JPH11500008A

JPH11500008A - 微生物によるｐｈａポリマーの生産方法

Info

Publication number: JPH11500008A
Application number: JP8524742A
Authority: JP
Inventors: ネイラー，リンダ・アン; ウツド，ジヨン・クリストフアー
Original assignee: モンサント・カンパニー
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 1999-01-06
Also published as: WO1996025509A1; US5871980A; FI973365A0; GB9503174D0; FI973365A; AU4631596A; EP0809706A1

Abstract

(57)【要約】純水中での溶解度が低い低水溶性脂肪族カルボン酸及び／又は脂肪族カルボン酸に加水分解可能なその誘導体上でＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓを培養することによって、ポリ−３−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産するためのプロセスであり、このプロセスは、細胞増殖が停止するか著しく減速するまで、所期の増殖細菌細胞量に対応する量のリンを特に含む栄養培地中でＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓを培養する増殖段階と、その後に、ｐＨを監視し、アンモニア及び／又はアルカリ性アルカリ金属化合物の添加によってｐＨを調整しながら、上記低溶解度炭素源を供給することによって、所期量のＰＨＡが生産され終わるまで細菌細胞を培養するＰＨＡ蓄積段階と、この生産物からＰＨＡを収集する段階とを含む。上記蓄積段階では、ある一定の細菌増殖を可能にするのには十分であるがＰＨＡ蓄積の排除をもたらす増殖を可能にするには不十分な速度で追加のリンを供給することが可能である。炭素総量（Ｃ）のリン総量（Ｐ）に対する重量比は、典型的には、上記増殖段階において４０から１００までの範囲内であり、上記蓄積段階においては３００から６００までの範囲内である。

