EP0972065A1 - Mikrobielles verfahren zur herstellung von polyhydroxyalkanoaten - Google Patents

Mikrobielles verfahren zur herstellung von polyhydroxyalkanoaten

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EP0972065A1
EP0972065A1 EP98906847A EP98906847A EP0972065A1 EP 0972065 A1 EP0972065 A1 EP 0972065A1 EP 98906847 A EP98906847 A EP 98906847A EP 98906847 A EP98906847 A EP 98906847A EP 0972065 A1 EP0972065 A1 EP 0972065A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
microbial
dsm
culture medium
fermentation
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98906847A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ernst-Joachim Bormann
Mike Leissner
Christiane Berndt
Klaus Metzner
Arnulf Christner
Matthias Hilliger
Rudolf Geuther
Karin Perlet
Martin Roth
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dow Olefinverbund GmbH
Original Assignee
Buna Sow Leuna Olefinverbund GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Buna Sow Leuna Olefinverbund GmbH filed Critical Buna Sow Leuna Olefinverbund GmbH
Publication of EP0972065A1 publication Critical patent/EP0972065A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/05—Alcaligenes

Definitions

  • the invention relates to a microbial process for the production of polyhydroxyalkanoates, preferably polyhydroxybutyric acid, by fermentation.
  • the process can be used to prepare polyhydroxyalkanoates.
  • Polyhydroxyalkanoates are biosynthesized by numerous microorganisms (Babel, W., Riis, V. and Hainich, E .: Plaste und Kautschuk [1990] 37, 109).
  • the biopolymers gained economic interest due to their thermoplastic properties and their biodegradability.
  • High cellular product concentrations are known especially in the bacterial genera Alcaligenes, Azotobacter, Pensdomonas and Bacillus (Anderson, A.J. and Dawes, E.A .: Microbial Review [1990] 54, 450).
  • the heteropolymer polyhydroxybutyric acid-polyhydroxyvaleric acid is produced industrially (Hartley, P .: Energy [1991] ⁇ 3, 48). Biotechnologically relevant processes use inorganic nitrogen sources and glucose, sucrose, molasses, methanol and hydrocarbons as carbon sources. Patent application DE 196 30 175.0 describes a process for the fermentative production of polyhydroxybutyric acid by cultivating a strain of Methylobacterium on glycerol as a source of carbon and energy. Supplementation with ingredients of technical raw materials or protein hydrolyzates or amino acids in low concentrations has been described (Fujita, M., Nakamura, K, Kuroki, H., Yoshie, N.
  • the invention has for its object to develop an economically effective cultivation process for the production of polyhydroxyalkanoates with a shortening of the fermentation time and simplification of the cultivation conditions.
  • the object is achieved in that the cultivation process with the microorganism strain Ralstonia eutropha ⁇ Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 is carried out in a medium with nitrogen and carbon sources as well as mineral salts and trace elements.
  • the strain is a mutant of Ralstonia eutropha ⁇ Alcaligenes eutrophus) DSM 531.
  • the strain DSM 11348 was deposited on December 19, 1996 with the German strain collection of microorganisms and cell cultures GmbH. (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, according to the "Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure".
  • the microorganism strain Ralstonia eutropha DSM 11348 according to the invention differs from the starting strain Ralstonia eutropha ⁇ Alcaligenes eutrophus) DSM 531 as follows:
  • the mutative change in the DNA of DSM 11348 compared to the parent strain DSM 531 is detected as follows: The total DNA of the strains is fragmented with the restriction endonuclease Sspl (recognition sequence in the DNA: AAT. ATT). This results in DNA fragments with a size of about 10 to 500 kb (kb: kilobases), which are separated by means of pulse field gel electrophoresis. In the size range between 100 and 145 kb Parent strain DSM 531 DNA fragments of the following size detectable (kb): 100; 106; 117.5; 127.4; 135.2; 140; 144.7.
  • the bacterial strain DSM 11348 has the following changes compared to the parent strain DSM 531: The fragment 135.2 kb in size is missing. In addition 5 there is a DNA fragment with a size of 112.4 kb.
  • the bioprocess can be carried out on the media with a complex nitrogen source with the addition of glucose or glycerol or acetic acid as the carbon source.
