CN101805759A - 一种以木薯粉为原料生产l-乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以木薯粉为原料生产L-乳酸的方法，是以木薯粉或木薯粉水解液为原料、以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CASL CGMCC № 2183为发酵菌种，以同步液化糖化发酵(SLSF)方式、以同步糖化发酵(SSF)方式或以两步发酵(TSF)方式，35～45℃发酵培养72～125小时获得含L-乳酸的发酵液；利用本发明工艺生产的L-乳酸其浓度可达到175g/L，生产速率为1.8g/L.h。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产L-乳酸的方法，尤其一种以廉价木薯粉为原料生产L-乳酸的方法，属于有机酸生产领域。
背景技术
乳酸(Lactic Acid)又名二羟基丙酸，是世界三大有机酸之一。作为一种传统的多用途精细化学品，L-乳酸作为酸味剂、杀菌剂、乳化剂、助染剂在食品、医药、纺织、化工等方面有很广泛的应用。乳酸是一种手性分子，按其构型及旋光性可分为L-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸。由L-乳酸作为主要单体制成的聚乳酸具有良好的生物相容性和生物可降解性。聚乳酸易被自然界中的各种微生物或动植物体内的酶分解代替，最终形成二氧化碳和水，不污染环境，因而被认为是最有前途的可生物降解高分子材料。用这种环境友好的生物材料来替代聚氯乙稀(PVC)、聚丙烯(PP)塑料等造成白色污染的材料有很大的社会和环境意义。作为聚乳酸的合成单体，L-乳酸，一直是国内外乳酸行业的研究热点。
乳酸的生产方法主要有化学合成法、酶合成法和发酵法三种。发酵法是L-乳酸工业化生产的主要方法。微生物发酵法生产乳酸，可通过菌种和培养条件的选择而获得D-乳酸、L-乳酸或是两者一定比例的混合物，能以淀粉、纤维素等可再生资源分解所得到的葡萄糖等为原料发酵生产乳酸，且生产成本低、产品安全性高，已成为全世界近80％的厂家生产L-乳酸采用的方法。
乳酸菌和根霉菌是微生物发酵生产L-乳酸常用菌株。与根霉菌相比，乳酸菌发酵生产L-乳酸产酸量高，转化率高，副产物少，后提取与生产调控比较简单，成本较低，因此，近年来，采用细菌发酵生产乳酸研究越来越多，其产业化发展也越来越好。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CASL CGMCC №2183是一株同型L-乳酸发酵菌，以葡萄糖为底物，生成235g/L的L-乳酸，转化率为94.5％～96.5％(中国专利200710176057.7)。
L-乳酸的生产成本是制约L-乳酸应用的关键因素之一。一些廉价可再生的原料，如各种淀粉、糖蜜、纤维素等，含有丰富的碳水化合物，可用于L-乳酸的生产。木薯是世界上第六大作物，适应性强，耐水、耐旱，可以在任何土质中都能生长。木薯富含淀粉(70％-80％)，在一些贫穷的地区可作为食物，但是在我国木薯是一种重要的非粮食类经济作物。由于木薯中含有氰化物，因此食用未经加工的木薯会患有神经性疾病。据统计，2007年，世界木薯主产国的总产量达2.26亿吨，仅有43％木薯被加工，大量的木薯未被开发利用。通过检索，木薯粉和木薯渣可用于生产丙酮、乙醇和丁醇(中国专利：200710041216.2，中国专利：200910301331.8〖CN101525648〗)，以木薯粉为原料生成L-乳酸的专利鲜有报道。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种以廉价木薯粉为原料生产L-乳酸的方法，即以木薯粉或木薯粉水解液为原料发酵得到L-乳酸。
本发明所述以木薯粉为原料生产L-乳酸的方法，是以木薯粉或木薯粉水解液为原料发酵得到L-乳酸；其特征在于：所述以木薯粉为原料发酵得到L-乳酸的方法是以200～300g/L木薯粉、酵母粉7～15g/L、碳酸钙150～180g/L、α-淀粉酶10～20U/g木薯粉和糖化酶50～104U/g木薯粉为发酵培养基，以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CASL CGMCC № 2183为发酵菌种，同时进行木薯粉液化、糖化和与乳酸发酵，即以同步液化糖化发酵(SLSF)方式发酵得到L-乳酸；所述以木薯粉水解液为原料发酵得到L-乳酸的方法是在实施发酵前先将木薯粉配成木薯粉溶液，调pH为6.0，添加过量的α-淀粉酶，在95℃条件下液化，制得每升含木薯粉200～300g的液化液，再向液化液中加入糖化酶50～104U/g木薯粉，同时进行木薯粉糖化和以鼠李糖乳杆菌(Lactobaciilus rhamnosus)CASL CGMCC№2183为发酵菌种的乳酸发酵，即以同步糖化发酵(SSF)方式发酵木薯粉水解液得到L-乳酸；或者，在实施发酵前先将木薯粉配成木薯粉溶液，调pH为6.0，添加过量的α-淀粉酶，在95℃条件下液化，制得每升含木薯粉200～300g的液化液，再将液化液调pH为4.2，添加50～104U/g木薯粉的糖化酶，42℃条件下糖化，然后以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CASL CGMCC№2183为发酵菌种进行乳酸发酵，即以两步发酵(TSF)方式发酵木薯粉水解液得到L-乳酸。