Description

【発明の詳細な説明】微生物によるＰＨＡポリマーの生産方法本発明はポリマー生産に係わり、特に脂肪炭素源からポリ−３−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を微生物によって生産するための方法に係わる。ＥＰ−Ａ−５２０４０５によれば、３−ヒドロキシブチレート（ＨＢ）反復単位を含むこうしたＰＨＡを、場合によっては窒素及びリンの制限下で、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ種（ＦＥＲＭＢＰ−３８１９）に属する菌株をＣ₁₀−Ｃ₂₂脂肪酸又はその誘導体上で培養することによって生産することが可能である。しかし、他のＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（特に、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ及びＡ．ｌａｔｕｓ）は、上記のような供給原料上での増殖が不可能であるか、又は、増殖が可能な場合であっても極めて緩慢な増殖しか得られないということが報告されている。Ｅｇｇｉｎｋ他（ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＣｒｏｐｓａｎｄＰｒｏｄｕｃｔｓ１９９３，１，１５７−１６３）によれば、こうしたＰＨＡを、オレイン酸上でＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓを培養することによって生産することが可能であり、ＰＨＡの収量は窒素制限下で更に多くなる。本出願人は、現在、炭素源としての脂肪族カルボン酸又は脂肪族カルボン酸に加水分解可能な誘導体から、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓが高い収率及び／又は生産率でＰＨＡを生産する培養条件を発見した。本発明によるＰＨＡ生産方法は、脂肪族カルボン酸及び／又は脂肪族カルボン酸に加水分解可能なその誘導体を少なくとも１つ含む炭素源上で、少なくとも１つのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ菌株を培養することを含み、こうした酸、誘導体、又は、これらの混合物は純水中での溶解度が低い。この方法は、（ａ）窒素、リン、硫黄、及び、微量元素の同化可能化合物を含み且つリンの量が所期の増殖細菌細胞量の必要条件に対応する栄養培地本体を供給する段階、（ｂ）Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの生菌を上記栄養培地本体に接種する段階、（ｃ）増殖細菌細胞量に少なくとも対応する量の同化可能炭素化合物を上記栄養培地本体中に供給する段階、（ｄ）ｐＨを監視し、アンモニア及び／又はアルカリ性アルカリ金属化合物の添加によってｐＨを調整しながら、細胞増殖が停止するか著しく減速するまで接種栄養培地本体を好気培養（発酵）する段階、（ｅ）ｐＨを監視し、アンモニア及び／又はアルカリ性アルカリ金属化合物の添加によってｐＨを調整しながら、低溶解度の上記炭素源を供給することによって、所期量のＰＨＡが生産され終わるまで段階（ｄ）の生産物を好気培養（発酵）する段階、及び、（ｆ）段階（ｅ）の生産物からＰＨＡを収集する段階を含む。段階（ｃ）で供給される炭素化合物は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓが同化可能なあらゆる炭素化合物であり得る。例えば、こうした炭素化合物は、糖、糖アルコール、糖酸、アルカノール、又は、アルカン酸であることが可能である。この炭素化合物は脂肪酸又は脂肪酸に加水分解可能な誘導体であると都合がよく、段階（ｅ）でも同様の炭素化合物を使用する。段階（ｄ）では、段階（ａ）で供給したリンが（典型的には、上清液１Ｌ当たりリン１０ｍｇ未満に）消費され終わった時に、細胞増殖が停止するか又は著しく減速する。好気培養のための酸素供給が過剰になることを回避し且つ（場合に応じて）炭素化合物の濃度が毒性をもたらす濃度になることを回避するように、同化可能な炭素化合物を徐々に供給することが一般的である。この段階における炭素総量（Ｃとして）のリン総量（Ｐとして）に対する重量比は、該化合物の化学的組成に応じて、典型的には４０から１０００まで、特に５０から８０までの範囲内である。段階（ｅ）、及び、場合によっては段階（ｃ）では、それ自体として使用されようが加水分解可能誘導体として使用されようが脂肪酸は、外界温度の純水中において、３％ｗ／ｗ未満の溶解度を有することが好ましく、１％ｗ／ｗ未満の溶解度を有することが特に好ましい。典型的には、この脂肪酸は、８個から２５個までの炭素原子、特に１０個から２２個までの炭素原子を含むアルキル基を１つ以上含む。上記誘導体がエステルであることが好ましく、トリグリセリドであることが適切であり、天然トリグリセリドであることが特に適している。脂肪酸は、（段階（ｄ）及び（ｅ）の温度より高い融点を持たない限り）飽和脂肪酸であってよく、又は、モノ不飽和脂肪酸もしくはポリ不飽和脂肪酸であってもよい。