニングによって分離する。
本発明においてはこれらの微生物を利用してスクアレン
を製造するのであるが、これら本発明において使用する
微生物としては、 Saccharomyces、Pichia、Hansenula、Debaryomyces、En
domycopsis、Nadsonia、Candida、Kloeckera、Cryptoco
ccus、Torulopsis、Trichosporon、Rhodotorula等の各
属に属する酵母のほか、Aspergillus、Rhizopus、Penec
illium等の各属に属する糸状菌その他の真核微生物が適
宜用いられるが、培養の生産性からみて酵母がより好適
である。
量蓄積する微生物をスクリーニングによって分離する。
本発明においてはこれらの微生物を利用してスクアレン
を製造するのであるが、これら本発明において使用する
微生物としては、 Saccharomyces、Pichia、Hansenula、Debaryomyces、En
domycopsis、Nadsonia、Candida、Kloeckera、Cryptoco
ccus、Torulopsis、Trichosporon、Rhodotorula等の各
属に属する酵母のほか、Aspergillus、Rhizopus、Penec
illium等の各属に属する糸状菌その他の真核微生物が適
宜用いられるが、培養の生産性からみて酵母がより好適
である。
本発明にしたがってスクアレンを製造するには、先ず
はじめに上記によって変異誘発してスクアレンを著量著
積する微生物を得て、これを培養して、菌体を増殖させ
ねばならない。これら微生物の培養は好気条件下で通常
の微生物の培養と同様に行えばよい。
はじめに上記によって変異誘発してスクアレンを著量著
積する微生物を得て、これを培養して、菌体を増殖させ
ねばならない。これら微生物の培養は好気条件下で通常
の微生物の培養と同様に行えばよい。
したがって、振とう培養ないし通気攪拌培養を行えば
よく、また特に大量培養する場合には予じめ少量の培地
で前培養した後に大きなタンクで生産培養してもよい。
培養温度も25℃より45℃の範囲で微生物の成育によい温
度を選べば良く、倍地も炭素源としてグルコース、シュ
ークロース、廃糖蜜、澱粉等の炭水化物を使用すればよ
く、窒素源も硫安、硝安、アンモニア等でよく特殊な化
合物は必要ではない。これは、他の栄養源についても同
じである。このように本発明においては、通常の培養装
置、培養条件がそのまま利用することができ、格別の装
置、条件が必要ないことも本発明の特筆すべき利点のひ
とつである。
よく、また特に大量培養する場合には予じめ少量の培地
で前培養した後に大きなタンクで生産培養してもよい。
培養温度も25℃より45℃の範囲で微生物の成育によい温
度を選べば良く、倍地も炭素源としてグルコース、シュ
ークロース、廃糖蜜、澱粉等の炭水化物を使用すればよ
く、窒素源も硫安、硝安、アンモニア等でよく特殊な化
合物は必要ではない。これは、他の栄養源についても同
じである。このように本発明においては、通常の培養装
置、培養条件がそのまま利用することができ、格別の装
置、条件が必要ないことも本発明の特筆すべき利点のひ
とつである。
ただ本発明において、通常用いられる培地組成物と異
なる物質としてエルゴステロール、コレステロール、ラ
ノステロール、カンペステロール、シトステロールの添
加が必要なことである。このステロール類は各単独で
も、混合しても良い。また、これらを含有する物質たと
えば大豆油のようなものでも良い。このステロール類の
倍地への添加は微生物のエルゴステロール代謝経路を遮
断もしくは狭隘にすることでスクアレンを蓄積させた結
果、生物に必須のエルゴステロールを欠除もしくは不足
させた必要量を補給するためのものである。
なる物質としてエルゴステロール、コレステロール、ラ
ノステロール、カンペステロール、シトステロールの添
加が必要なことである。このステロール類は各単独で
も、混合しても良い。また、これらを含有する物質たと
えば大豆油のようなものでも良い。このステロール類の
倍地への添加は微生物のエルゴステロール代謝経路を遮
断もしくは狭隘にすることでスクアレンを蓄積させた結
果、生物に必須のエルゴステロールを欠除もしくは不足
させた必要量を補給するためのものである。
この変異誘発させた微生物を培養後、培養物（菌体、
培養液）からスクアレンを回収するのであるが、回収す
る手段も公知の濾過、遠心分離等の固液分離の方法でよ
く、こうして得られた菌体をそのままもしくは乾燥させ
てあるいは培養液を抽出する。抽出する溶剤は乾燥菌体
より抽出する場合はｎ−ヘキサン、石油エーテルのよう
な極性の低い溶媒を使用すれば抽出効率がよいが、水と
菌体の混合物に溶剤を入れてスクアレンを抽出する場合
は、塩化メチレン・メタノールやエタノール・ｎ−ヘキ
サンのような混合溶媒を使用しないと抽出効率が悪い。
この溶媒に溶解したスクアレンを単独でとりだすには蒸
留して溶媒を除去し、得られた粗スクアレンを減圧蒸留
すれば高純度のスクアレンを得ることができる。必要あ
る場合は抽出に先立ち、菌体を超音波等で破壊してもよ
