HU213016B - Method for producing dulcite from lactose - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás dulcit előállítására laktóznak a Kluyveromyces nemzetséghez tartozó galaktokináz negatív mutánsok segítségével végzett fermentatív átalakításával.

Ismeretes, hogy a Kluyveromyces nemzetséghez tartozó galaktokináz negatív mutánsok rendelkeznek azzal a képességgel, hogy a laktóz diszacharidot glükózzá és galaktózzá hasítsák, a glükózt metabolizálják és a galaktózt érintetlenül hagyják [Michael I. Riley et al., J. Bacteriol., 158, 705-712 (1984) és Pierre Galzy et al., DE-A 2 434 874 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat]. Ismeretes továbbá az is, hogy vannak olyan mutánsok, amelyek képesek az ezen átalakítás során keletkezett galaktózt 50%-ig terjedő kitermeléssel dulcittá redukálni [M.-Héléne Marin et al., J. Basic Microbiol., 27, 505-510 (1987)].

Amennyiben ezen az előbb ismertetett úton akarunk dulcitot laktózból előállítani, úgy arra van szükség, hogy először a laktózt egy, a Kluyveromyces nemzetséghez tartozó galaktokináz negatív mutánssal átalakítsuk, a keletkezett galaktózt vagy galaktózból és dulcitból álló elegyet izoláljuk, és utána hidrogénezéssel dulcittá alakítsuk (Beilstein 4. Auflage, 3. Ergánzungswerk, 1. Bánd, 2405-2406). Ez az eljárás azonban lényegesen költségesebb, mint a dulcit madagaszkár-mannából (Melampyrum nemorosum) való kinyerése (Römpps Chemie-Lexikon, 8. Auflage, Franck’sche Verlangshandlung, Stuttgart, 1027. old.).

A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy laktózt a Kluyveromyces nemzetséghez tartozó galaktokináz negatív mutánsokkal végzett fermentatív átalakítással jó kitermeléssel dulcittá alakítsunk. A kapott dulcit galaktózt gyakorlatilag nem vagy csak kis mennyiségben (rendszerint 5%-nál kevesebb) tartalmaz, és ennélfogva egyszerű átkristályosítással - például vizes etanolból - megtisztítható.

A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy laktóznak a Kluyveromyces nemzetséghez tartozó galaktokináz negatív mutánsokkal végzett fermentatív átalakítása során

a) a fermentációs tenyészethez a laktóz legalább 95%os hidrolízise után 1 g laktózra számítva 0,25-1 g glükózt adunk, vagy

b) a fermentációt a „resting-cell” eljárás körülményei között hajtjuk végre.

A „resting cell” fogalmat a leírás keretében a

Römpps Chemie Lexikon 9. kiadása (G, Thieme Veri., 1992, New York-Frankfurt, V. kötet, p. 3852) értelmében alkalmazzuk.

A találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez olyan

Kluyveromyces mutánsok használhatók, amelyeket Riley és munkatársai, Galzy és munkatársai vagy Marin és munkatársai előbb már említett közleményeikben leírnak.

Mivel nem minden, a fenti közleményekben leírt mutáns szabadon hozzáférhető a szakemberek számára, a Marin és munkatársai által leírt körülmények között saját mutációs kísérleteket végeztünk, és egy saját használatra 144 EH megnevezéssel ellátott mutánst kaptunk, amely taxonómiailag a Kluyveromyces marxianus var. lactis öszszes lényeges jellemvonásával (J. Lodder „The Yeasts”, North-Holland Publ. Compl., Amsterdam 1971, 349352. old.) rendelkezik. Ezt a mutánst a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH intézménynél (D-33OO Braunschweig) DSM 6119 számon letétbe helyeztük, az a nyilvánosság részére szabadon hozzáférhető, és a találmány szerinti eljárás kivitelezésére különösen alkalmasnak bizonyult.

A találmány szerinti eljárást olyan körülmények között hajtjuk végre, amilyeneket szubsztrátok élesztőtenyészetekkel végzett ismert mikrobiológiai átalakításainál használnak.