トリグリセリドの例は、動物産物（例えば、バター、鯨油、牛脂、豚脂、羊脂、魚油）、及び、植物油（例えば、オリーブ油、トウモロコシ油、ナタネ油、ヒマシ油、大豆油、ヒマワリ油、亜麻仁油）である。抽出した不飽和油を部分的に又は完全に水素化することが可能である。こうしたトリグリセリドは人間用食品グレードにまで精製する必要はないと考えられる。許容できる又は生産過程で同化される不純物の中には、対応する脂肪酸、リン脂質、着色材料の微量成分（例えば、微量金属化合物、及び、クロロフィル）が含まれる。別のエステル又は追加のエステルとしては、モノグリセリド、ジグリセリド、又は、脂肪酸のモノエステル誘導体（例えば、「バイオディーゼル（ｂｉｏ−ｄｉｅｓｅｌ）」として使用することが提案されているメチルエステル）を使用することが可能である。特に炭素源が上記培養温度で溶融する材料を含む場合には、こうした誘導体の混合物を使用することが可能である。脂肪酸が偶数個の炭素原子を含み且つ段階（ｅ）で唯一の炭素源である場合には、生産物であるＰＨＡは実質的に又は完全にポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）ホモポリマーである。ポリヒドロキシブチレート／ポリヒドロキシバレレートコポリマー（ＰＨＢＶ）が必要とされる場合には、奇数個の炭素原子を含む炭素源を使用しなければならない。これは、脂肪酸（誘導体）の一部又は全部であってもよく、又は、脂肪酸に対して追加してもよく、かかる炭素源は、例えば、プロピオン酸、もしくは、ｎ−プロピルアルコールである。生産物であるＰＨＡは、３０ｍｏｌ％以下のＶ、特に３ｍｏｌ％から２５ｍｏｌ％までのＶを含み、残部がＢであることが好ましい。本発明のプロセスは、あらゆる種又は菌株のＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓを使用することが可能である。特定の例は、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａ．ｌａｔｕｓ、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ａ．ｒｕｈｌａｎｄｉｉ、Ａ．ａｑｕａｍａｒｉｎｕｓ、及び、Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。本発明のプロセスの特に大きな利点は、Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ以外の細菌が、脂肪酸エステルをＰＨＡに変換することが可能な唯一の細菌であると本発明以前には考えられてきたＡ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａと少なくとも同じ活性と効率とを有すると思われるということである。段階（ｅ）の終了時における細胞の乾燥重量、又は、（連続操作の場合における）段階（ｅ）の定常状態における細胞の乾燥重量が、１００ｇ／Ｌから４００ｇ／Ｌの範囲内であることが好ましい。所期ＰＨＡ量が、細胞乾燥重量（ＰＨＡを含む）に対して６０％ｗ／ｗから８０％ｗ／ｗまでの範囲内のＰＨＡ含量に相当することが好ましい。本発明のプロセスの好ましい形態では、段階（ｅ）において、ある一定の細菌増殖を可能にするのには十分であるが最大増殖（即ち、ＰＨＡ蓄積の排除をもたらす増殖、又は、蓄積に伴う最大可能レベルに達する増殖）を可能にするには不十分な速度でリンを供給する。（後者は、増殖と蓄積が同時に可能なＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ種に適用する）。典型的には、段階（ｃ）では、供給される炭素総量（Ｃとして）のリン総量（Ｐとして）に対する重量比は、３００から６００までの範囲内である。これは、ＰＨＡ含有細胞の個数の増大と細胞の高ＰＨＡ含量とによって、供給バッチ培養における高いＰＨＡ生産高をもたらすばかりでなく、より速い反応と高いプロピオン酸効率ももたらすと考えられる。（好都合にはリン酸塩としての）リンの供給は培養中は定常速度で行われ、且つ、好ましくは炭素供給に対して一定の割合である。段階（ｅ）では、炭素源と（場合に応じて）上記リン化合物とに加えて、段階（ｄ）の後に存在する他の必須栄養素（例えば、窒素、硫黄、微量元素）を補充するために、こうした必須栄養素を供給することも可能である。段階（ｅ）及び段階（ｄ）では、低水溶性の油性炭素源を使用する場合に、その油の活性表面積を最大化するように、少なくとも空気吹込み撹拌と必要に応じて機械的撹拌とによる激しい撹拌を伴う形でこれらの段階を行う。増殖段階（ｄ）及び蓄積段階（ｅ）におけるｐＨは、最も迅速な反応が得られる値のｐＨ単位の半分以内に保たれることが好ましい。典型的には、培養温度のブイヨン中で測定する場合に、ｐＨは６．０から７．５までの範囲内である。ガラス電極によるｐＨ測定に応答する形で自動的にアンモニア水又はアルカリ性アルカリ金属化合物の添加を行うことが適切である。