DE19704045A1

DE19704045A1 - Mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten

Info

Publication number: DE19704045A1
Application number: DE19704045A
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr Metzner; Christiane Berndt; Arnulf Dr Christner; Matthias Dr Hilliger; Rudolf Dr Genther; Karin Perlet; Martin Roth; Ernst Dr Bormann; Mike Leisner
Original assignee: Buna Sow Leuna Olefinverbund GmbH; Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Current assignee: Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung; Dow Olefinverbund GmbH
Priority date: 1997-02-04
Filing date: 1997-02-04
Publication date: 1998-08-06
Also published as: EP0972065A1; WO1998033931A1; JP3222478B2; CA2280086A1; JP2000512857A

Description

Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalka noaten, bevorzugt Polyhydroxybuttersäure, auf fermentativem Wege. Das Verfahren kann zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten angewendet werden.

Polyhydroxyalkanoate, vor allem Polyhydroxybuttersäure, werden durch zahlreiche Mikro organismen biosynthetisiert (Babel, W., Riis, V. und Hainich, E. Plaste und Kautschuk [1990] 37, 109). Wirtschaftliches Interesse erlangten die Biopolymere aufgrund ihrer thermoplastischen Eigenschaften und ihrer Bioabbaubarkeit. Hohe zelluläre Produktkon zentrationen sind vor allem bei den Bakteriengattungen Alcaligenes, Azotobacter, Pseu domonas sowie Bacillus bekannt (Anderson, A. J. and Dawes, E. A.: Microbial Review [1990] 54, 450). Neuere Entwicklungen betreffen die Herstellung und Kultivierung re kombinanter Stämme von Escherichia coli sowie transgener Pflanzen (Steinbüchel, A.: Current Opinion in Biotechnol [1992] 3, 291).

In bezug auf die Produktvielfalt sind biochemisch begründete Stoffwechselveränderungen ebenso in der Bearbeitung wie die Gewinnung von Derivaten.

Industriell produziert wird das Heteropolymer Polyhydroxybuttersäure-Polyhydroxyvaleri ansäure (Hartley, P.: Energie [1991] 43, 48). Biotechnologisch relevante Verfahren ver wenden anorganische Stickstoffquellen und Glucose, Saccharose, Melasse, Methanol so wie Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquellen. In der Patentanmeldung DE 196 30 175.0 wird ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Polyhydroxybuttersäure durch Kul tivierung eines Stammes von Methylobacterium auf Glycerol als Kohlenstoff- und Ener giequelle dargestellt. Die Supplementation mit Inhaltsstoffen technischer Rohstoffe bzw. Proteinhydrolysaten oder Aminosäuren in geringen Konzentrationen wurde beschrieben (Fujita, M., Nakamura, K., Kuroki, H., Yoshie, N. and Inoue, Y.: Int. J. Biol. Macromol. [1993] 15, 253). Hohe Raum-Zeit-Ausbeuten werden durch fed-batch-Fermentationen mit bilanzierten Dosage-Regimen erreicht.

Wird Alcaligenes eutrophus als Produktionsstamm auf Glucose-Mineralsalz-Medium ein gesetzt (z. B. EP 046 344, US 4477654), so wird eine zweiphasige Fermentation mit Wachstums- und Produktbildungsabschnitt vorgeschlagen. Eine derartige Prozeßcharakte ristik führt zu zwei Einschränkungen des Verfahrens: Einerseits ist es erforderlich, den Beginn der Produktsynthese durch spezielle Dosagenprofile der limitierenden Substrate reproduzierbar zu sichern. Andererseits hat das Auftreten eines produktfreien bzw. pro duktarmen Wachstumsabschnittes eine verlängerte Fermentationszeit zur Folge.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein ökonomisch effektives Kultivierungsverfah ren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten mit einer Verkürzung der Fermentations zeit sowie Vereinfachung der Kultivierungsbedingungen zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der Kultivierungsprozeß mit dem Mikroorganismusstamm Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 in ei nem Medium mit Stickstoff- und Kohlenstoffquellen sowie Mineralsalzen und Spurenele menten durchgeführt wird. Der Stamm ist eine Mutante von Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 531. Die Hinterlegung des Stammes DSM 11348 erfolgte am 19.12.1996 bei der Deutschen Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkultu ren GmbH. (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, gemäß "Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren".