上述以木薯粉为原料发酵得到L-乳酸的方法优选以275g/L木薯粉、酵母粉10g/L、碳酸钙165g/L、α-淀粉酶20U/g木薯粉和糖化酶104U/g木薯粉为发酵培养基。
上述以木薯粉水解液为原料发酵得到L-乳酸的方法中，向液化液中加入糖化酶的量优选为104U/g木薯粉。
本发明所述以木薯粉为原料生产L-乳酸方法的具体步骤如下：
(1)斜面培养：菌种选用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CASL CGMCC№2183，将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CASL CGMCC№2183菌种接种于含有1.5g/100ml琼脂的固体斜面培养基上，35～45℃条件下，培养24～48小时；
(2)种子培养：将步骤(1)的斜面培养物，在无菌条件下接种到30ml种子培养基中，35～45℃条件下，静止培养10～24小时，加入中和剂控制发酵液pH，制得种子培养液；
(3)发酵培养：以5～15％体积比的接种量，将种子培养液接种于发酵培养基中，以同步液化糖化发酵(SLSF)方式、以同步糖化发酵(SSF)方式或以两步发酵(TSF)方式发酵(发酵工艺流程见图1)，35～45℃培养72～125小时，获得含L-乳酸的发酵液；
(4)处理样品：取发酵液6,000转/分钟离心5分钟，取上清液；
(5)样品检测：取上清液稀释，检测葡萄糖含量、总还原糖含量、L-乳酸含量和菌落密度(OD620)。
其中，上述培养过程中加入的中和剂为碳酸钙，控制pH为5.5～7。
其中，葡萄糖和L-乳酸的测定方法为，发酵液离心后稀释，采用生物传感分析仪SBA-80(山东省科学院生物研究所)测定。
生物传感分析仪SBA-80是以固定化酶为传感器的分析仪器，底物与氧气、水在酶的催化下生成双氧水。反应放出的双氧水与白金-银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与底物浓度成线性比例关系，通过测定电流信号强度可得出底物浓度。
总还原糖含量测定采用DNS法。
菌落密度(OD620)测定方法为，添加2M HCl中和发酵液中碳酸钙，使用7200型可见分光光度计(UNICO上海仪器有限公司)测定620nm下的波长。参比溶液为未接种的发酵培养基。
生产速率计算方法：生产速率(g/L.h)＝L-乳酸浓度(g/L)÷反应时间(h)
转化率计算方法：转化率(g/g)＝L-乳酸浓度(g/L)÷初始淀粉浓度(g/L)
本发明利用廉价的木薯粉为底物，以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CASLCGMCC№2183为发酵菌株，以木薯粉同步液化糖化、木薯粉水解液同步糖化发酵、木薯粉水解液两步发酵等发酵路线，获得一个适用于工业化的高效转化木薯粉生产L-乳酸的工艺。本发明所述的发酵培养基成分易得，且配方简单，成本低廉，所述的工艺方法简便易操作；利用本发明工艺生产的L-乳酸其浓度可达到175g/L，生产速率为1.8g/L.h。
附图说明
图1为本发明所述不同的发酵工艺流程图。
图2为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CASL CGMCC№2183发酵生产L-乳酸过程中葡萄糖和L-乳酸随时间变化过程曲线。
其中：▲为葡萄糖；■为L-乳酸；◆为OD620
具体实施方式
本发明所使用的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CASL来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏时间2007年09月，保藏登记号为CGMCC№2183；该菌株已于中国专利CN200710176057.7中公开。
本发明所使用木薯粉来源于连云港联化化学品有限公司。
本发明所使用α-淀粉酶(4万U/ml)和糖化酶(26万U/g)来源于山东安克生物工程有限公司。
