CN102337227B

CN102337227B - 胚芽乳酸杆菌及其用途

Info

Publication number: CN102337227B
Application number: CN2010102337986A
Authority: CN
Inventors: 林文鑫
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Pharmaceutical University; China Medical University
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2010-07-22
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2030-07-22
Also published as: CN102337227A

Abstract

一种经分离的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其寄存于德国国家菌种保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)，寄存编号为DSM 23780。一种包含胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的组合物，及胚芽乳酸杆菌菌株CMU995用于制造抑制病原菌、保护胃肠道、及预防或治疗泌尿道感染的药物或保健食品的用途。

Description

胚芽乳酸杆菌及其用途

技术领域

本发明关于乳酸杆菌菌株及其用途，尤其关于经分离的胚芽乳酸杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)CMU995及其用途，其寄存于德国国家菌种保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)，寄存编号为DSM 23780，寄存日期为2010年7月15日，寄存机构地址为Inhoffen straβe 7B，38124Braunschweig，德国。

背景技术

乳酸杆菌为存在于人类和动物肠道中的主要细菌，由于其具有许多有益于人体及动物体的生理活性，故常应用于各种益生菌(probiotic)产品中。举例言之，乳酸杆菌可抑制肠内病原菌(例如沙门氏菌或大肠杆菌)的生长，或抵抗病原菌的入侵，例如可防止沙门氏菌属的伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)侵入胃肠道上皮细胞。

目前已有许多乳酸杆菌用于抑制病原菌的应用的相关专利，例如美国专利第5,603,930号中所揭露的约氏乳酸杆菌菌株(Lactobacillusjohnsonii)，可抑制肠毒素及肠侵入性病原菌；美国专利第3,953,609号中所揭露的雷特氏乳酸杆菌菌株(Lactobacillus lactis)，可抑制消化系统中大肠杆菌的生长；以及美国专利第6,491,956号中所揭露的嗜酸乳酸杆菌菌株(Lactobacillus acidophilus)，可预防及治疗由幽门螺旋杆菌感染所造成的胃炎、十二指肠溃疡及胃溃疡。

乳酸杆菌若欲于动物体内有效地发挥功能，除须具备基本的生理/药理活性外，尚须具有两个重要特性。首先，该乳酸杆菌须对动物胃肠道所分泌的胃酸和胆碱具有耐受性，才可存活于消化系统中而到达肠道，进而发挥作用。再者，该乳酸杆菌对动物宿主的肠道上皮细胞须有牢固的吸附能力，才可于胃肠道中与病原菌竞争吸附，免于因遭病原菌排除，而无法发挥功能。此外，由于病原菌亦借助吸附肠道上皮细胞的方式来感染动物体，若乳酸杆菌对肠道上皮细胞具有相对牢固的吸附能力，亦可达到排除病原菌，保护胃肠道免受感染的效果。

本案发明人自新生儿的粪便中，筛选出一种新颖胚芽乳酸杆菌菌株，且经由活体内(in vivo)及活体外(in vitro)的相关实验，发现其除具有抑制病原菌的功效外，尚具有优异的胃肠道及泌尿道细胞的附着性，故可持久且有效地保护胃肠道及泌尿道免受病原菌的感染。另发现，该菌株甚至可以直接抑制病原菌生长，积极预防及治疗由该病原菌所致的疾病。

发明内容

本发明的一目的在于提供一种经分离的胚芽乳酸杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)CMU995，其寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM 23780。

本发明的另一目的在于提供一种组合物，其包含胚芽乳酸杆菌菌株CMU995。

本发明的又一目的在于使用胚芽乳酸杆菌菌株CMU995制成抑制病原菌、保护胃肠道、及预防或治疗泌尿道感染的药物或保健食品等用途。

本发明的技术及较佳实施方式，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。

附图说明

图1所示为胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的基因指纹图谱。

本发明的经分离的胚芽乳酸杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)CMU995是寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM23780，寄存日期为2010年7月15日，寄存机构地址为Inhoffen straβe7B，38124 Braunschweig，德国。