Der erfindungsgemäße Mikroorganismusstamm Ralstonia eutropha DSM 11348 unter scheidet sich vom Ausgangsstamm Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 531 wie folgt:
Bei Kultivierung im Schüttelkolben in Mineralsalzmedium ohne organische N-Quelle mit Glucose als C-Quelle (Temperatur 30°C) wächst der Stamm DSM 11348 mit einer höhe ren spezifischen Wachstumsrate von µ=0,17 h^-1 im Vergleich mit dem Ausgangsstamm DSM 531 µ=0,06 h^-1). Bei Verwendung von α-Ketoglutarsäure (2 g/l) als C-Quelle be trägt die maximale spezifische Wachstumsrate des Stammes DSM 11348 µ=0,12 h^-1 und die des Ausgangsstammes DSM 531 nur µ=0,025 h^-1.

Die mutative Veränderung in der DNA von DSM 11348 gegenüber dem Ausgangsstamm DSM 531 wird folgendermaßen nachgewiesen:
Die Gesamt-DNA der Stämme wird mit der Restriktionsendonuklease Ssp1 (Erkennungssequenz in der DNA: AAT.ATT) fragmentiert. Dabei entstehen DNA-Frag mente mit einer Größe von etwa 10 bis 500 kb (kb: Kilobasen), die mittels Pulsfeld-Gel elektrophorese aufgetrennt werden. Im Größenbereich zwischen 100 und 145 kb sind beim Ausgangsstamm DSM 531 DNA-Fragmente folgender Größe nachweisbar (kb): 100; 106; 117,5; 127,4; 135,2; 140; 144,7.

Beim Bakterienstamm DSM 11348 liegen im Vergleich mit dem Ausgangsstamm DSM 531 folgende Veränderungen vor: Das Fragment 135,2 kb Größe fehlt. Zusätzlich vorhanden ist ein DNA-Fragment mit einer Größe von 112,4 kb.

Es wurde gefunden, daß durch den Einsatz des neuen Mikroorganismenstammes Ralstonia eutropha DSM 11348 in Bioprozessen die Biosynthese der Polyhydroxyalkanoate, vor zugsweise der Polyhydroxybuttersäure, nicht von der Limitation des Stoffwechsels durch Aminonium oder Phosphat oder Sauerstoff abhängt, sondern wachstumsassoziiert verläuft. Es zeigte sich überraschend, daß mit dem neuen Mikroorganismus Ralstonia eutropha DSM 11348 offenbar aufgrund seiner genetisch/biochemischen Konstitution hohe Polyhydroxyalkanoat-Konzentrationen ohne den üblichen zweiphasigen Bioprozeß erreicht werden. Da die Ammoniumsalze im Medium vollständig durch Proteinhydrolysaten in Form von Peptonen oder Aminosäuregemischen als organische Stickstoffquellen ersetzbar sind, stehen somit salzarme Medien für die mikrobielle Polyhydroxyalkanoat-Produktion zur Verfügung. Unter diesen Bedingungen kann der Bioprozeß auf den Medien mit kom plexer Stickstoffquelle unter Zusatz von Glucose oder Glycerol oder Essigsäure als Koh lenstoffquelle durchgeführt werden. Das Bioverfahrensregime auf der Grundlage dieses Mediumsprinzips erstreckt sich durchgängig von der Stammhaltung über die emerse und submerse Anzuchtpassagierung bis in die submerse Hauptfermentation.

Die Fermentation erfolgt nach einer volumenadäquaten Vorzucht in der submersen Haupt kultur unter aeroben und kontaminationsfreien Bedingungen, indem der Stamm Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 in einem flüssigen Medium bei Temperatu ren von 20 bis 37°C sowie einer Acidität von pH 6,0 bis 8,0 für die Dauer von 24 bis 120 Std. kultiviert wird.