木薯粉水解液制备方法为：配适当浓度的木薯粉溶液，调pH为6.0，添加过量的α-淀粉酶，95℃水浴液化，用碘-碘化钾检测颜色变化。液化完毕，样品取出冷却。调pH为4.2，添加26～130U/g木薯粉的糖化酶，42℃水浴糖化。测定水解液中还原糖浓度确定糖化终止时间。
下面通过实施例进一步阐明本发明。
实施例1、以木薯粉为原料在三角瓶中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基：葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，吐温80 1ml/L，七水合硫酸镁0.58g/L，四水合硫酸锰0.25g/L，碳酸钙15g/L，琼脂粉15g/L。该培养基的初始pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
种子培养基：葡萄糖50g/L，酵母粉15g/L，碳酸钙30g/L。该培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。
发酵培养基：木薯粉275g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙165g/L，α-淀粉酶20U/g木薯粉，糖化酶104U/g木薯粉。115℃条件下灭菌20分钟。
采用的工艺为同步液化糖化发酵法。
本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CASL CGMCC № 2183菌种接种于固体斜面培养基上，42℃培养24小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，42℃静置培养20小时，制得种子培养液；
(3)发酵培养：在装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，42℃静置培养120小时，结束发酵，获得含L-乳酸的发酵液。实验共设3次重复。
发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，根据上述方法检测发酵液中葡萄糖浓度和L-乳酸浓度，计算L-乳酸生成速率。
结果表明：葡萄糖的浓度为0g/L，L-乳酸浓度187g/L±7g/L，转化率0.8g/g，L-乳酸生产速率为1.6g/L.h。
实施例2、以木薯粉水解液为原料两步发酵法工艺生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基：同实施例1。
发酵培养基：木薯粉水解液275g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙165g/L。该培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。
采用的工艺为两步发酵法。
木薯粉水解液可按照下述方法制备，配适当浓度的木薯粉溶液，调pH为6.0，添加过量的α-淀粉酶(20U/g木薯粉)，95℃水浴液化，用碘-碘化钾检测颜色变化。液化完毕，样品取出冷却。调pH为4.2，添加104U/g木薯粉的糖化酶，42℃水浴糖化。测定水解液中还原糖浓度确定糖化终止时间。
本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：同实施例1。
发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，根据上述方法检测发酵液中葡萄糖浓度和L-乳酸浓度，计算L-乳酸生成速率。结果表明葡萄糖的浓度为37g/L±3g/L，L-乳酸浓度145g/L±10g/L，转化率0.59g/g，L-乳酸生产速率为1.2g/L.h。
实施例3、以木薯粉水解液为原料同步糖化发酵工艺生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：木薯粉液化溶液275g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙165g/L。115℃条件下灭菌20分钟。
采用的工艺为同步糖化发酵法。
本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：配适当浓度的木薯粉溶液，调pH为6.0，添加过量的α-淀粉酶(20U/g木薯粉)，95℃水浴液化，用碘-碘化钾检测颜色变化。液化完毕，样品取出冷却。木薯粉液化溶液配置成适当的浓度，添加酵母粉、碳酸钙，115℃条件下灭菌20分钟。发酵液冷却，添加104U/g木薯粉的糖化酶，在装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，42℃静置培养120小时，结束发酵，获得含L-乳酸的发酵液。实验共设3次重复。