Az élesztőtenyészetek, különösen Klyuveromyces tenyészetek esetében szokásosan alkalmazott tenyésztési körülmények között alkalmas táptalajban levegőztetés és keverés közben előtenyészeteket nevelünk.

Az a) eljárásváltozat kivitelezéséhez ezen előtenyészet egy alikvot részét átvisszük egy fermentációs táptalajba, amely a szokásos tápanyagok mellett a tenyészet 1 literére számítva 10-50 g (különösen 20-30 g) laktózt tartalmaz. Utána keverés és levegőztetés közben 2530 °C-on és 4-6 pH-értéknél addig fermentálunk, amíg a laktóz körülbelül 95%-a hidrolitikusan elhasad, majd a fermentációs tenyészethez 1 gramm laktózra számítva 0,25-1 g (előnyösen 0,4-0,6 g) glükózt adunk, és tovább fermentálunk, amíg az átalakítás befejeződik.

Az optimális laktózkoncentráció és az optimális glükózkoncentráció, a glükózadagolás optimális időpontja és az optimális fermentációs időtartam az alkalmazott Kluyveromyces mutáns fajtájától és a fermentációs körülményektől függ. Ezeket, amint az a mikrobiológiai szubsztrát-átalakításoknál általában szükséges, az egyes esetekben előkísérletekkel határozzák meg, amint az a szakemberek által ismert.

A fermentáció menetének ellenőrzésére a tenyészetből bizonyos időtartamok elteltével mintákat vehetünk, és ezekben szokásos módon - például vékonyréteg-kromatográfiával - meghatározhatjuk a laktóz-, galaktóz-, glükóz- és dulcittartalmat.

A b) eljárásváltozat kivitelezése esetén az a) eljárásváltozatnál megadott feltételek között, de laktóz hozzáadása nélkül nevelünk egy Kluyveromyces tenyészetet. Egy körülbelül 24-től 48 óráig tartó növekedési szakasz után a sejttömeget szűréssel vagy centrifugálással elválasztjuk, mossuk és adott esetben izotonizáló adalékokat és pufferanyagokat is tartalmazó 0,510 (előnyösen 1-5) tömeg%-os vizes laktózoldatban újra szuszpendáljuk úgy, hogy a fermentációs tenyészetnél 2-5-ször magasabb sejtsűrűségű szuszpenziót kapjunk. Ezt követően keverés és levegőztetés közben addig fermentálunk, amíg az átalakítás befejeződik.

Ebben az esetben is előkísérletekkel kell meghatározni az optimális reakcióparamétereket.

Sikeres átalakítás után a dulcit az a) vagy b) eljárásváltozatok szerint kapott fermentációs elegyekből egyszerű módon izolálható. Ez történhet például úgy, hogy az elegyeket szűrjük vagy centrifugáljuk, a kapott oldatokat mentesítjük a szervetlen sóktól, bepároljuk, és a dulcitot alkalmas oldószer, például etanol hozzáadásával kristályosítjuk.

HU 213 016 Β

Az így előállított dulcit - adott esetbe átkristályosítás után - például cukormentes édesítőszerként használható.

A következő megvalósítási példák a találmány szerinti eljárás részletesebb szemléltetésére szolgálnak.

Megvalósítási példák:

1. példa

Egy 2 literes Erlenmeyer-lombikba 1 liter alábbi összetételű steril táptalajt töltünk:

g/1 ammónium-szulfát, g/1 kálium-dihidrogén-foszfát,

0,5 g/1 magnézium-szulfát-víz (1/7),

0,1 g/1 nátrium-klorid,

0,1 g/1 kalcium-klorid,

400 pg/l nikotinsav, jxg/l biotin,

400 pg/l tiamin-hidroklorid, mg/1 adenin, g/1 laktóz, a pH 4-re beállítva.

A táptalajt Kluyveromyces marxianus DSM 6119 sejtek oltótenyészetével beoltjuk, és 36 óra hosszat 30 °C-on és percenkénti 190 fordulat mellett rázatjuk.