具体实施方式

本案发明人自健康新生儿的粪便中，筛选并分离出一种新颖的乳酸杆菌菌株，经菌种鉴定为Lactobacillus plantarum(中文名称为胚芽乳酸杆菌或植物乳酸杆菌)，且经命名为Lactobacillus plantarum CMU995(以下称为胚芽乳酸杆菌菌株CMU995)。

如上所述，乳酸杆菌对动物宿主的肠道上皮细胞须有牢固的附着能力，才可于胃肠道中与病原菌竞争吸附，进而排除病原菌，以达成所欲的生理效果。经发现，胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可附着于胃肠道的上皮细胞，且相较于市面上常见的Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)乳酸菌，对胃肠道上皮细胞具有更强的吸附力。

胚芽乳酸杆菌菌株CMU995除可附着于胃肠道的上皮细胞外，亦可牢固地附着于泌尿道的上皮细胞，故可于泌尿道中与病原菌竞争吸附，进而排除病原菌，以达成保护泌尿道的功效。

由于胚芽乳酸杆菌菌株CMU995对胃肠道及泌尿道具良好附着性，其可用于预防或治疗病原菌的感染。就预防的应用而言，可将胚芽乳酸杆菌菌株CMU995添加于如饲料、饮料、营养补充品或保健食品中，使此菌株附着及保护食用者的胃肠道或泌尿道，而当病原菌入侵胃肠道或泌尿道时，由于无法与胚芽乳酸杆菌菌株CMU995竞争吸附，遂无法启动感染机制，而进一步被排出体外。就治疗应用方面，当人体或动物体的胃肠道或泌尿道遭病原菌感染时，举例言之，可服用包含胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的药物，透过胚芽乳酸杆菌菌株CMU995对胃肠道及泌尿道的吸附特性，排除附着于胃肠道或泌尿道内的病原菌，达成治疗效果。因此，胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可借助其强烈吸附力来抑制病原菌对胃肠道或泌尿道细胞的附着，进而预防或治疗病原菌的感染。

胚芽乳酸杆菌菌株CMU995除可拮抗病原菌对胃肠道或泌尿道的吸附，间接地抑制感染外，还可直接地抑制病原菌的生长，经由此二种抑制机制的加乘作用来保护胃肠道及/或泌尿道。因此，于本文中，“抑制病原菌”一词，包含抑制病原菌对胃肠道的附着、抑制病原菌对泌尿道的附着、以及抑制病原菌的生长。

胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可用于抑制胃肠道及/或泌尿道中的各种病原菌；举例言之，可抑制选自以下群组的病原菌：幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、大肠杆菌属(Escherichia spp.)、金黄色葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、志贺氏杆菌(Shigella flexneri)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、白色念珠球菌(Candida albicans)或前述的组合，尤其是用于抑制幽门螺旋杆菌。

幽门螺旋杆菌为革兰氏阴性、微需氧的致病菌，可生存于胃部及十二指肠的各区域内。幽门螺旋杆菌的传染途径迄今仍不明确，其会引起胃黏膜的慢性发炎，造成胃溃疡及十二指肠溃疡，甚至导致胃癌，因此，世界卫生组织宣布幽门螺旋杆菌为微生物型的致癌物质，也是第一个被发现可致癌的原核生物。全世界有超过五成的人口为幽门螺旋杆菌的带原者，尤其于发展中国家更为盛行。目前主要使用抗生素来治疗由幽门螺旋杆菌所引起的疾病，然而，由于其抗药性的产生，许多抗生素已无法达到令人满意的治疗效果。由于胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可明显地抑制幽门螺旋杆菌的生长及其对肠道上皮细胞的附着，故可用于结合、甚或取代传统的抗生素治疗方法，以有效地预防或治疗由幽门螺旋杆菌所引起的各种疾病。