Der Ablauf des gesamten Verfahrens läßt sich allgemein wie folgt charakterisieren:
Glycerolkonserven des oben genannten Stammes, die bei -18°C deponiert werden und bakterielles Zellmaterial in einer Konzentration von 6 bis 10 g Biotrockensubstanz (TS)/l enthalten, dienen als Impfmaterial für die erste submerse Anzuchtpassage in 500 ml-Steilbrustflaschen mit 100 bis 150 ml Medium. Das Inoculum enthält Peptone bzw. Proteinhydrolysate, Glucose bzw. Glycerol, KH₂PO₄ und/oder K₂HPO₄ sowie eine Spu rensalzmischung. Die Substratkombination wird qualitativ über alle Fermentationsstufen beibehalten. Nach 42 bis 72stündiger Kultivierung bei 28 bis 32°C auf einem Rund schwingtisch mit 180 bis 220 rpm hat das biologische Material eine Konzentration von 6 bis 12 g TS/l erreicht. Nach Ausreifen der ersten Flüssigkeitskultur erfolgt gegebenenfalls die Beimpfung einer zweiten submersen Anzuchtpassage in einer Menge von 5 bis 10% des Ansatzvolumens. Die Kultivierung der zweiten Flüssigkeitspassage erfolgt entweder in 2,5 Liter-Steilbrustflaschen mit 400 ml des Proteinhydrolysat-Mediums oder in gerührten und belüfteten Rührkesselreaktoren mit einem Fermentationsvolumen von 5 bis 25 l bei üblichem biotechnischen Ausrüstungsgrad für Rührung, Belüftung und pH-Statierung. Die Kultivierungszeit beträgt 20 bis 40 Std. bei einer Temperatur von 30 bis 32°C. Für die Aciditätskorrektur werden NaOH (unterer pH-Grenzwert) sowie H₂SO₄ (oberer pH-Grenzwert) verwendet. Die Hauptkultur in einem Rührkesselreaktor mit gleichfalls übli chem biotechnischen Ausrüstungsgrad wird in einer Menge von 5 bis 10% des Medium volumens mit der ausgereiften Vorkultur beimpft und für die Dauer von 24 bis 120 Std. unter Rührung, Belüftung, pH-Statierung und Nachdosage von Glucose oder Glycerol oder Essigsäure durchgeführt.

Als organische Stickstoffquellen sind Proteinhydrolysate als Peptone oder Aminosäure gemische aus pflanzlichen Produkten (Sojaprotein), tierischen Produkten (Casein, Gela tine, Fleisch) oder mikrobieller Biomasse geeignet. Der Proteinaufschluß erfolgt mit be kannten technischen Verfahren durch mineralische oder enzymatische Hydrolyse. Die Proteinhydrolysate mit einem Gehalt an organischem Stickstoff von 8 bis 15% werden im Medium in Konzentrationen von 10 bis 50 g/l eingesetzt.

Als Kohlenstoffquelle wird entweder Glucose oder Glycerol oder Essigsäure verwendet. Von den beiden erstgenannten Substraten wird jeweils nur eines nach separater Sterilisa tion dem Medium in Konzentrationen von 10 bis 100 g/l zugesetzt. Während der Fermen tation wird bei Erreichen von 10 bis 20 g Glucose/l oder 10 bis 20 g Glycerol/l eine Menge von 20 bis 50 g/l des betreffenden Substrates nachdosiert. Essigsäure kommt als 10 bis 90%ige wäßrige Lösung zur Anwendung, indem sie dem Bioprozeß über das Dosageregime zur pH-Statierung recursiv zugeführt wird. Sie dient der Kompensation des adäquat zum Wachstum verlaufenden pH-Anstiegs, der durch die NH₄-Freisetzung aus der organischen Stickstoffquelle und durch die Aufnahme der Säureanionen im Austausch gegen Hydroxyl ionen zustande kommt.

Unter diesen Bedingungen erreichen die Fermentationsansätze, bezogen auf die Biotroc kenmasse, nach 45 Std. Produktkonzentrationen von 50 bis 85% Polyhydroxyalkanoat als Polyhydroxybuttersäure. Die Raum-Zeit-Ausbeute auf einem Pepton/Glucose-Medium beträgt im 2 l-Maßstab 0,91 g Produkt/l.Std. Die Isolierung des Produktes aus der Bio masse erfolgt in bekannter Weise mit oder ohne Zellaufschluß.

Die nachfolgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren erläutern, aber in kei ner Weise beschränken.