段階（ｄ）と段階（ｅ）の温度は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓと水溶性炭素源とを使用する場合に、例えば２０℃から４０℃までの範囲内であり、特に２８℃から３８℃までの範囲内である。生産物であるＰＨＡはＲ立体特異性であり、典型的には３−ヒドロキシブチレート反復単位だけから成る（「ＰＨＢ」）か、又は、３−ヒドロキシブチレート単位と（３０ｍｏｌ％以下、特に３ｍｏｌ％から２５ｍｏｌ％までの）３−ヒドロキシバレレート単位とから成る（「ＰＨＢＶ」）。このＰＨＡの分子量は例えば５００００以上であり、特に１０００００以上であり、例えば２×１０⁶ までである。段階（ｆ）でのＰＨＡの収集は、任意の適切な方法で行うことが可能である。一般的な方法の１つでは、ＰＨＡを含む細胞を遠心分離によって培養液から分離し、細胞を物理的又は化学的に破壊し、ＰＨＡをハロゲン化炭化水素又は炭酸アルキレンのような溶媒中で抽出する。別の方法では、機械的作用、熱処理、酵素処理、界面活性剤処理、及び、酸化の中の幾つかの処理を行うことによって、又は、これら全てを行うことによって、非ＰＨＡ細胞材料を可溶化し、ＰＨＡ粒子を細胞中に残すか、ＰＨＡ粒子の凝集体を生じさせる。こうした粒子又は凝集体を、溶融処理又は溶媒処理に使用するために乾燥状態で収集し、又は、コーティング剤もしくは接着剤として使用するために、もしくは、乾燥ＰＨＡへ後で変換するために、ラテックスとして収集することが可能である。下記の実施例は、同様のＶ含量（６．９ｍｏｌ％から８．７ｍｏｌ％までの範囲内）を有するＰＨＢＶの生産を説明する。実施例１空気吹込み撹拌のできる容積１５Ｌの実験用培養槽の中に、１Ｌ当たりナタネ油３．００ｇ濃Ｈ₃ＰＯ₄（４００ｍｇ／ＬのＰ）０．９３ｍＬＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２．１８ｇ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １．８１ｇＫ₂ＳＯ₄ ２．１８ｇ酢酸カルシウム０．３６ｇＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．１４ｇＮａ₂ＳＯ₄ ０．０９ｇＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ０．０４ｇＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０９ｇＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ４．５０ｍｇを含む培地８Ｌを入れた。７ＭＮＨ₄ＯＨを添加することによってｐＨを６．８に調節し、温度を３４℃に維持した。その後で、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（ＮＣＩＭＢ４０１２４）の培養液２００ｍＬ（生菌０．２ｇ）を撹拌しながら加えた。絶対圧力１バールで空気飽和の１０％を越える値に溶解酸素圧力を維持するように空気の流量を調整した。１時間当たり非ＰＨＡ細胞質量１ｇ当たり０．１３ｇまでの平均油取込み速度を得るように更に追加のナタネ油を供給した。２０時間後に、油取込み速度が著しく低下し、リンの実質的な消耗を示したことを確認した。この時点では、供給炭素総量（Ｃとして）の供給リン総量（Ｐとして）に対する重量比は６０だった。その後で、これらの炭素源の取込み速度が低下して、ＰＨＡへの変換が実質的に停止するまで、ナタネ油とプロピオン酸を供給した。その結果得られたバイオマスを標本として採取し、細胞乾燥重量、ＰＨＡ含量、及び、ＰＨＡバレレート含量を分析した。実施例２細胞乾燥重量を所期レベルに増加させるのに十分ではあるがＰＨＡ蓄積の抑制を伴う実質的な増殖を生じさせるには不十分である４００から６００までの範囲内にＣ／Ｐ比を維持しながら、使用したリン総量の１７％まで、ＰＨＡ蓄積段階中にリン酸をナタネ油と共に培養槽に供給したという変更点を除いて、実施例１の手順と同様の手順を繰り返した。実施例３炭素源として粗トウモロコシ油を使用したという変更点を除いて、実施例１の手順と同様の手順を繰り返した。結果典型的な処理で得られた最終細胞乾燥重量、ＰＨＡ収量、及び、ＰＨＡ分子量を、次の表１に示す。炭素源としてナタネ油又はトウモロコシ油を使用した場合に、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓが活発に増殖し、ＰＨＡを高効率で蓄積することが明らかである。ＰＨＡ蓄積中のリン酸塩の供給は、ＰＨＡ生産速度と、プロピオン酸がＰＨＡ中のバレレート反復単位に変換される効率とを効果的に増大させる。粗トウモロコシ油の使用によって、プロピオネート効率の更なる改善が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウツド，ジヨン・クリストフアーイギリス国、カウンテイ・ダーラム・エス・アール・８・１・エヌ・キュー、ピーターリー、オーカーサイド・パーク、バーウイツク・チエイス・58