此外，由于胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可直接抑制病原菌的生长，故可运用于预防及治疗由病原菌所引起的疾病，而不限于胃肠道相关疾病。举例言之，已知金黄色葡萄球菌属除可感染胃肠道外，亦可感染如呼吸道、尿道、静脉及伤口等部位，故可利用胚芽乳酸杆菌菌株CMU995抑制金黄色葡萄球菌属生长的特性，将其应用于上述感染部位的治疗或感染预防。另一方面，白色念珠球菌除可感染胃肠道外，亦可感染如口腔及泌尿道的黏膜组织，故亦可利用胚芽乳酸杆菌菌株CMU995抑制白色念珠球菌生长的特性，将其应用于经感染的口腔或泌尿道的治疗或感染预防。

由于胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的抑制病原菌生长及附着的特性，其可广泛地运用于各种医疗及保健产品中。因此，本发明亦提供一种组合物，其包含胚芽乳酸杆菌菌株CMU995。基于胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的上述特性，本发明的组合物可用于抑制病原菌、保护胃肠道、保护泌尿道或前述的组合。

本发明组合物可呈任何形式，举例言之，其可呈一选自以下群组的形式：医药组合物、饲料、饮料、营养补充品、食品、保健食品及乳制品，或者，可呈一选自以下群组的形式：喷剂及塞剂。于本发明的一实施方式中，胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可添加于食品中，例如制成包含此菌株的乳制品等。有关乳酸杆菌于医药组合物及食品的应用，可参考如于2007年3月1日公开的TW20050129645及于2006年4月16日公开的TW20040131385的专利申请文件。

可视需要于本发明组合物中添加任何适宜的添加物，进一步加强抑制病原菌生长及附着的效果，或者，添加其他营养或药性成分，以增加组合物的运用灵活性与调配度。举例言之，本发明组合物可另含有一种或多种如制酸剂及其他益生菌等其他活性成分，只要该活性成分对胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的效益没有不利的影响即可。

本发明亦提供一种胚芽乳酸杆菌菌株CMU995于制造药物或保健食品的用途，例如，其可用以制备成具任何合宜形式的用于抑制病原菌、保护胃肠道、及预防或治疗泌尿道感染的药物或保健食品。

兹以下列具体实施方式以进一步例示说明本发明。其中该些实施方式仅提供作为说明，而非用以限制本发明的范畴。

[实施例1]附着力分析：

实验A、制备乳酸杆菌菌株

进行胃肠道细胞的附着力分析所使用的乳酸杆菌菌株包括：本发明的Lactobacillus plantarum CMU995、Lactobacillus rhamnosus GG(LGG，鼠李糖乳酸杆菌)及本实验室分离的B7P3、A7G1、B1T4、IA5、HT5菌株。以MRS培养液(Difco，底特律，密西根州，美国)活化所有受试乳酸杆菌两次后，分别将其接种至5毫升的MRS培养液中进行培养。24小时后，取1毫升菌液，并以6000转/分钟离心10分钟，以pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS，phosphate buffer solution)清洗两次，再进行吸附试验。以Lactobacillus rhamnosus GG作为对照组。

实验B、培养胃肠道/泌尿道的细胞株

本实验使用的胃肠道细胞株为Caco-2人体肠癌细胞株(human colonadenocarcinoma，美国典型培养物保藏中心，American Type CultureCollection，ATCC，寄存编号：ATCC CRL 2102)及AGS胃癌细胞株(gastricadenocarcinoma，美国典型培养物保藏中心，寄存编号：ATCC CRL 1739)；使用的泌尿道细胞株为Hela人类子宫颈上皮细胞(美国典型培养物保藏中心，寄存编号：ATCC CCL-2)，皆购自台湾生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)，且已通过细菌、霉菌及霉浆菌(mycoplasma)污染测试。取得细胞株后，迅速将其移至37℃的恒温水浴槽中使其回温解冻，并培养于25平方厘米的培养皿中，再静置于37℃、含有5体积％二氧化碳的细胞培养箱中进行培养。细胞活化后继代数次，待细胞株稳定后才进行后续实验。Caco-2细胞的培养基为Dulbecco’s Modified Eagle培养基(DMEM，购自Gibco公司)，AGS细胞的培养基为F-12培养基(购自Gibco公司)，Hela细胞的培养基为最低基础培养基(Minimum essential medium，MEM，购自Gibco公司)，以上培养基皆需添加10体积％的胎小牛血清(fetal bovine serum，FBS)。