い。
培養液）からスクアレンを回収するのであるが、回収す
る手段も公知の濾過、遠心分離等の固液分離の方法でよ
く、こうして得られた菌体をそのままもしくは乾燥させ
てあるいは培養液を抽出する。抽出する溶剤は乾燥菌体
より抽出する場合はｎ−ヘキサン、石油エーテルのよう
な極性の低い溶媒を使用すれば抽出効率がよいが、水と
菌体の混合物に溶剤を入れてスクアレンを抽出する場合
は、塩化メチレン・メタノールやエタノール・ｎ−ヘキ
サンのような混合溶媒を使用しないと抽出効率が悪い。
この溶媒に溶解したスクアレンを単独でとりだすには蒸
留して溶媒を除去し、得られた粗スクアレンを減圧蒸留
すれば高純度のスクアレンを得ることができる。必要あ
る場合は抽出に先立ち、菌体を超音波等で破壊してもよ
い。
スクアレンの同定は質量分析、核磁気共鳴スペクトル
により、スクアレンの定量はガスクロマトグラフィーで
行うことができる。
により、スクアレンの定量はガスクロマトグラフィーで
行うことができる。
（実施例） 以下本発明を実施例により説明するが、本発明はこれ
に限定されるものではない。
に限定されるものではない。
実施例１ Saccharomyces diastaticus MOY500株を滅菌水に懸濁
させ、滅菌箱中で殺菌灯をこの懸濁液に照射すること
で、紫外線による変異誘発を行った。照射後この懸濁液
を寒天培地にまいてコロニーを形成させ、エルゴステロ
ール要求の有無を調べた。求める変異株はエルゴステロ
ール要求性なので、エルゴステロール要求株をとり、30
℃、200rpmで液体培養して、菌体を回収し、塩化メチレ
ン・メタノールの混合溶媒で脂質を抽出して薄層クロマ
トによりスクアレンを簡易定量した。この変異方法によ
り得られた変異株のうちでスクアレンの蓄積量の多い株
３種をYPD倍地にエルゴステロール20μg/ml添加した培
地で30℃、200rpmで液体培養し、スクアレンの含有量を
ガスクロマトグラフィーで調べた。その結果は表１のよ
うであった。
させ、滅菌箱中で殺菌灯をこの懸濁液に照射すること
で、紫外線による変異誘発を行った。照射後この懸濁液
を寒天培地にまいてコロニーを形成させ、エルゴステロ
ール要求の有無を調べた。求める変異株はエルゴステロ
ール要求性なので、エルゴステロール要求株をとり、30
℃、200rpmで液体培養して、菌体を回収し、塩化メチレ
ン・メタノールの混合溶媒で脂質を抽出して薄層クロマ
トによりスクアレンを簡易定量した。この変異方法によ
り得られた変異株のうちでスクアレンの蓄積量の多い株
３種をYPD倍地にエルゴステロール20μg/ml添加した培
地で30℃、200rpmで液体培養し、スクアレンの含有量を
ガスクロマトグラフィーで調べた。その結果は表１のよ
うであった。
実施例２ S.diastaticus MOY 500株をリン酸緩衝液に懸濁さ
せ、EMSを加えて30℃で処理する。処理後チオ硫酸ソー
ダを加えて反応を停止させ、寒天培地にまいてコロニー
を形成させ、エルゴステロール要求の有無を調べた。求
める変異株はエルゴステロール要求性なので、エルゴス
テロール要求株をとり、30℃、200rpmで液体培養して、
菌体を回収し塩化メチレン・メタノールの混合溶媒で脂
質を抽出して薄層クロマトによりスクアレンを簡易定量
した。この変異方法により得られた変異株のうちでスク
アレンの蓄積量の多い株３種をYPD培地にエルゴステロ
ール20μg/ml添加した培地で30℃、200rpmで液体培養
し、スクアレンの含有量をガスクロマトグラフィーで調
べた。その結果は表２のようであった。
せ、EMSを加えて30℃で処理する。処理後チオ硫酸ソー
ダを加えて反応を停止させ、寒天培地にまいてコロニー
を形成させ、エルゴステロール要求の有無を調べた。求
める変異株はエルゴステロール要求性なので、エルゴス
テロール要求株をとり、30℃、200rpmで液体培養して、
菌体を回収し塩化メチレン・メタノールの混合溶媒で脂
質を抽出して薄層クロマトによりスクアレンを簡易定量
した。この変異方法により得られた変異株のうちでスク
アレンの蓄積量の多い株３種をYPD培地にエルゴステロ
ール20μg/ml添加した培地で30℃、200rpmで液体培養
し、スクアレンの含有量をガスクロマトグラフィーで調
べた。その結果は表２のようであった。
実施例３ 実施例２で示した変異株moy500−Ｕ−70−66−１をジ
ャーファーメンターで培養した。ぶどう糖２％、酵母エ
キス１％、ポリペプトン１％およびエルゴステロール4m
g/を含有する液体培地30mlに酵母moy500−Ｕ−70−66
−１株を接種し、30℃で18時間振盪培養した後、同じ組
成の液体培地300mlに接種し30℃で24時間振盪培養し
た。この培養液をぶどう糖２％、酵母エキス0.5％、尿
素0.6％、リン酸二カリ0.1％、硫酸マグネシウム0.1
％、硫酸マンガン0.05％、消泡剤KM−70 0.05％および
エルゴステロール4mg/を含有する液体培地３に接種
し、５ジャーファーメンターで温度30℃、通気量1.5
/minの条件下で120時間攪拌培養してスクアレンを製
造した。その結果を図１に示す。
