FI103054B - Menetelmä dulsiitin valmistamiseksi laktoosista - Google Patents

Description

, 103054

Menetelmä dulsiitin valmistamiseksi laktoosista

Keksintö koskee dulsiitin valmistusta laktoosin käymisreaktiolla Kluyveromyces-suvun galaktokinaasinega-5 tiivisten mutanttien avulla.

On tunnettua, että Kluyveromyces-suvun galaktoki-naasinegatiivisilla mutanteilla on kyky pilkkoa disakkari-dilaktoosi glukoosiksi ja galaktoosiksi, metaboloida glukoosi ja olla vaikuttamatta galaktoosiin. (Michael I. 10 Riley et ai. J. Bacteriol. 158, 1984, 705 - 712, ja Pierre Galzy et ai., DE-hakemusjulkaisu 2 434 874.) Lisäksi on tunnettua, että on olemassa myös sellaisia mutantteja, jotka pystyvät hydraamaan tässä reaktiossa muodostuneen galaktoosin dulsiitiksi saannon ollessa korkeintaan noin 15 50 % (M.-Helene Marin et ai. J. Basic Microbiol. 27, 1987, 505 - 510).

Jos dulsiittia halutaan valmistaa laktoosista tällä etukäteen tunnetulla tavalla, on välttämätöntä muuttaa tämä ensin suvun Kluyveromyces galaktokinaasinegatiivisella 20 mutantilia, eristää muodostunut galaktoosi tai galaktoosin ja dulsiitin seos ja sitten muuttaa hydrauksen avulla dulsiitiksi (Beilstein 4. painos, 3. täydennyslaitos, ensimmäinen osa, 2405 - 2406) . Tämä menetelmä on kuitenkin oleellisesti kalliimpi kuin dulsiitin valmistus Madagas- • · t • 25 kar-mannasta (Melampyrum nemorosum) (Römpps Chemie-Lexi- kon, 8. painos, Franck'sche Verlagshandlung, Stuttgart, s. 1027) .

Keksinnön mukainen menetelmä tekee mahdolliseksi laktoosin muuttamisen dulsiitiksi käymisreaktiolla Kluyve-30 romyces-suvun galaktokinaasinegatiivisten mutanttien kans- sa saantojen ollessa suuria. Saatu dulsiitti ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan tai vain pieniä määriä galaktoosia (tavallisesti alle 5 %) ja se voidaan sen vuoksi puhdistaa käyttäen yksinkertaista uudelleenkitey-35 tystä - esimerkiksi etanolin vesiliuoksesta.

= 103054

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että laktoosin käymisreaktiossa suvun Kluyveromyces galaktokinaasinegatiivisten mutanttien kanssa a) käymisviljelmään lisätään laktoosin pääpiirteis-5 sään tapahtuneen hydrolyysin jälkeen litraa kohti 5 - 25 g glukoosia tai b) käyminen tapahtuu "resting-cell"-menetelmän olosuhteissa .

Keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseen voi-10 daan käyttää Kluyveromyces'in mutantteja, joita on kuvattu jo mainituissa julkaisuissa Riley et ai., Galzy et ai. tai Marin et ai.

Koska kaikkia mutantteja, joita on mainittu näissä julkaisuissa, ei ole vapaasti alan ammattilaisten käytet-15 tävissä, Marinin et ai. kuvaamissa olosuhteissa suoritettiin omia mutaatiokokeita ja saatiin mutantti, jolla on sisäinen merkintä 144 EH ja jolla oli kaikkien oleellisten tunnusmerkkien suhteen taksonomisesti Kluyveromyces mar-xianus var. lactis'in ominaisuudet (J. Lodder "The 20 Yeasts", North-Holland Pubi. Comp., Amsterdam 1971, 349 -352) . Tämä mutantti talletettiin kokoelmaan Deutsche Samm-lung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-3300 Braunschweig numerolla DSM 6119, se on vapaasti alan ammattilaisten käytettävissä ja on osoittautunut erittäin

• « V

• 25 sopivaksi keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseen.

Keksinnön mukainen menetelmä toteutetaan olosuhteissa, joita käytetään myös substraattien tunnetuissa mikrobiologisissa muuntamisissa hiivaviljelmillä.

Hiivaviljelmille, erityisesti Kluyveromyces-vilj el-30 mille, tavallisesti käytetyissä viljelyolosuhteissa kasva-\ tetaan sopivassa kasvatusaineessa esiviljelmiä ilmastamal la ja sekoittamalla.