实验C、乳酸杆菌附着性分析

将实验B中制备的细胞株分别以1毫升的0.05体积％胰蛋白酶(trypsin)处理5分钟后，将其分装于一96孔培养盘中，每个孔中加入1×10⁴个细胞，每天置换200微升的新鲜培养基。接着，添加20微升的实验A中制备的乳酸杆菌菌液于细胞中，并培养1小时，使乳酸杆菌附着于细胞上。进行附着1小时后，移除培养基，使用磷酸盐缓冲溶液清洗五次，以去除未附着的乳酸菌，再添加100微升的10体积％福尔马林，以固定细胞及乳酸杆菌。30分钟后，再以磷酸盐缓冲溶液清洗细胞3次，最后以100微升结晶紫(crystal violet)进行染色达5分钟，并以少量75体积％酒精快速冲洗，以去除细胞上的染色剂。

利用相差显微镜观察各种乳酸杆菌对胃肠道或泌尿道上皮细胞的吸附性，并随机在不同的显微镜视野(randomized microscopic areas)下，观察并计算50个细胞的乳酸杆菌吸附情形，以及计算每个细胞的平均吸附乳酸杆菌数量。结果如表1所示。

表1：

由表1结果可知，相较于其他已知乳酸杆菌(包括国际知名且市面上常用的Lactobacillus rhamnosus GG)，胚芽乳酸杆菌菌株CMU995具有更优异的胃肠道及泌尿道细胞的附着性，故可对胃肠道及泌尿道提供更持久的保护。

[实施例2]抑制病原菌生长试验

实验D、细菌培养皿试验

利用洞扩散法(well-diffusion method)进行乳酸杆菌的抑菌能力评估。将无菌的Brucella洋菜培养基(Difco，底特律，密西根州，美国)倒入一细菌培养皿中，使其凝固，再将经隔夜培养的指标性胃肠道致病菌幽门螺旋杆菌Helicobacter pylori(购自台湾生物资源保存及研究中心，编号：BCRC 17021)及临床分离的Helicobacter pylori CMU83均匀涂布于洋菜培养基上，待菌液稍微干燥后，在培养基上打出直径为7毫米的孔洞，并于孔洞中添加70微升的于实验A中以MRS培养液培养24小时的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的菌液。此外，亦以相同方法对其他胃肠道致病菌进行分析，包括空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni CMU20)、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp.)、志贺氏杆菌(Shigella flexneri)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)及白色念珠球菌(Candida albicans)。重复分析每个样品三次，再将培养基置于一细菌培养箱中，并于16至18小时后测量抑菌圈直径。于此，以Lactobacillus rhamnosus GG的发酵液作为正对照组，以pH6.3的MRS培养液作为负控制组(negative control)。

结果如表2所示。

表2

“-“表示无抑菌现象。

表2结果显示，相较于Lactobacillus rhamnosus GG，本发明的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995具有更优异的抑制致病菌生长的功效，故其可用于预防及治疗由病原菌所引起的疾病，例如用于保护胃肠道免受病原菌的感染。

[实施例3]抑制病原菌感染及附着试验

将1毫升的密度为5×10⁴个细胞/毫升的Caco-2细胞、AGS细胞及Hela细胞分别培养于一24孔细胞培养盘中，并置于一37℃、含有5体积％二氧化碳/95体积％空气的细胞培养箱中培养2天，再进行以下二种模式的试验。