  • the bioprocess regime based on this medium principle extends consistently from the stock keeping to the emerse and
  • the fermentation takes place after a volume-appropriate pre-cultivation in the submerged main culture under aerobic and contamination-free conditions by the strain Ralstonia eutropha ⁇ Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 in a liquid medium at temperatures of 20 to 37 ° C and an acidity of pH 6.0 to 8 , 0 for the duration of 24 to 120
  • Glycerol preserves of the above-mentioned strain, which are deposited at -18 ° C and contain bacterial cell material in a concentration of 6 to 10 g bio-dry substance (TS) / 1, serve as inoculation material for the first submerged passage in
  • the inoculum contains peptones or protein hydrolyzates, glucose or glycerol, KH 2 PO and / or K 2 HPO 4 as well as a trace salt mixture.
  • the substrate combination is qualitative across all fermentation stages maintained. After 42 to 72 hours of cultivation at 28 to 32 ° C on a rotary table with 180 to 220 rpm, the biological material has reached a concentration of 6 to 12 gTS / 1. After the first liquid culture has matured, a second submerged cultivation passage is optionally added in an amount of 5 to 10% of the starting volume.
  • the second liquid passage is cultivated either in 2.5 liter steep breast bottles with 400 ml of the protein hydrolyzate medium or in stirred and ventilated stirred tank reactors with a fermentation volume of 5 to 25 liters with the usual biotechnological equipment level for stirring, aeration and pH-stating.
  • the cultivation time is 20 to 40 hours at a temperature of 30 to 32 ° C. NaOH (lower pH limit) and H 2 SO 4 (upper pH limit) are used for the acidity correction.
  • the main culture in a stirred tank reactor with the usual biotechnical equipment level is inoculated in an amount of 5 to 10% of the medium volume with the mature preculture and for a period of 24 to 120 hours with stirring, aeration, pH adjustment and subsequent dosing of glucose or glycerol or acetic acid.
  • Protein hydrolyzates as peptones or amino acid mixtures from vegetable products (soy protein), animal products (casein, gelatin, meat) or microbial biomass are suitable as organic nitrogen sources.
  • the protein is digested using known technical processes by mineral or enzymatic hydrolysis.
  • the protein hydrolyzates with an organic nitrogen content of 8 to 15% are used in the medium in concentrations of 10 to 50 g / 1.
  • Either glucose or glycerol or acetic acid is used as the carbon source. Only one of the first two substrates mentioned is added to the medium in concentrations of 10 to 100 g / l after separate sterilization. During the fermentation, when 10 to 20 g glucose / 1 or 10 to 20 g glycerol / 1 is reached, an amount of 20 to 50 g / 1 of the substrate in question is replenished.
  • Acetic acid is used as a 10 to 90% aqueous solution by recursively feeding it into the bioprocess via the dosage regimen for pH stating. It serves to compensate for the pH increase that is adequate for growth, which is caused by the NHt release from the organic nitrogen source and by the absorption of the acid anions in exchange for hydroxyl ions.
  • the fermentation batches based on the dry biomass, reach product concentrations of 50 to 85% polyhydroxyalkanoate as polyhydroxybutyric acid after 45 hours.
  • the space-time yield on a peptone / glucose medium on a 2 liter scale is 0.91 g of product / 1 hour.
  • the product is isolated from the biomass in a known manner with or without cell disruption.
  • the trace salt solution used in the examples has the following composition (g / 1):
  • DSM 11348 is resuspended with 1 ml of physiological NaCl solution and transferred to 100 ml of growth medium of the following composition in 500 ml steep breast bottles (g / 1): glucose 20; Bactotrypton 10; KH 2 PO 4 1; CaCl 2 0.015; Trace salt solution 2.5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6.8 to 7.0; Sterilization at 120 ° C for 20 min. The culture cultures are shaken for 36 hours at 30 ° C on a rotary table (200 rpm).
  • a ripening criterion they show a dry biomass concentration of 6.5 to 7.5 g TS / 1 and an acidity of pH 6.7 to 6.8. In an amount of 10% they serve as inoculation material for 2 1 main culture medium in a 2.5 1 bioreactor with the usual technical equipment for stirring, aeration, temperature peration and pH-stating.
  • the medium has the following composition (g / 1): glucose 100; Bactotrypton 20; KH 2 PO 4 0.5; CaCl 2 0.015; Trace salt solution 2.5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6.8 to 7.0; Sterilization at 120 ° C for 20 min.
  • the speed of the 6-bladed disk stirrer is 850 rpm, the ventilation rate is 0.5: 1 wm, the temperature is set to 30 ° C.