取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度和L-乳酸浓度，计算L-乳酸生产速率和转化率。
结果表明：葡萄糖的浓度为0g/L，L-乳酸浓度156g/L±9g/L，转化率0.63g/g，L-乳酸生产速率为1.3g/L.h。
实施例4、以木薯粉水解液清液为原料在三角瓶中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：木薯粉液化溶液275g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙165g/L。115℃条件下灭菌20分钟。
采用的工艺为同步糖化发酵法。
本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：配适当浓度的木薯粉溶液，调pH为6.0，添加过量的α-淀粉酶(20U/g木薯粉)，95℃水浴液化，用碘-碘化钾检测颜色变化。液化完毕，样品取出冷却、离心(6000转/分，10分钟)取上清液用于L-乳酸发酵。木薯粉液化溶液配置成适当的浓度，添加酵母粉、碳酸钙，115℃条件下灭菌20分钟。发酵液冷却，添加104U/g木薯粉的糖化酶，在装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，42℃静置培养120小时，结束发酵，获得含L-乳酸的发酵液。实验共设3次重复。
取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度和L-乳酸浓度，计算L-乳酸生产速率和转化率。
结果表明：葡萄糖的浓度为0g/L，L-乳酸浓度181g/L±4g/L，转化率0.73g/g，L-乳酸生产速率为1.5g/L.h。
实施例5、以木薯粉水解液以及不同浓度糖化酶在三角瓶中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：木薯粉液化溶液275g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙165g/L。115℃条件下灭菌20分钟。
采用的工艺为同步糖化发酵法。
本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：配适当浓度的木薯粉溶液，调pH为6.0，添加过量的α-淀粉酶(20U/g木薯粉)，95℃水浴液化，用碘-碘化钾检测颜色变化。液化完毕，样品取出冷却、离心(6000转/分，10分钟)取上清液用于L-乳酸发酵。木薯粉液化溶液配置成适当的浓度，添加酵母粉、碳酸钙，115℃条件下灭菌20分钟。发酵液冷却，添加26-130U/g木薯粉的糖化酶，在装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，42℃静置培养120小时，结束发酵，获得含L-乳酸的发酵液。实验共设3次重复。
发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度和L-乳酸浓度，计算L-乳酸生产速率和转化率。结果见表1。
表1 糖化酶浓度对L-乳酸生成的影响
| 糖化酶浓度(U/g木薯粉) | L-乳酸浓度(g/L) | 转化率(g/g) | L-乳酸生产速率(g/L.h) |
| 26 | 152±1 | 0.63 | 1.3 |
| 52 | 161±4 | 0.65 | 1.3 |
| 78 | 170±1 | 0.69 | 1.4 |
| 104 | 179±3 | 0.73 | 1.5 |
| 130 | 174±6 | 0.70 | 1.4 |
实施例6、以不同浓度木薯粉水解液为原料在三角瓶中发酵生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：木薯粉液化溶液200-350g/L，酵母粉5g/L，碳酸钙165g/L。115℃条件下灭菌20分钟。
采用的工艺为同步糖化发酵法。
本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：配适当浓度的木薯粉溶液，调pH为6.0，添加过量的α-淀粉酶(20U/g木薯粉)，95℃水浴液化，用碘-碘化钾检测颜色变化。液化完毕，样品取出冷却、离心(6000转/分，10分钟)取上清液用于L-乳酸发酵。木薯粉液化溶液配置成适当的浓度，添加酵母粉、碳酸钙，115℃条件下灭菌20分钟。发酵液冷却，添加104U/g木薯粉的糖化酶，在装有90ml发酵培养基的300ml三角瓶中接入10ml步骤(2)的种子养液，42℃静置培养，L-乳酸和葡萄糖浓度保持稳定，结束发酵，获得含L-乳酸的发酵液。实验共设3次重复。