实验E、预防保护模式

取100微升的于实验A中经培养24小时的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的发酵液，加入至已培养2天的Caco-2细胞、AGS细胞或Hela细胞中，混合均匀后，将细胞放入细胞培养箱中培养0.5小时。接着，以无菌生理食盐水清洗细胞，以移除未附着的乳酸杆菌，再添加1毫升含有1×10⁷菌落形成单位/毫升(CFU/ml)的幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori CMU83)、肠内附着性大肠杆菌(enteroadherent aggregative E.coli，EAggEC)或沙门氏菌(Salmonella enteritidis)至细胞中，混合均匀后，将细胞放入细胞培养箱中培养1小时，使致病菌感染细胞。然后，移除培养基，以无菌生理食盐水清洗细胞，以去除未感染细胞的致病菌，再加入1毫升的0.1体积％Triton-X-100(Sigma，Louis，密苏里州，美国)，使细胞破裂而释放出感染的致病菌。最后，吸取细胞破碎液并置于9毫升的磷酸盐缓冲溶液中，经适当稀释后，以倾注平板计数法计算菌数。于此，以不加乳酸杆菌者为控制组，将计算结果带入下列公式，计算胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的感染抑制率。结果如表3所示。

感染抑制率＝(控制组的致病菌数-添加乳酸杆菌组的致病菌数)/控制组的致病菌数×100％

实验F、治疗排除模式

培养Caco-2细胞、AGS细胞或Hela细胞2天后，分别添加1毫升的含有1×10⁷菌落形成单位/毫升的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pyloriCMU83)、肠内附着性大肠杆菌(enteroadherent aggregative E.coli，EAggEC)或沙门氏菌(Salmonella enteritidis)至细胞中，培养0.5小时使致病菌感染细胞。接着，以无菌生理食盐水清洗细胞，以去除未侵入细胞的致病菌，再加入100微升的于实验A中经培养24小时的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的发酵液，培养1小时，使乳酸杆菌进行排除致病菌的作用。最后，再以无菌生理食盐水清洗细胞，以移除未附着的乳酸杆菌与经排除的致病菌，再加入1毫升0.1体积％Triton-X-100，使细胞破裂而释放出感染的致病菌。细胞破碎液经适当稀释后，以倾注平板计数法计算菌数。于此，以不加乳酸杆菌者为控制组，将计算结果带入上述公式，计算乳酸杆菌的感染抑制率。结果如表4所示。

表3、预防保护模式的感染抑制率(％)

	Caco-2	AGS	Hela
				Helicobacter pylori CMU83	21.74	20.53	ND
EAggEC	86.35	ND	87.50
				Salmonella enteritidis	85.10	ND	78.24

“ND”表示未进行该细胞的测试。

表4、治疗排除模式的感染抑制率(％)

	Caco-2	AGS	Hela
				Helicobacter pylori CMU83	32.02	30.80	ND
EAggEC	99.21	ND	96.61
				Salmonella enteritidis	99.05	ND	98.87

“ND”表示未进行该细胞的测试。

由表3及表4结果可知，胚芽乳酸杆菌菌株CMU995具有优异的抑制致病菌感染的效果，尤其治疗排除模式的实验结果，更显示胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可有效地降低致病菌对胃肠道及泌尿道细胞的附着作用，进而将其排出细胞外，达成抑制感染的功效。此外，胚芽乳酸杆菌菌株CMU995对于大肠杆菌或沙门氏菌亦有相当优异的抑制效果。

[实施例4]动物试验

实验G、试验动物分组

本实验使用6周大的雄性C57BL/6小鼠(购自乐斯科公司，台湾)，体重为20至26公克，饲养于一独立IVC小鼠饲育系统，室温维持于22℃，并定时12小时光照与黑暗。喂食小鼠经过灭菌的饲料及逆渗透水，供小鼠自由取食，饲养2周使小鼠适应环境后才开始进行实验。随机将小鼠分为4组，每组皆8只。于进行幽门螺旋杆菌感染前，各组小鼠于每日固定时间经口投喂食200微升不同浓度的新鲜制备的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的菌液，连续7日，每日喂食一次。各组实验情形如下：