  • the culture is regulated to an acidity range from pH 6.8 to 7.1 with 4 N NaOH (lower limit) and 6 NH 2 SO 4 (upper limit). Glucose is added in solid form at a concentration of 20 g / l for the 45th hour. At the time of harvest after 55 hours, the culture reaches a dry biomass concentration of 55 g TS / 1 and a product concentration of 91% in the biomass.
  • DSM 11348 is resuspended with 1 ml of physiological NaCl solution and in an amount of 1 ml in 100 ml of culture medium of the following composition (g / 1): glycerol 30; Soy peptone 10; KH 2 PO 4 1; CaCl 2 0.015; Trace salt solution 2.5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6.8 to 7.0; Sterilization at 120 ° C for 20 min.
  • the 500 ml culture flasks are shaken for 28 hours at 30 ° C on a rotary table.
  • this first cultivation culture serves as inoculation material for 1 1 medium of the second cultivation culture in a 1.5 1 bioreactor with the usual technical standard for stirring, aeration, temperature control and pH-stating.
  • the medium has the following composition (g / 1): glycerol 30; Casamino acids 20; KH 2 PO 4 1; CaCl 2 0.030; Trace salts 5 ml; Aqua dest ad 1 1; pH 6.8 to 7.0; Sterilization at 120 ° C for 20 min.
  • the speed of the 4-blade disc stirrer is 400 rpm, the ventilation rate is 0.5: 1 wm, the temperature is set to 30 ° C.
  • the acidity of the culture is regulated with 4 N NaOH (lower limit range) and 6 NH 2 SO (upper limit range) from pH 6.8 to 7.1. After a fermentation time of 22 hours, the culture has reached 6.5 g TS / 1 dry biomass and is in an amount of 10% by volume on 2 1 of the main culture medium in a 2.5 1 bioreactor with the usual technical standard for stirring, Be - Transfer ventilation, temperature control and pH stating.
  • the medium has the following composition (g / 1): glycerol 50; Casamino acids 20, KH 2 PO 4 0.5; CaCl 2 0.030; Trace salt solution 5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6.8 to 7.0; Sterilization at 120 ° C for 20 min.
  • the speed of the 6-blade stirrer is 850 rpm, the ventilation rate is 0.5: 1 wm, the temperature is set to 30 ° C.
  • the acidity of the culture is regulated to pH 6.8 to 7.1 with 4 N NaOH (lower limit) and H 2 SO (upper limit). 50 g of glycerol 1 are added at the 23rd hour. At the time of harvest, the fermentation batch reached a dry matter concentration of 27 g TS / 1 and a product concentration of 65% in the biomass after 47 hours.
  • DSM 11348 is resuspended with 1 ml of physiological NaCl solution and 1 ml of this is transferred to 100 ml of growth medium of the following composition (g / 1): glucose 20; Bactotrypton 10; KH 2 PO 4 1, CaCl 2 0.015; Trace salt solution 2.5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6.8 to 7.0; Sterilization at 120 ° C for 20 min.
  • the 500 ml culture flasks are shaken for 40 hours at 30 ° C on a rotary table (200 rpm).
  • a ripening criterion they have a bio-dry matter concentration of 6.5 g TS / 1 and an acidity of pH 6.8. In an amount of 10% of the volume, they serve as inoculation material for 1 1 main culture medium in a 1.5 1 bioreactor with the usual technical equipment for stirring, aeration, temperature control and pH stating.
  • the medium has the following composition (g / 1): soy peptone 20; KH 2 PO 4 0.5; CaCl 2 0.015; Trace salt solution 2.5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6.8 to 7.0; Sterilization at 120 ° C for 20 min.
  • the speed of the 4-blade disc stirrer is 400 rpm, the ventilation rate is 0.5: 1 wm, the temperature is set to 30 ° C.
  • the acidity of the culture is regulated to pH ⁇ 7.05 with 50% acetic acid. After a fermentation time of 42 hours, the culture reaches a dry biomass concentration of 15 g TS / 1 and a product concentration of 50% PHB in the biomass.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues mikrobielles Herstellungsverfahren für Polyhydroxyalkanoate durch sterile aerobe Fermentation eines bakteriellen Mikroorganismus auf einem flüssigen Nährmedium, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Mikroorganismus der Stamm Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 verwendet wird.

Description

Mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten
Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten, bevorzugt Polyhydroxybuttersäure, auf fermentativem Wege. Das Verfahren kann zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten angewendet werden.