发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度和L-乳酸浓度，计算L-乳酸生产速率和转化率。结果见表2。
表2木薯粉浓度对L-乳酸生成的影响
| 木薯粉液化液浓度(g/L) | L-乳酸浓度(g/L) | 转化率(g/g) | L-乳酸生产速率(g/L.h) |
| 200 | 158±3 | 0.88 | 1.7 |
| 225 | 170±4 | 0.84 | 2.4 |
| 250 | 189±3 | 0.84 | 2.6 |
| 275 | 205±5 | 0.83 | 2.1 |
| 300 | 232±0 | 0.86 | 1.6 |
| 350 | 225±5 | 0.77 | 1.6 |
实施例7、以木薯粉水解液为原料在5升发酵罐中发酵法生产L-乳酸
该实施例中所用的培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基：木薯粉液化溶液275g/L，酵母粉5g/L，碳酸钙165g/L。115℃条件下灭菌20分钟。
采用的工艺为同步糖化发酵法。
本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：同实施例1；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中，42℃静置培养20小时；1升三角瓶中加入400ml种子培养基，将30ml种子培养液接入400ml种子培养基，42℃静置培养20小时，制得种子培养液；
(3)发酵培养：配适当浓度的木薯粉溶液，调pH为6.0，添加过量的α-淀粉酶(20U/g木薯粉)，95℃水浴液化，用碘-碘化钾检测颜色变化。液化完毕，样品取出冷却、离心(6000转/分，10分钟)取上清液用于L-乳酸发酵。木薯粉液化溶液配置成适当的浓度，添加酵母粉、碳酸钙，115℃条件下灭菌20分钟。发酵液冷却，上海保兴BIOTECH 5升发酵罐中加入3.6升发酵培养基，在发酵培养基中接入400ml种子培养液，添加104U/g木薯粉的糖化酶，42℃静置培养，L-乳酸和葡萄糖浓度保持稳定，结束发酵，获得含L-乳酸的发酵液。实验共设3次重复。
发酵结束时，取发酵液，6,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖浓度和L-乳酸浓度，计算L-乳酸生产速率和转化率。
结果表明：葡萄糖的浓度为0g/L，L-乳酸浓度175g/L±2g/L，转化率0.80g/g，L-乳酸生产速率为1.8g/L.h。
Claims (3)
1.一种以木薯粉为原料生产L-乳酸的方法，是以木薯粉或木薯粉水解液为原料发酵得到L-乳酸；其特征在于：所述以木薯粉为原料发酵得到L-乳酸的方法是以200～300g/L木薯粉、酵母粉7～15g/L、碳酸钙150～180g/L、α-淀粉酶10～20U/g木薯粉和糖化酶50～104U/g木薯粉为发酵培养基，以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CASL CGMCC № 2183为发酵菌种，同时进行木薯粉液化、糖化和与乳酸发酵，即以同步液化糖化发酵方式发酵得到L-乳酸；所述以木薯粉水解液为原料发酵得到L-乳酸的方法是在实施发酵前先将木薯粉配成木薯粉溶液，调pH为6.0，添加过量的α-淀粉酶，在95℃条件下液化，制得每升含木薯粉200～300g的液化液，再向液化液中加入糖化酶50～104U/g木薯粉，同时进行木薯粉糖化和以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CASL CGMCC № 2183为发酵菌种的乳酸发酵，即以同步糖化发酵方式发酵木薯粉水解液得到L-乳酸；或者，在实施发酵前先将木薯粉配成木薯粉溶液，调pH为6.0，添加过量的α-淀粉酶，在95℃条件下液化，制得每升含木薯粉200～300g的液化液，再将液化液调pH为4.2，添加50～104U/g木薯粉的糖化酶，42℃条件下糖化，然后以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CASL CGMCC № 2183为发酵菌种进行乳酸发酵，即以两步发酵方式发酵木薯粉水解液得到L乳酸。
2.根据权利要求1所述的以木薯粉为原料生产L-乳酸的方法，其特征在于：所述以木薯粉为原料发酵得到L-乳酸的方法是以275g/L木薯粉、酵母粉10g/L、碳酸钙165g/L、α-淀粉酶20U/g木薯粉和糖化酶104U/g木薯粉为发酵培养基。
3.根据权利要求1所述的以木薯粉为原料生产L-乳酸的方法，其特征在于：所述以木薯粉水解液为原料发酵得到L-乳酸的方法中，向液化液中加入糖化酶的量为104U/g木薯粉。
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