Experimenteller Teil

Die in den Beispielen verwendete Spurensalzlösung hat folgende Zusammensetzung (g/l):

MgSO₄ . 7 H₂O	71,200
ZnSO₄ . 7 H₂O	0,440
MnSO₄ . 6 H₂O	0,812
CuSO₄ . 5 H₂O	0,785
Na₂MoO₄ . 2 H₂O	0,252
FeSO₄ . 7 H₂O	4,980
H₃BO₃	1,020
H₂SO₄ 1 N	100 l
Aqua dest.	ad 1 l

Beispiel 1

1 ml einer Glycerolkonserve von Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 wird mit 1 ml physiologischer NaCl-Lösung resuspendiert und auf 100 ml Anzuchtmedium folgender Zusammensetzung in 500 ml-Steilbrustflaschen übertragen (g/l): Glucose 20; Bactotrypton 10; KH₂PO₄ 1; CaCl₂ 0,015; Spurensalzlösung 2,5 ml; Aqua dest. ad 1 l; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120°C. Die Anzuchtkulturen werden 36 Std. lang bei 30°C auf einem Rundschwingtisch (200 rpm) geschüttelt. Als Reifekriterium zeigen sie eine Biotrockenmassekonzentration von 6,5 bis 7,5 g TS/l und eine Acidität von pH 6,7 bis 6,8. Sie dienen in einer Menge von 10% als Impfmaterial für 2 l Hauptkulturmedium in einem 2,5 l-Bioreaktor mit üblicher technischer Ausstattung für Rührung, Belüftung, Tem perierung und pH-Statierung. Das Medium weist folgende Zusammensetzung auf (g/l): Glucose 100; Bactotrypton 20; KH₂PO₄ 0,5; CaCl₂ 0,015; Spurensalzlösung 2,5 ml; Aqua dest. ad 1 l; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120°C. Die Drehzahl des 6-Blatt-Schei benrührers beträgt 850 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0,5 : 1 vvm, die Temperatur wird auf 30°C eingestellt. Die Kultur wird auf einen Aciditätsbereich von pH 6,8 bis 7,1 mit 4 N NaOH (unterer Grenzwert) und 6 N H₂SO₄ (oberer Grenzwert) geregelt. Zur 45. Std. wird Glucose in fester Form in einer Konzentration von 20 g/l zugesetzt. Zum Erntezeit punkt nach 55 Std. erreicht die Kultur eine Biotrockenmasse-Konzentration von 55 g TS/l und eine Produktkonzentration von 91% in der Biomasse.

Beispiel 2

1 ml einer Glycerolkonserve von Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 wird mit 1 ml physiologischer NaCl-Lösung resuspendiert und in einer Menge von 1 ml in 100 ml Anzuchtmedium folgender Zusammensetzung gebracht (g/l): Glycerol 30; Soja pepton 10; KH₂PO₄ 1; CaCl₂ 0,015; Spurensalzlösung 2,5 ml; Aqua dest. ad 1 l; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120°C. Die 500 ml-Anzuchtkolben werden 28 Std. bei 30°C auf einem Rundschwingtisch geschüttelt. Als Reifekriterium zeigen sie eine Biotrockenmasse-Konzen tration von 1,5 bis 2 g TS/l bei einer Acidität von pH 6,9 bis 7,1. Diese erste An zuchtkultur dient in einer Menge von 10% des Volumens als Impfmaterial für 1 l Medium der zweiten Anzuchtkultur in einem 1,5 l-Bioreaktor mit üblichem technischen Standard für Rührung, Belüftung, Temperierung und pH-Statierung. Das Medium weist folgende Zusammensetzung auf (g/l): Glycerol 30; Casaminosäuren 20; KH₂PO₄ 1; CaCl₂ 0,030; Spurensalze 5 ml; Aqua dest ad 1 l; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120°C.

Die Drehzahl des 4-Blatt-Scheibenrührers beträgt 400 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0,5 : 1 vvm, die Temperatur wird auf 30°C eingestellt. Die Acidität der Kultur wird mit 4 N NaOH (unterer Grenzbereich) und 6 N H₂SO₄ (oberer Grenzbereich) von pH 6,8 bis 7,1 geregelt. Nach einer Fermentationszeit von 22 Std. hat die Kultur 6,5 g TS/l Biotrocken masse erreicht und wird in einer Menge von 10% des Volumens auf 2 l des Hauptkultur mediums in einem 2,5 l-Bioreaktor mit üblichem technischen Standard für Rührung, Be lüftung, Temperierung und pH-Statierung übertragen. Das Medium weist folgende Zu sammensetzung auf (g/l): Glycerol 50; Casaminosäuren 20, KH₂PO₄ 0,5; CaCl₂ 0,030; Spurensalzlösung 5 ml; Aqua dest. ad 1 l; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120°C. Die Drehzahl des 6-Blatt-Scheibenrührers beträgt 850 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0,5 : 1 vvm, die Temperatur wird auf 30°C eingestellt. Die Acidität der Kultur wird mit 4 N NaOH (unterer Grenzwert) und H₂SO₄ (oberer Grenzwert) auf pH 6,8 bis 7,1 geregelt. Zur 23. Stunde werden 50 g Glycerol/l hinzugefügt.