A组：生理食盐水(saline)组/负控制组(negative control)。喂食小鼠经无菌过滤的生理食盐水。

B组：1×10¹⁰菌落形成单位/毫升的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995组。以MRS培养液培养胚芽乳酸杆菌菌株CMU995达24小时后，离心菌液，再以生理食盐水回溶，并调整细菌浓度至1×10¹⁰菌落形成单位/毫升，并将其喂食小鼠。

C组：1×10⁹菌落形成单位/毫升的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995组。以MRS培养液培养胚芽乳酸杆菌菌株CMU995达24小时后，离心菌液，再以生理食盐水回溶，并调整浓度至1×10⁹菌落形成单位/毫升，并将其喂食小鼠。

D组：1×10⁸菌落形成单位/毫升的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995组。以MRS培养液培养胚芽乳酸杆菌菌株CMU995达24小时后，离心菌液，再以生理食盐水回溶，并调整浓度至1×10⁸菌落形成单位/毫升，并将其喂食小鼠。

实验H、幽门螺旋杆菌感染试验

喂食小鼠乳酸杆菌菌株CMU995的菌液达7日后，于隔日经口喂食2×10⁷菌落形成单位的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori CMU83)菌液，连续喂食3日使小鼠感染，再于次日使小鼠禁食1日后，以二氧化碳及颈椎分离术牺牲小鼠。摘取小鼠的胃及十二指肠段(约0.5克)，将其放入含有9.5毫升无菌磷酸盐缓冲溶液的离心管中，以均质机搅拌3分钟后，取出1毫升组织破碎液，再以无菌磷酸盐缓冲溶液做10倍连续稀释，在不同稀释倍数下，分别取出100微升稀释液，以平板涂抹计数法将稀释液涂抹于Brucella洋菜培养基，并添加2.5体积％胎小牛血清及用于筛选幽门螺旋杆菌的选择性辅助剂Selective Supplements SR147E(Oxoid，Hampshire，英格兰)，此培养基经测试可用于筛选本实验中所使用的幽门螺旋杆菌Helicobacter pylori CMU83。于37℃、微好氧条件下进行培养48小时后，计算菌落数。每个实验分析皆进行三次重复，以SPSS 10.0套装软件统计分析实验结果，先经单向变方分析(one wayANOVA，analysis of variance)测定各组间的显著性差异，判断标准为p＜0.05。

分析结果如表5所示。

表5

“*”：表示相较于生理食盐水组具有显著性差异(P＜0.05)。

表5结果显示，喂食小鼠1×10⁹菌落形成单位/毫升或1×10¹⁰菌落形成单位/毫升的浓度的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995后，可明显抑制幽门螺旋杆菌于小鼠胃肠道的感染，因此可达到保护胃肠道免于病原菌感染的效果。

[实施例5]

实验I、菌株鉴定

[乳酸杆菌鉴定套组分析]

将本发明的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995以MRS培养基活化培养16小时后，使用鉴定乳酸杆菌专用的API 50CHL鉴定套组(Biomerieux，Marcy I’Etoile，法国)进行分析，以确认此菌株的种类。

[基因序列分析]

使用乳酸菌的特异性引子进行胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的16S-23S rRNA片段的聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)，并将反应产物进行序列分析。所得的聚合酶链锁反应产物进行序列分析后，部分序列的结果如SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO：1

ACATTGCAACAGCGCGTGCCGTATTTTAATTATCGGCTAGCCACAG

AGATCTATCCGTTAAACAAACAATTTACTGAGAAATACGGGAATAA

GTATGGGAAATATCCCTAGCGAACCCTAAATAATGGCCCCCCTGTC

TTGAACAGATAGACTGGCCAAACTCCTACGGGAGAAAACGTTGGG

AAATTTTGCTCAATGGGCCCAACCCTGAGGCGCCCCTGCCACATAT

ATGAGGAAAGCCTTCGGGTTATAAAATTTTTTTTCAGCGAGGAGTG

AAGTGAGGATAAGAACCTTCTACA

本分析所使用的引子序列为LU-5及Lac-2，序列如下所示：

LU-5：5’-CTAGCGGGTGCGACTTTGTT-3’SEQ ID NO：2

Lac-2：5’-CCTCTTCGCTCGCCGCTACT-3’SEQ ID NO：3

[脉冲电场胶体电泳分析]