Menetelmävaihtoehdon a toteuttamiseksi tasaosa tätä esiviljelmää siirretään käymisväliaineeseen, joka sisältää 35 tavallisten ravintoaineiden lisäksi litraa kohti viljelmää 3 103054 10 - 50 g (erityisesti 20 - 30 g) laktoosia. Sen jälkeen käytetään sekoittamalla ja ilmastamalla lämpötilassa 25 -30 °C pH-arvon ollessa 4-6, kunnes vähintään noin 95 % laktoosista on pilkkoutunut hydrolyyttisesti, käymisvil-5 jelmään lisätään grammaa kohti laktoosia 0,25 - 1 g (edullisesti 0,4 - 0,6 g) glukoosia ja käytetään edelleen, kunnes reaktio pysähtyy.

Ihanteellinen laktoosipitoisuus ja glukoosipitoi-suus, ihanteellinen glukoosilisäyksen ajankohta ja ihan-10 teellinen käymisen kesto riippuvat käytetyn Kluyveromyces- mutantin lajista ja käymisolosuhteista. Nämä suureet täytyy määrittää, kuten se on tavallisesti tarpeen mikrobiologisissa substraattimuutoksissa, yksittäisessä tapauksessa esikokeiden avulla, jollaiset ovat alan asiantuntijalle 15 tuttuja.

Käymisen kulun selvittämiseksi viljelmästä voidaan ottaa näytteitä aikavälein ja määrittää näistä tavallisella tavalla - esimerkiksi ohutlevykromatografiän avulla -niiden laktoosi-, galaktoosi-, glukoosi- ja dulsiittipi-20 toisuus.

Menetelmävaihtoehdon toteuttamiseksi vaihtoehdon a olosuhteissa, mutta ilman laktoosilisäystä, kasvatetaan Kluyveromyces-viljelmä. Noin 24 - 48 tunnin lisääntymis-vaiheen jälkeen solumassa erotetaan suodattamalla tai sen- ·»« - - 25 trifugoimalla, pestään ja suspendoidaan uudelleen mahdol lisesti isotonoituja lisäyksiä ja puskuriaineita sisältävään 0,5 - 10 (edullisesti 1-5) -painoprosenttiseen laktoosin vesiliuokseen niin, että solutiheys tässä suspensiossa on 2 - 5 kertaa niin suuri kuin käymisviljelmässä.

30 Sitten fermentoidaan sekoittamalla ja ilmastamalla, kunnes ' reaktio pysähtyy.

Myös tässä tapauksessa on tarpeen määrittää ihanteelliset reaktiomuuttujat esikokeiden avulla.

Tapahtuneen reaktion jälkeen dulsiitti voidaan 35 eristää vaihtoehdon a tai b mukaan saaduista käymiseristä 4 103054 yksinkertaisesti. Tämä voi tapahtua esimerkiksi niin, että erät suodatetaan tai sentrifugoidaan, saaduista liuoksista poistetaan epäorgaaniset suolat, haihdutetaan ja dulsiitti kiteytetään lisäämällä sopivia liuottimia, kuten etanolia.

) 5 Niin valmistettua dulsiittia voidaan - mahdollises ti uudelleenkiteytyksen jälkeen - käyttää esimerkiksi sokerittomana makeutusaineena.

Seuraavien suoritusesimerkkien tarkoituksena on selvittää lähemmin keksinnön mukaista menetelmää.

10 Suoritusesimerkkejä:

Esimerkki 1

Kahden litran erlenmeyerpulloon, jossa on 1 1 steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 5 g/1 (NH4)2S04 15 1 g/l KH2P04 0,5 g/l MgS04*7H20 0,1 g/l NaCl 0,1 g/l CaCl2 400 pg/l nikotiinihappoa 20 2 pg/l biotiinia 400 pg/l tiamiinihydrokloridia 10 pg/l adeniinia 5 g/l laktoosia - pH säädetty arvoon 4 - 25 istutetaan ymppi, joka sisältää Kluyveromyces marxianus DSM 6119 -soluja, ja ravistellaan 36 tuntia lämpötilassa 30 °C 190 kierrosta minuutissa.

50 litran fermentoriin, jossa on 40 1 saman koostumuksen omaavaa steriiliä ravintoliuosta kuin esiviljelmäs-30 sä, istutetaan 1 1 esiviljelmää. Erä temperoidaan lämpöti-*. laan 30 °C ja sekoitetaan 24 tunnin ajan 100 kierrosta minuutissa ja ilmastetaan 1 m3:llä ilmaa tunnissa.