Polyhydroxyalkanoate, vor allem Polyhydroxybuttersäure, werden durch zahlreiche Miko- organismen biosynthetisiert (Babel, W., Riis, V. und Hainich, E.: Plaste und Kautschuk [1990] 37, 109). Wirtschaftliches Interesse erlangten die Biopolymere aufgrund ihrer thermoplastischen Eigenschaften und ihrer Bioabbaubarkeit. Hohe zelluläre Produktkon- zentrationen sind vor allem bei den Bakteriengattungen Alcaligenes, Azotobacter, Psen- domonas sowie Bacillus bekannt (Anderson, A. J. and Dawes, E. A.: Microbial Review [1990] 54, 450). Neuere Entwicklungen betreffen die Herstellung und Kultivierung re- kombinanter Stämme von Escherichia coli sowie transgener Pflanzen (Steinbüchel, A.: Current Opinion in Biotechnol [1992] 3, 291). In bezug auf die Produktvielfalt sind biochemisch begründete Stoffwechselveränderungen ebenso in der Bearbeitung wie die Gewinnung von Derivaten.
Industriell produziert wird das Heteropolymer Polyhydroxybuttersäure-Polyhydroxyvaleri- ansäure (Hartley, P.: Energie [1991] ^3, 48). Biotechnologisch relevante Verfahren ver- wenden anorganische Stickstoffquellen und Glucose, Saccharose, Melasse, Methanol sowie Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquellen. In der Patentanmeldung DE 196 30 175.0 wird ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Polyhydroxybuttersäure durch Kultivierung eines Stammes von Methylobacterium auf Glycerol als Kohlenstoff- und Energiequelle dargestellt. Die Supplementation mit Inhaltsstoffen technischer Rohstoffe bzw. Proteinhydrolysaten oder Aminosäuren in geringen Konzentrationen wurde beschrieben (Fujita, M., Nakamura, K, Kuroki, H., Yoshie, N. and Inoue, Y.: Int. J. Biol. Macromol. [1993] 15, 253). Hohe Raum-Zeit-Ausbeuten werden durch fed-batch-Fermentationen mit bilanzierten Dosage-Regimen erreicht. Wird Alcaligenes eutrophus als Produktionsstamm auf Glucose-Mineralsalz-Medium ein- gesetzt (z.B. EP 046 344, US 4477654), so wird eine zweiphasige Fermentation mit
Wachstums- und Produktbildungsabschnitt vorgeschlagen. Eine derartige Prozeßcharakteristik fuhrt zu zwei Einschränkungen des Verfahrens: Einerseits ist es erforderlich, den Beginn der Produktsynthese durch spezielle Dosagenprofile der limitierenden Substrate reproduzierbar zu sichern. Andererseits hat das Auftreten eines produktfreien bzw. produktarmen Wachstumsabschnittes eine verlängerte Fermentationszeit zur Folge.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein ökonomisch effektives Kultivierungsverfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten mit einer Verkürzung der Fermentationszeit sowie Vereinfachung der Kultivierungsbedingungen zu entwickeln.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der Kultivierungsprozeß mit dem Mikroorganismusstamm Ralstonia eutropha {Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 in einem Medium mit Stickstoff- und Kohlenstoffquellen sowie Mineralsalzen und Spurenelementen durchgeführt wird. Der Stamm ist eine Mutante von Ralstonia eutropha {Alcaligenes eutrophus) DSM 531. Die Hinterlegung des Stammes DSM 11348 erfolgte am 19.12.1996 bei der Deutschen Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkultu- ren GmbH. (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, gemäß "Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren".
Der erfindungsgemäße Mikroorganismusstamm Ralstonia eutropha DSM 11348 unterscheidet sich vom Ausgangsstamm Ralstonia eutropha {Alcaligenes eutrophus) DSM 531 wie folgt:
Bei Kultivierung im Schüttelkolben in Mineralsalzmedium ohne organische N-Quelle mit Glucose als C-Quelle (Temperatur 30 °C) wächst der Stamm DSM 11348 mit einer höheren spezifischen Wachstumsrate von μ = 0,17 h"1 im Vergleich mit dem Ausgangsstamm DSM 531 μ = 0,06 h"1). Bei Verwendung von α-Ketoglutarsäure (2 g/i) als C-Quelle be- trägt die maximale spezifische Wachstumsrate des Stammes DSM 11348 μ = 0,12 h"1 und die des Ausgangsstammes DSM 531 nur μ = 0,025 h*1.