Der Fermentationsansatz erreicht zum Erntezeitpunkt nach 47 Std. eine Biotrockenmasse-Kon zentration von 27 g TS/l und eine Produktkonzentration von 65% in der Biomasse.

Beispiel 3

1 ml einer Glycerolkonserve von Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 wird mit 1 ml physiologischer NaCl-Lösung resuspendiert und davon 1 ml auf 100 ml An zuchtmedium folgender Zusammensetzung übertragen (g/l): Glucose 20; Bactotrypton 10; KH₂PO₄ 1; CaCl₂ 0,015; Spurensalzlösung 2,5 ml; Aqua dest. ad 11; pH 6,8 bis 7,0; Steri lisation 20 min 120°C. Die 500 ml-Anzuchtkolben werden 40 Std. lang bei 30°C auf ei nem Rundschwingtisch (200 rpm) geschüttelt. Als Reifekriterium weisen sie eine Biotroc kenmasse-Konzentration von 6,5 g TS/l und eine Acidität von pH 6,8 auf. Sie dienen in einer Menge von 10% des Volumens als Impfmaterial für 1 l Hauptkulturmedium in einem 1,5 l-Bioreaktor mit üblicher technischer Ausrüstung für Rührung, Belüftung, Temperie rung und pH-Statierung. Das Medium weist folgende Zusammensetzung auf (g/l): Soja pepton 20; KH₂PO₄ 0,5; CaCl₂ 0,015; Spurensalzlösung 2,5 ml; Aqua dest. ad 1 l; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120°C. Die Drehzahl des 4-Blatt-Scheibenrührers beträgt 400 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0,5 : 1 vvm, die Temperatur wird auf 30°C eingestellt. Die Acidität der Kultur wird mit 50%iger Essigsäure auf pH ≦7,05 geregelt. Nach einer Fermentationszeit von 42 Std. erreicht die Kultur eine Biotrockenmassekonzentration von 15 g TS/l und eine Produktkonzentration von 50% PHB in der Biomasse.

Claims

1. Mikrobielles Herstellungsverfahren für Polyhydroxyalkanoate durch sterile aerobe Fer mentation eines bakteriellen Mikroorganismus auf einem Medium mit Stickstoff- und Kohlenstoffsubstraten sowie Mineralsalzen für die Dauer von 24 bis 120 Stunden bei Temperaturen von 20 bis 37°C und bei einer Acidität von pH 6 bis 8, dadurch gekenn zeichnet, daß der Mikroorganismus Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348, unabhängig von einer bioprozeßtechnischen Substratiimitation, in einem komplexen Kulturmedium mit organischen Stickstoffverbindungen als Stickstoffquelle und einer Kohlenstoffquelle kultiviert wird.

2. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die organischen Stickstoffverbindungen in der Kulturlösung in einer Konzentration von 10 g/l bis 50 g/l vorliegen.

3. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die orga nischen Stickstoffverbindungen mikrobielle, pflanzliche oder tierische Proteinhydroly sate oder Aminosäuregemische mit einem organischen Stickstoffgehalt von 8 bis 15 g/l sind.

4. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteinhydrolysate in Form von Peptonen oder Aminosäuregemischen aus bakteriellen oder pilzlichen Biomassen, Casein, Sojaprotein, Gelatine oder Fleisch mit einem be kannten technischen Verfahren zur mineralischen oder enzymatischen Hydrolyse herge stellt sind.

5. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die organischen Stickstoffverbindungen die einzige Stickstoffquelle im Kulturmedium dar stellt.

6. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentra tion der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium 5 g/l bis 120 g/l beträgt.

7. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Koh lenstoffquelle Glucose oder Glycerol oder Essigsäure dient.

8. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 und 7 dadurch gekennzeichnet, daß in den emer sen und submersen Anzuchtpassagen nur Glucose oder Glycerol, jedoch in der Fer mentationsstufe nur Essigsäure verwendet wird.

9. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium der Fermentationsstufe anfänglich nur Proteinhydrolysate als or ganisches Nährsubstrat enthält und Essigsäure nur im Verlauf der Fermentation über die permanente Einstellung der Acidität auf pH 6 bis 8 als Kohlenstoffsubstrat zugesetzt wird.

10. Der Stamm Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348.