Claims

【特許請求の範囲】１．脂肪族カルボン酸及び／又は脂肪族カルボン酸に加水分解可能なその誘導体を少なくとも１つ含む炭素源上で、少なくとも１つのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ菌株を培養することを含む、ポリ−３−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産するための方法であって、前記酸、前記誘導体、又は、これらの混合物は純水中での溶解度が低く、（ａ）窒素、リン、硫黄、及び、微量元素の同化可能化合物を含み且つリンの量が所期の増殖細菌細胞量を得るための必要条件に対応する栄養培地本体を供給する段階、（ｂ）Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの生菌を前記栄養培地本体に接種する段階、（ｃ）増殖細菌細胞量に少なくとも対応する量の同化可能炭素化合物を前記栄養培地本体に供給する段階、（ｄ）ｐＨを監視し、アンモニア及び／又はアルカリ性アルカリ金属化合物の添加によってｐＨを調整しながら、細胞増殖が停止するか著しく減速するまで前記接種栄養培地本体を好気培養する段階、（ｅ）ｐＨを監視し、アンモニア及び／又はアルカリ性アルカリ金属化合物の添加によってｐＨを調整しながら、低溶解度の前記炭素源を供給することによって、所期量のＰＨＡが生産されるまで段階（ｄ）の生産物を好気培養する段階、及び、（ｆ）段階（ｅ）の生産物からＰＨＡを収集する段階を含む前記方法。２．前記段階（ｃ）で供給する前記炭素化合物が前記段階（ｅ）で使用する炭素化合物と同一である請求項１に記載の方法。３．前記段階（ｄ）における炭素総量（Ｃとして）のリン総量（Ｐとして）に対する重量比が、前記化合物の化学組成に応じて様々であり、典型的には４０から１００までであり、特に５０から８０までである請求項１又は２に記載の方法。４．前記段階（ｅ）において、ある一定の細菌増殖を可能にするのには十分であるがＰＨＡ蓄積の排除をもたらす増殖を可能にするには不十分な速度でリンを供給する請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。５．前記段階（ｅ）における炭素総量（Ｃとして）のリン総量（Ｐとして）に対する重量比が３００から６００までの範囲内である請求項４に記載の方法。６．リンの供給が培養中に定常速度であり、炭素供給に対して一定の割合である請求項４又は５に記載のプロセス。７．低水溶性の油性炭素源を使用する場合には、その油の活性表面積を最大化するように、好ましくは少なくとも空気吹込み撹拌と必要に応じて機械的撹拌とによる激しい撹拌下で前記段階（ｅ）及び前記段階（ｄ）を実施する請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。８．前記段階（ｅ）の終了時における細胞の乾燥重量、又は、連続操作の場合には前記段階（ｅ）の定常状態における細胞の乾燥重量が、１００ｇ／Ｌから４００ｇ／Ｌまでの範囲内である請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。９．所期ＰＨＡ量が、細胞乾燥重量（ＰＨＡを含む）に対して６０％ｗ／ｗから８０％ｗ／ｗまでの範囲内のＰＨＡ含量に相当する請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。１０．ポリヒドロキシブチレート／ポリヒドロキシバレレートコポリマー（ＰＨＢＶ）を生産するために、前記脂肪酸（誘導体）の一部又は全部として又は前記脂肪酸に加えて奇数個の炭素原子を含む炭素源、例えば、プロピオン酸、もしくは、ｎ−プロピルアルコールを前記段階（ｅ）で供給する請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。１１．前記Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ菌株がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓである請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。