Die mutative Veränderung in der DNA von DSM 11348 gegenüber dem Ausgangsstamm DSM 531 wird folgendermaßen nachgewiesen: Die Gesamt-DNA der Stämme wird mit der Restriktionsendonuklease Sspl (Erkennungssequenz in der DNA: AAT. ATT) fragmentiert. Dabei entstehen DNA-Fragmente mit einer Größe von etwa 10 bis 500 kb (kb: Kilobasen), die mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese aufgetrennt werden. Im Größenbereich zwischen 100 und 145 kb sind beim Ausgangsstamm DSM 531 DNA-Fragmente folgender Größe nachweisbar (kb): 100; 106; 117,5; 127,4; 135,2; 140; 144,7.
Beim Bakterienstamm DSM 11348 liegen im Vergleich mit dem Ausgangsstamm DSM 531 folgende Veränderungen vor: Das Fragment 135,2 kb Größe fehlt. Zusätzlich 5 vorhanden ist ein DNA-Fragment mit einer Größe von 112,4 kb.
Es wurde gefunden, daß durch den Einsatz des neuen Mikroorganismenstammes Ralstonia eutropha DSM 11348 in Bioprozessen die Biosynthese der Polyhydroxyalkanoate, vorzugsweise der Polyhydroxybuttersäure, nicht von der Limitation des Stoffwechsels durch Ammonium oder Phosphat oder Sauerstoff abhängt, sondern wachstumsassoziiert verläuft.
10 Es zeigte sich überraschend, daß mit dem neuen Mikroorganismus Ralstonia eutropha DSM 11348 offenbar aufgrund seiner genetisch/biochemischen Konstitution hohe Po- lyhydroxyalkanoat-Konzentrationen ohne den üblichen zweiphasigen Bioprozeß erreicht werden. Da die Ammoniumsalze im Medium vollständig durch Proteinhydrolysaten in Form von Peptonen oder Aminosäuregemischen als organische Stickstoffquellen ersetzbar
15 sind, stehen somit salzarme Medien für die mikrobielle Polyhydroxyalkanoat-Produktion zur Verfügung. Unter diesen Bedingungen kann der Bioprozeß auf den Medien mit komplexer Stickstoffquelle unter Zusatz von Glucose oder Glycerol oder Essigsäure als Kohlenstoffquelle durchgeführt werden. Das Bioverfahrensregime auf der Grundlage dieses Mediumsprinzips erstreckt sich durchgängig von der Stammhaltung über die emerse und
20 submerse Anzuchtpassagierung bis in die submerse Hauptfermentation.
Die Fermentation erfolgt nach einer volumenadäquaten Vorzucht in der submersen Hauptkultur unter aeroben und kontaminationsfreien Bedingungen, indem der Stamm Ralstonia eutropha {Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 in einem flüssigen Medium bei Temperaturen von 20 bis 37 °C sowie einer Acidität von pH 6,0 bis 8,0 für die Dauer von 24 bis 120
25 Std. kultiviert wird.
Der Ablauf des gesamten Verfahrens läßt sich allgemein wie folgt charakterisieren: Glycerolkonserven des oben genannten Stammes, die bei -18°C deponiert werden und bakterielles Zellmaterial in einer Konzentration von 6 bis 10 g Biotrockensubstanz (TS)/1 enthalten, dienen als Impfmaterial für die erste submerse Anzuchtpassage in
30 500 ml- Steilbrustflaschen mit 100 bis 150 ml Medium. Das Inoculum enthält Peptone bzw. Proteinhydrolysate, Glucose bzw. Glycerol, KH2PO und/oder K2HPO4 sowie eine Spu- rensalzmischung. Die Substratkombination wird qualitativ über alle Fermentationsstufen beibehalten. Nach 42 bis 72stündiger Kultivierung bei 28 bis 32°C auf einem Rundschwingtisch mit 180 bis 220 rpm hat das biologische Material eine Konzentration von 6 bis 12 gTS/1 erreicht. Nach Ausreifen der ersten Flüssigkeitskultur erfolgt gegebenenfalls die Beimpfüng einer zweiten submersen Anzuchtpassage in einer Menge von 5 bis 10% des Ansatzvolumens. Die Kultivierung der zweiten Flüssigkeitspassage erfolgt entweder in 2,5 Liter- Steilbrustflaschen mit 400 ml des Proteinhydrolysat-Mediums oder in gerührten und belüfteten Rührkesselreaktoren mit einem Fermentationsvolumen von 5 bis 25 1 bei üblichem biotechnischen Ausrüstungsgrad für Rührung, Belüftung und pH-Statierung. Die Kultivierungszeit beträgt 20 bis 40 Std. bei einer Temperatur von 30 bis 32 °C. Für die Aciditätskorrektur werden NaOH (unterer pH-Grenzwert) sowie H2SO4 (oberer pH- Grenzwert) verwendet. Die Hauptkultur in einem Rührkesselreaktor mit gleichfalls üblichem biotechnischen Ausrüstungsgrad wird in einer Menge von 5 bis 10 % des Mediumvolumens mit der ausgereiften Vorkultur beimpft und für die Dauer von 24 bis 120 Std. unter Rührung, Belüftung, pH-Statierung und Nachdosage von Glucose oder Glycerol oder Essigsäure durchgeführt.