Egy 50 literes fermentorban levő 40 liter steril táptalajt, amelynek összetétele azonos az előtenyészetével, beoltunk 1 liter előtenyészettel. Az elegyet 30 °C-on tartjuk, és 24 óra hosszat percenkénti 100 fordulattal kevertetjük, és óránként 1 m³ levegővel levegőztetjük.

Egy 50 literes fermentorban levő 32 liter steril táptalajt, amelynek összetétele azonos az előtenyészetével, azonban még 20 g/1 laktózt is tartalmaz, és pH-ja

5-re van beállítva, beoltunk 4 liter előfermentor-tenyészettel, 30 °C-on percenkénti 100 fordulattal keverjük, és óránként 1 m³ levegővel levegőztetjük.

A pH-t úgy szabályozzuk, hogy az ne essen 5 alá. 48 óra múlva hozzáadjuk 400 g glükóz 4 liter vízzel készített steril oldatát.

óra elteltével az elegyhez 100 g aktívszenet és 100 g perlitet adunk, és megszűrjük. A sejtmentes tenyészlevet egy elektrodializátor készülékben 0,2 mS vezetőképességig sómentesítjük. Az oldatot vákuumban körülbelül 1 literre töményítjük. Kristályos anyag alakjában 374 g dulcitot kapunk.

2. példa

Egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba 100 ml következő összetételű steril táptalajt töltünk:

g/1 élesztőkivonat, g/1 malátakivonat, g/1 pepton,

100 g/1 laktóz.

Az oldatot Kluyveromyces marxianus DSM 6119 sejtek oltótenyészetével beoltjuk, és 24 óra hosszat 30 °C-on és percenkénti 180 fordulattal rázatjuk.

A sejteket centrifugálással elválasztjuk a táptalajtól, egyszer mossuk 0,9 tömeg%-os nátrium-klorid-oldattal, és utána újból szuszpendáljuk 0,5 g/1 magnéziumkloridot és 10 g/1 laktózt tartalmazó, 20 ml ionmentes vízzel készített 4,5 pH-ra állított oldatban.

Az elegyet 30 °C-on percenkénti 180 fordulattal rázatjuk. 24 óra múlva a sejteket centrifugáljuk. Vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal megállapítjuk, hogy a felülúszó 5 g/1 dulcitot tartalmaz.

Referencia példa:

3. példa

Az előtenyészet nevelése és az előfermentáció az 1. példában leírtak szerint történik.

Egy 50 literes fermentorban levő 36 liternyi steril tápoldatot, amelynek összetétele azonos az előtenyészetével, azonban még 20 g/1 laktózt is tartalmaz és amelynek pH-ját 5-re állítottuk, beoltunk 4 liternyi előfermentor tenyészettel, 30 ”C-on percenkénti 100 fordulattal keverjük, és óránként 1 m³ levegővel levegőztetjük. A pH-t úgy szabályozzuk, hogy az ne essen 5 alá.

óra elteltével az elegyhez 100 g aktívszenet és 100 g perlitet adunk, és megszűrjük. A sejtmentes tenyészlevet elektrodializáló készüléken 0,2 mS vezetőképességig sómentesítjük. Az oldatot vákuumban körülbelül 1 literre betöményítjük, és azonos térfogatú etanollal elegyítjük. Kristályos anyag alakjában 160 g galaktózt és 212 g dulcitot kapunk.

Claims (3)

1. Eljárás dulcit előállítására laktóznak a Kluyveromyces nemzetséghez tartozó galaktokináz negatív mutánsok segítségével végzett fermentatív átalakításával, azzal jellemezve, hogy

a) a fermentációs tenyészethez a laktóz legalább 95%os hidrolízise után 1 g laktózra számítva 0,25-1 g glükózt adunk, vagy

b) a fermentációt a „resting-cell” eljárás körülményei között hajtjuk végre.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás dulcit előállítására, azzal jellemezve, hogy a fermentációhoz olyan táptalajt használunk, amely literenként 10-50 g laktózt tartalmaz.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás dulcit előállítására, azzal jellemezve, hogy a fermentációt a Kluyveromyces marxianus DSM 6119 mutáns segítségével végezzük.