ャーファーメンターで培養した。ぶどう糖２％、酵母エ
キス１％、ポリペプトン１％およびエルゴステロール4m
g/を含有する液体培地30mlに酵母moy500−Ｕ−70−66
−１株を接種し、30℃で18時間振盪培養した後、同じ組
成の液体培地300mlに接種し30℃で24時間振盪培養し
た。この培養液をぶどう糖２％、酵母エキス0.5％、尿
素0.6％、リン酸二カリ0.1％、硫酸マグネシウム0.1
％、硫酸マンガン0.05％、消泡剤KM−70 0.05％および
エルゴステロール4mg/を含有する液体培地３に接種
し、５ジャーファーメンターで温度30℃、通気量1.5
/minの条件下で120時間攪拌培養してスクアレンを製
造した。その結果を図１に示す。
なお、変異株moy500−Ｕ−70−66−１は、工業技術院
微生物工業技術研究所にFERM−P No.11454として寄託さ
れている。
微生物工業技術研究所にFERM−P No.11454として寄託さ
れている。
（発明の効果） 本発明によれば、深海鮫等天然物からの抽出によるこ
となく、新規に創製した変異微生物を用いる発酵法によ
ってスクアレンを大量に工業生産することができる。
となく、新規に創製した変異微生物を用いる発酵法によ
ってスクアレンを大量に工業生産することができる。
第１図は本発明によるスクアレンの製造を時間の経過と
ともに示したグラフである。
ともに示したグラフである。
Claims (6)
- 【請求項１】スクアレンを菌体内に蓄積するように変異
誘発した真核生物に属する微生物を培養して、その培養
物からスクアレンを採取することを特徴とするスクアレ
ンの微生物による製造法。 - 【請求項２】変異誘発された微生物が酵母であることを
特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の製造法。 - 【請求項３】変異誘発された微生物を、エルゴステロー
ル、コレステロール、ラノステロール、カンペステロー
ル、シトステロールより選ばれる一種または二種以上の
ステロールの存在下で培養することを特徴とする特許請
求の範囲第１項または第２項に記載の製造法。 - 【請求項４】スクアレンの代謝経路において、スクアレ
ンエポキサイドへのパスウエイを遮断及び／又は抑制す
る酵母。 - 【請求項５】酵母がサッカロミセス属に属することを特
徴とする特許請求の範囲第４項に記載の酵母。 - 【請求項６】酵母がサッカロミセス・ジアスタティクス
（Saccharomyces diastaticus）であることを特徴とす
る特許請求の範囲第４項または第５項に記載の酵母。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2141491A JP2663039B2 (ja) | 1990-06-01 | 1990-06-01 | スクアレンの微生物による製造法及び微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2141491A JP2663039B2 (ja) | 1990-06-01 | 1990-06-01 | スクアレンの微生物による製造法及び微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0436186A JPH0436186A (ja) | 1992-02-06 |
| JP2663039B2 true JP2663039B2 (ja) | 1997-10-15 |
Family
ID=15293157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2141491A Expired - Lifetime JP2663039B2 (ja) | 1990-06-01 | 1990-06-01 | スクアレンの微生物による製造法及び微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2663039B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012077799A1 (ja) | 2010-12-09 | 2012-06-14 | 国立大学法人筑波大学 | 高いスクワレン産生能を有する新規微生物及びこれによるスクワレンの製造方法 |
-
1990
- 1990-06-01 JP JP2141491A patent/JP2663039B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012077799A1 (ja) | 2010-12-09 | 2012-06-14 | 国立大学法人筑波大学 | 高いスクワレン産生能を有する新規微生物及びこれによるスクワレンの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0436186A (ja) | 1992-02-06 |
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