Als organische Stickstoffquellen sind Proteinhydrolysate als Peptone oder Aminosäuregemische aus pflanzlichen Produkten (Sojaprotein), tierischen Produkten (Casein, Gelatine, Fleisch) oder mikrobieller Biomasse geeignet. Der Proteinaufschluß erfolgt mit bekannten technischen Verfahren durch mineralische oder enzymatische Hydrolyse. Die Proteinhydrolysate mit einem Gehalt an organischem Stickstoff von 8 bis 15 % werden im Medium in Konzentrationen von 10 bis 50 g/1 eingesetzt.
Als Kohlenstoffquelle wird entweder Glucose oder Glycerol oder Essigsäure verwendet. Von den beiden erstgenannten Substraten wird jeweils nur eines nach separater Sterilisation dem Medium in Konzentrationen von 10 bis 100 g/1 zugesetzt. Während der Fermen- tation wird bei Erreichen von 10 bis 20 g Glucose/1 oder 10 bis 20 g Glycerol/1 eine Menge von 20 bis 50 g/1 des betreffenden Substrates nachdosiert. Essigsäure kommt als 10 bis 90 %ige wäßrige Lösung zur Anwendung, indem sie dem Bioprozeß über das Dosageregime zur pH-Statierung recursiv zugeführt wird. Sie dient der Kompensation des adäquat zum Wachstum verlaufenden pH- Anstiegs, der durch die NHt-Freisetzung aus der organischen Stickstoffquelle und durch die Aufnahme der Säureanionen im Austausch gegen Hydroxyl- ionen zustande kommt. Unter diesen Bedingungen erreichen die Fermentationsansätze, bezogen auf die Biotrok- kenmasse, nach 45 Std. Produktkonzentrationen von 50 bis 85 % Polyhydroxyalkanoat als Polyhydroxybuttersäure. Die Raum-Zeit- Ausbeute auf einem Pepton/Glucose-Medium beträgt im 2 1-Maßstab 0,91 g Produkt/1 • Std. Die Isolierung des Produktes aus der Bio- masse erfolgt in bekannter Weise mit oder ohne Zellaufschluß.
Die nachfolgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren erläutern, aber in keiner Weise beschränken.
Experimenteller Teil
Die in den Beispielen verwendete Spurensalzlösung hat folgende Zusammensetzung (g/1):
MgSO4 • 7 H2O 71,200
ZnSO4 - 7 H2O 0,440
MnSO4 • 6 H2O 0,812 CuSO4 - 5 H2O 0,785
Na2MoO4 - 2 H2O 0,252
FeSO4 7 H2O 4,980
H3BO3 1,020
H2SO4 IN 100 ml Aqua dest. ad 1 1
Beispiel 1
1 ml einer Glycerolkonserve von Ralstonia eutropha {Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 wird mit 1 ml physiologischer NaCl-Lösung resuspendiert und auf 100 ml Anzuchtmedium folgender Zusammensetzung in 500 ml- Steilbrustflaschen übertragen (g/1): Glucose 20; Bactotrypton 10; KH2PO4 1; CaCl20,015; Spurensalzlösung 2,5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120 °C. Die Anzuchtkulturen werden 36 Std. lang bei 30 °C auf einem Rundschwingtisch (200 rpm) geschüttelt. Als Reifekriterium zeigen sie eine Biotrockenmassekonzentration von 6,5 bis 7,5 g TS/1 und eine Acidität von pH 6,7 bis 6,8. Sie dienen in einer Menge von 10 % als Impfmaterial für 2 1 Hauptkulturmedium in einem 2,5 1-Bioreaktor mit üblicher technischer Ausstattung für Rührung, Belüftung, Tem- perierung und pH-Statierung. Das Medium weist folgende Zusammensetzung auf (g/1): Glucose 100; Bactotrypton 20; KH2PO4 0,5; CaCl2 0,015; Spurensalzlösung 2,5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120 °C. Die Drehzahl des 6-Blatt-Schei- benrührers beträgt 850 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0,5 : 1 wm, die Temperatur wird auf 30 °C eingestellt. Die Kultur wird auf einen Aciditätsbereich von pH 6,8 bis 7,1 mit 4 N NaOH (unterer Grenzwert) und 6 N H2SO4 (oberer Grenzwert) geregelt. Zur 45. Std. wird Glucose in fester Form in einer Konzentration von 20 g/1 zugesetzt. Zum Erntezeitpunkt nach 55 Std. erreicht die Kultur eine Biotrockenmasse-Konzentration von 55 g TS/1 und eine Produktkonzentration von 91 % in der Biomasse.