利用脉冲电场胶体电泳法(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分析胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的基因组DNA(genomic DNA)，使用的限制酶(restriction enzyme)为SgsI(Promega Corporation，Madison，美国)，借此获得胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的基因指纹图谱，结果如图1所示。图1的基因指纹图谱仅提供作为基因指纹辨识胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的参考，而非用于限制该菌株的基因鉴定。

根据API50CHL鉴定套组的鉴定结果，显示胚芽乳酸杆菌菌株CMU995属于Lactobacillus plantarum。聚合酶链锁反应的基因片段产物的基因序列比对结果，进一步证实此菌株为新颖的Lactobacillus plantarum菌株。

胚芽乳酸杆菌菌株CMU995经寄存于德国国家菌种保藏中心(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)，寄存编号为DSM23780。

以上实施例显示，胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可拮抗病原菌对胃肠道及泌尿道的附着，以保护胃肠道细胞而降低病原菌感染，亦可直接地抑制病原菌的生长，经由此二种抑菌机制的加乘作用来保护胃肠道及泌尿道。

上述实施例仅用以例示说明本发明及其功效，而非用于限制本发明。任何熟于此项技艺的人士均可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下，对上述实施例进行修改及变化。因此，本发明的权利保护范围应以权利要求书为准。

Claims

1.一种经分离的胚芽乳酸杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)CMU995，其寄存于德国国家菌种保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures，DSMZ)，寄存编号为DSM 23780。

2.如权利要求1的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其特征在于，所述胚芽乳酸杆菌菌株CMU995具有胃肠道及/或泌尿道附着性。

3.如权利要求1的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其特征在于，所述胚芽乳酸杆菌菌株CMU995具有抑制病原菌生长的功效。

4.如权利要求1的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其特征在于，所述胚芽乳酸杆菌菌株CMU995具有抑制病原菌对胃肠道及/或泌尿道附着的功效。

5.如权利要求3或4的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其特征在于，该病原菌选自以下群组：幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、大肠杆菌属(Escherichia spp.)、金黄色葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、志贺氏杆菌(Shigella flexneri)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、白色念珠球菌(Candida albicans)或前述的组合。

6.如权利要求5的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其特征在于，该病原菌是幽门螺旋杆菌。

7.一种组合物，其特征在于，包含如权利要求1的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995。

8.如权利要求7的组合物，其特征在于，所述组合物用于抑制病原菌、保护胃肠道、保护泌尿道或前述的组合。

9.如权利要求8的组合物，其特征在于，该病原菌选自以下群组：幽门螺旋杆菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌属、大肠杆菌属、金黄色葡萄球菌属、志贺氏杆菌、产气荚膜梭菌、白色念珠球菌或前述的组合。

10.如权利要求7的组合物，其特征在于，所述组合物选自以下群组的形式：医药组合物、饲料、营养补充品、或食品。

11.如权利要求10的组合物，其特征在于，所述组合物是饮料。

12.如权利要求10的组合物，其特征在于，所述组合物是乳制品。

13.如权利要求10的组合物，其特征在于，所述组合物是保健食品。

14.如权利要求7的组合物，其特征在于，所述组合物选自以下群组的形式：喷剂或塞剂。

15.一种如权利要求1的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995用于制造抑制病原菌、保护胃肠道、及/或保护泌尿道的药物的用途。

16.如权利要求15的用途，其特征在于，该病原菌选自以下群组：幽门螺旋杆菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌属、大肠杆菌属、金黄色葡萄球菌属、志贺氏杆菌、产气荚膜梭菌、白色念珠球菌或前述的组合。