50 litran fermentoriin, jossa on 32 1 saman koostumuksen omaavaa steriiliä ravintoliuosta kuin esifermento-35 rissa, mutta jossa on 20 g/l laktoosia ja pH on säädetty 5 103054 arvoon 5, istutetaan 4 1 esifermentoriri viljelmää ja sekoitetaan lämpötilassa 30 °C 100 kierrosta minuutissa ja ilmastetaan 1 m3:llä ilmaa tunnissa.

Säädetään pH-arvoa niin, että se ei laske arvon pH 5 5 alapuolelle. 48 tunnin kuluttua lisätään steriili liuos, joka sisältää 400 g glukoosia 4 l:ssa vettä.

96 tunnin kuluttua erä sekoitetaan 100 g:n kanssa aktiivihiiltä ja 100 g:n kanssa perliittiä ja suodatetaan. Soluttomasta viljelmäuutteesta poistetaan suolat elektro-10 dialyysilaitteessa johtavuusarvoon 0,2 mS asti. Liuos vä-kevöidään alipaineessa noin 1 litraksi ja sekoitetaan yhtä suuren tilavuuden kanssa etanolia. Kiteisenä tuotteena saadaan 374 g dulsiittia.

Esimerkki 2 15 500 ml:n erlenmeyerpulloon, jossa on 100 ml ste riiliä ravintoliuosta, joka sisältää 3 g/1 hiivauutetta 3 g/1 mallasuutetta 5 g/1 peptonia 20 10 g/1 laktoosia, istutetaan ymppi, joka sisältää Kluyveromyces marxianus DSM 6119 -soluja ja ravistellaan 24 tuntia lämpötilassa 30 °C 180 kierrosta minuutissa.

Solut erotetaan väliaineesta sentrifugoimalla, pes-25 tään kerran 0,9-prosenttisella keittosuolaliuoksella ja suspendoidaan uudelleen 20 ml:aan deionisoitua vettä, joka sisältää 0,5 g/1 MgCl2 ja 10 g/1 laktoosia ja jonka pH on säädetty arvoon 4,5.

Erää ravistellaan lämpötilassa 30 °C 180 kierrosta 30 minuutissa. 24 tunnin kuluttua solut erotetaan sentrifugoimalla. Käyttäen DC-analytiikkaa saadaan selville se, että päällä oleva liuos sisältää dulsiittia 5 g/1.

Vertailuesimerkki

Esiviljelmän ja esifermentorin kasvatus tapahtuu, 35 kuten esimerkissä 1 on kuvattu.

« 6 103054 50 litran fermentoriin, jossa on 36 1 saman koostumuksen omaavaa ravintoliuosta kuin esifermentorissa mutta ) jossa on laktoosia 20 g/1 ja jonka pH on säädetty arvoon 5, istutetaan 4 1 esifermentoriviljelmää ja sekoitetaan f 5 lämpötilassa 30 °C 100 kierrosta minuutissa ja ilmastetaan 1 m3:llä ilmaa tunnissa. Säädetään pH-arvoa niin, että se ei laske arvon pH 5 alapuolelle.

72 tunnin kuluttua erä sekoitetaan 100 g:n kanssa aktiivihiiltä ja 100 g:n kanssa perliittiä ja suodatetaan.

10 Soluttomasta viljelmäuutteesta poistetaan suolat elektro-dialyysilaitteessa johtavuusarvoon 0,2 mS asti. Liuos vä-kevöidään alipaineessa noin 1 litraksi ja sekoitetaan yhtä suuren tilavuuden kanssa etanolia. Kiteisenä tuotteena saadaan 160 g galaktoosia ja 212 g dulsiittia.

• » »

Claims (3)

7 103054

1. Menetelmä dulsiitin valmistamiseksi laktoosin käymisreaktiolla suvun Kluyveromyces galaktokinaasinega- 5 tiivisten mutanttien avulla, tunnettu siitä, että a) käymisviljelmään lisätään laktoosin pääpiirteissään tapahtuneen hydrolyysin jälkeen litraa kohti 5 - 25 g glukoosia tai b) käyminen tapahtuu "resting-cell"-menetelmän olo- 10 suhteissa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä dulsiitin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että käymiseen käytetään viljelyväliainetta, joka sisältää litraa kohti 10 - 50 g laktoosia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä dulsii tin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että käyminen suoritetaan mutantin Kluyveromyces marxianus DSM 6119 avulla. • « β 103054