Beispiel 2
1 ml einer Glycerolkonserve von Ralstonia eutropha {Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 wird mit 1 ml physiologischer NaCl-Lösung resuspendiert und in einer Menge von 1 ml in 100 ml Anzuchtmedium folgender Zusammensetzung gebracht (g/1): Glycerol 30; Soja- pepton 10; KH2PO4 1; CaCl2 0,015; Spurensalzlösung 2,5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120 °C. Die 500 ml-Anzuchtkolben werden 28 Std. bei 30 °C auf einem Rundschwingtisch geschüttelt. Als Reifekriterium zeigen sie eine Biotrockenmasse- Konzentration von 1,5 bis 2 g TS/1 bei einer Acidität von pH 6,9 bis 7,1. Diese erste Anzuchtkultur dient in einer Menge von 10 % des Volumens als Impfmaterial für 1 1 Medium der zweiten Anzuchtkultur in einem 1,5 1-Bioreaktor mit üblichem technischen Standard für Rührung, Belüftung, Temperierung und pH-Statierung. Das Medium weist folgende Zusammensetzung auf (g/1): Glycerol 30; Casaminosäuren 20; KH2PO4 1; CaCl20,030; Spurensalze 5 ml; Aqua dest ad 1 1; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120°C. Die Drehzahl des 4-Blatt-Scheibenrührers beträgt 400 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0,5 : 1 wm, die Temperatur wird auf 30 °C eingestellt. Die Acidität der Kultur wird mit 4 N NaOH (unterer Grenzbereich) und 6 N H2SO (oberer Grenzbereich) von pH 6,8 bis 7,1 geregelt. Nach einer Fermentationszeit von 22 Std. hat die Kultur 6,5 g TS/1 Biotrockenmasse erreicht und wird in einer Menge von 10% des Volumens auf 2 1 des Hauptkulturmediums in einem 2,5 1-Bioreaktor mit üblichem technischen Standard für Rührung, Be- lüftung, Temperierung und pH-Statierung übertragen. Das Medium weist folgende Zusammensetzung auf (g/1): Glycerol 50; Casaminosäuren 20, KH2PO4 0,5; CaCl2 0,030; Spurensalzlösung 5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120 °C. Die Drehzahl des 6-Blatt-Scheibenrührers beträgt 850 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0,5 : 1 wm, die Temperatur wird auf 30 °C eingestellt. Die Acidität der Kultur wird mit 4 N NaOH (unterer Grenzwert) und H2SO (oberer Grenzwert) auf pH 6,8 bis 7,1 geregelt. Zur 23. Stunde werden 50 g Glycerol 1 hinzugefügt. Der Fermentationsansatz erreicht zum Erntezeitpunkt nach 47 Std. eine Biotrockenmasse- Konzentration von 27 g TS/1 und eine Produktkonzentration von 65 % in der Biomasse.
Beispiel 3
1 ml einer Glycerolkonserve von Ralstonia eutropha {Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 wird mit 1 ml physiologischer NaCl-Lösung resuspendiert und davon 1 ml auf 100 ml Anzuchtmedium folgender Zusammensetzung übertragen (g/1): Glucose 20; Bactotrypton 10; KH2PO4 1, CaCl2 0,015; Spurensalzlösung 2,5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120 °C. Die 500 ml-Anzuchtkolben werden 40 Std. lang bei 30 °C auf einem Rundschwingtisch (200 rpm) geschüttelt. Als Reifekriterium weisen sie eine Biotrok- kenmasse-Konzentration von 6,5 g TS/1 und eine Acidität von pH 6,8 auf. Sie dienen in einer Menge von 10 % des Volumens als Impfmaterial für 1 1 Hauptkulturmedium in einem 1,5 1-Bioreaktor mit üblicher technischer Ausrüstung für Rührung, Belüftung, Temperierung und pH-Statierung. Das Medium weist folgende Zusammensetzung auf (g/1): Soja- pepton 20; KH2PO4 0,5; CaCl2 0,015; Spurensalzlösung 2,5 ml; Aqua dest. ad 1 1; pH 6,8 bis 7,0; Sterilisation 20 min 120 °C. Die Drehzahl des 4-Blatt-Scheibenrührers beträgt 400 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0,5 : 1 wm, die Temperatur wird auf 30 °C eingestellt. Die Acidität der Kultur wird mit 50 %iger Essigsäure auf pH < 7,05 geregelt. Nach einer Fermentationszeit von 42 Std. erreicht die Kultur eine Biotrockenmassekonzentration von 15 g TS/1 und eine Produktkonzentration von 50 % PHB in der Biomasse.

Claims

Patentansprüche
1. Mikrobielles Herstellungsverfahren für Polyhydroxyalkanoate durch sterile aerobe Fermentation eines bakteriellen Mikroorganismus auf einem Medium mit Stickstoff- und Kohlenstoffsubstraten sowie Mineralsalzen für die Dauer von 24 bis 120 Stunden bei Temperaturen von 20 bis 37 °C und bei einer Acidität von pH 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Ralstonia eutropha {Alcaligenes eutrophus) DSM 11348, unabhängig von einer bioprozeßtechnischen Substratlimitation, in einem komplexen Kulturmedium mit organischen Stickstof verbindungen als Stickstoffquelle und einer Kohlenstoffquelle kultiviert wird.
2. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die organischen
Stickstoffverbindungen in der Kulturlösung in einer Konzentration von 10 g/1 bis 50 g/1 vorliegen.
3. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die organischen Stickstoffverbindungen mikrobielle, pflanzliche oder tierische Proteinhydrolysate oder Aminosäuregemische mit einem organischen StickstofFgehalt von 8 bis 15 g/1 sind.
4. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteinhydrolysate in Form von Peptonen oder Aminosäuregemischen aus bakteriellen oder pilzlichen Biomassen, Casein, Sojaprotein, Gelatine oder Fleisch mit einem bekannten technischen Verfahren zur mineralischen oder enzymatischen Hydrolyse herge- stellt sind.
5. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die organischen Stickstoffverbindungen die einzige Stickstoffquelle im Kulturmedium darstellt.
6. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium 5 g/1 bis 120 g/1 beträgt. Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Glucose oder Glycerol oder Essigsaure dient
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 und 7 dadurch gekennzeichnet, daß in den emer- sen und submersen Anzuchtpassagen nur Glucose oder Glycerol, jedoch in der Fermentationsstufe nur Essigsaure verwendet wird
Mikrobielles Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium der Fermentationsstufe anfanglich nur Proteinhydrolysate als or- ganisches Nahrsubstrat enthalt und Essigsaure nur im Verlauf der Fermentation über die permanente Einstellung der Acidität auf pH 6 bis 8 als Kohlenstoffsubstrat zugesetzt wird
Der Stamm Ralstonia eutropha {Alcaligenes eutrophus) DSM 11348
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1159435A1 (de) * 1999-03-05 2001-12-05 Monsanto Technology LLC Multigen-expressionsvektoren zur biosynthese von produkten durch multienzym-biosynthesewege
KR20040046678A (ko) * 2002-11-28 2004-06-05 (주) 켐포트 폴리-베타-하이드록시 부틸산을 생산하는 신규의 미생물 및 그를 이용한 고농도 발효 제조방법
CA2848574A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 Oakbio Inc. Chemoautotrophic conversion of carbon oxides in industrial waste to biomass and chemical products

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3343576A1 (de) * 1983-12-01 1985-06-13 Lentia GmbH Chem. u. pharm. Erzeugnisse - Industriebedarf, 8000 München Verfahren zur biotechnologischen herstellung von poly-d(-)-3-hydroxybuttersaeure
JPH03224492A (ja) * 1990-01-29 1991-10-03 Showa Denko Kk 共重合体およびその製造法
NL9201803A (nl) * 1992-10-16 1994-05-16 Inst Voor Agrotech Onderzoek PHB-producerend microorganisme, werkwijze voor het verkrijgen van een PHB-producerend microorganisme, werkwijze voor het produceren van PHB en werkwijze voor het verwijderen van glycerol uit een glycerol bevattend medium.
GB9503174D0 (en) * 1995-02-17 1995-04-05 Zeneca Ltd Polymer production

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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